Name: Kanser-Bağışıklık Döngüsünü Çoğaltmak için İn Vitro Sistemlerde Ko-Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Öğrenin, kanser-bağışıklık döngüsünün her adımını izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir in vitro ko-kültür protokolü. Bu yöntem, akış sitometrisi ve tümör-çip modelleri kullanarak kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

A.S., AIRC (IG #28807) ve PRIN (#P2022YE2MX) tarafından desteklenmektedir. M.M., AIRC-FIRC bursu (#25558) tarafından desteklenmektedir. ADN, AB - Yeni Nesil AB, PNRR Misyon 4 Bileşen 2, Yatırım 1.5 tarafından finanse edilen İnovasyon Ekosistemi Roma Technopole tarafından desteklenmektedir ECS00000024.

Kanser-Bağışıklık Döngüsünün Akış Sitometrisi Tabanlı İzlenmesi 

<ol><li>Chen, D. S., Mellman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncology+meets+immunology%3A+the+cancer-immunity+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle.</a> Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).</li>
<li>Mellman, I., Chen, D. S., Powles, T., Turley, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cancer-immunity+cycle%3A+Indication%2C+genotype%2C+and+immunotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The cancer-immunity cycle: Indication, genotype, and immunotype.</a> Immunity. 56 (10), 2188-2205 (2023).</li>
<li>Galassi, C., Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+privilege+of+cancer+stem+cells%3A+A+key+to+understanding+tumor+immune+escape+and+therapy+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The immune privilege of cancer stem cells: A key to understanding tumor immune escape and therapy failure.</a> Cells. 10 (9), 2361(2021).</li>
<li>Dunn, G. P., Old, L. J., Schreiber, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+three+Es+of+cancer+immunoediting%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The three Es of cancer immunoediting.</a> Annu Rev Immunol. 22, 329-360 (2004).</li>
<li>Musella, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+promote+cancer+cell+stemness+by+triggering+the+epigenetic+regulator+KDM1B%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs promote cancer cell stemness by triggering the epigenetic regulator KDM1B.</a> Nat Immun. 23 (9), 1379-1392 (2022).</li>
<li>Anderson, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+immune+resistance+archetypes+in+solid+cancer+to+inform+next-generation+anticancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Leveraging immune resistance archetypes in solid cancer to inform next-generation anticancer therapies.</a> J Immunother Cancer. 11 (6), e006533(2023).</li>
<li>Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A., Ribas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary%2C+adaptive%2C+and+acquired+resistance+to+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Primary, adaptive, and acquired resistance to cancer immunotherapy.</a> Cell. 168 (4), 707-723 (2017).</li>
<li>Musella, M., Manduca, N., Maccafeo, E., Ruggiero, E., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+evaluation+of+cancer+cell+immunogenicity+and+antigen-specific+T-cell+cytotoxicity+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro evaluation of cancer cell immunogenicity and antigen-specific T-cell cytotoxicity by flow cytometry.</a> Methods Mol Biol. 2748, 13-28 (2024).</li>
<li>Bonilla, D. L., Reinin, G., Chua, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+spectrum+flow+cytometry+as+a+powerful+technology+for+cancer+immunotherapy+research%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Full spectrum flow cytometry as a powerful technology for cancer immunotherapy research.</a> Front Mol Biosci. 7, 612801(2020).</li>
<li>Danova, M., Torchio, M., Comolli, G., Sbrana, A., Antonuzzo, A., Mazzini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+automated+cytometry+in+the+new+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The role of automated cytometry in the new era of cancer immunotherapy.</a> Mol Clin Oncol. 9 (4), 355-361 (2018).</li>
<li>Laskowski, T. J., Hazen, A. L., Collazo, R. S., Haviland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rigor+and+reproducibility+of+cytometry+practices+for+immuno-oncology%3A+A+multifaceted+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Rigor and reproducibility of cytometry practices for immuno-oncology: A multifaceted challenge.</a> Cytometry A. 97 (2), 116-125 (2020).</li>
<li>Manduca, N., Maccafeo, E., De Maria, R., Sistigu, A., Musella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cancer+models%3A+One+step+closer+to+in+vitro+human+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">3D cancer models: One step closer to in vitro human studies.</a> Front Immunol. 14, 1175503(2023).</li>
<li>De Ninno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+co-culture+models+for+dissecting+the+immune+response+in+in+vitro+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic co-culture models for dissecting the immune response in in vitro tumor microenvironments.</a> JoVE. (170), e61895(2021).</li>
<li>Mattei, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncoimmunology+meets+organs-on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Oncoimmunology meets organs-on-chip.</a> Front Mol Biosci. 8, 627454(2021).</li>
<li>Businaro, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross+talk+between+cancer+and+immune+cells%3A+exploring+complex+dynamics+in+a+microfluidic+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment.</a> Lab Chip. 13 (2), 229-239 (2013).</li>
<li>Vacchelli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+antitumor+immunity+requires+formyl+peptide+receptor+1%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1.</a> Science. 350 (6263), 972-978 (2015).</li>
<li>Maulana, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocompetent+cancer-on-chip+models+to+assess+immuno-oncology+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Immunocompetent cancer-on-chip models to assess immuno-oncology therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 173, 281-305 (2021).</li>
<li>Lorenzi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFNs+control+antigen+retention+and+survival+of+CD8%CE%B1%28%2B%29+dendritic+cells+after+uptake+of+tumor+apoptotic+cells+leading+to+cross-priming%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immun%22%5BJournal%5D)">Type I IFNs control antigen retention and survival of CD8α(+) dendritic cells after uptake of tumor apoptotic cells leading to cross-priming.</a> J Immun. 186 (9), 5142-5150 (2011).</li>
<li>Musella, M., Manic, G., Galassi, C., Vitale, I., Sistigu, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytofluorometric+assessment+of+dendritic+cell-mediated+uptake+of+cancer+cell+apoptotic+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Cytofluorometric assessment of dendritic cell-mediated uptake of cancer cell apoptotic bodies.</a> Methods Enzymol. 632, 39-54 (2020).</li>
<li>Lucarini, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+Type+I+Interferons+and+5-Aza-2%27-Deoxycitidine+to+improve+antitumor+response+against+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to improve antitumor response against melanoma.</a> J Invest Dermatol. 137 (1), 159-169 (2017).</li>
<li>Gutiérrez-Martínez, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+of+cell-associated+antigens+by+MHC+Class+I+in+dendritic+cell+subsets%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation of cell-associated antigens by MHC Class I in dendritic cell subsets.</a> Front Immunol. 6, 363(2015).</li>
<li>Joffre, O. P., Segura, E., Savina, A., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-presentation+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cross-presentation by dendritic cells.</a> Nat Rev Immunol. 12 (8), 557-569 (2012).</li>
<li>Hegde, P. S., Karanikas, V., Evers, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+where%2C+the+when%2C+and+the+how+of+immune+monitoring+for+cancer+immunotherapies+in+the+era+of+checkpoint+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The where, the when, and the how of immune monitoring for cancer immunotherapies in the era of checkpoint inhibition.</a> Clin Cancer Res. 22 (8), 1865-1874 (2016).</li>
<li>Lee, R. Y., Ng, C. W., Rajapakse, M. P., Ang, N., Yeong, J. P. S., Lau, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+and+challenge+of+spatial+omics+in+dissecting+tumour+microenvironment+and+the+role+of+AI%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">The promise and challenge of spatial omics in dissecting tumour microenvironment and the role of AI.</a> Front Oncol. 13, 1172314(2023).</li>
<li>Lewis, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics+and+multiplexed+imaging+to+explore+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Spatial omics and multiplexed imaging to explore cancer biology.</a> Nat Methods. 18 (9), 997-1012 (2021).</li>
<li>Wu, Y., Cheng, Y., Wang, X., Fan, J., Gao, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+omics%3A+Navigating+to+the+golden+era+of+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Spatial omics: Navigating to the golden era of cancer research.</a> Clin Transl Med. 12 (1), 696(2022).</li>
<li>Vandereyken, K., Sifrim, A., Thienpont, B., Voet, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+applications+for+single-cell+and+spatial+multi-omics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Methods and applications for single-cell and spatial multi-omics.</a> Nat Rev Genet. 24 (8), 494-515 (2023).</li>
<li>Cheung, M., Campbell, J. J., Whitby, L., Thomas, R. J., Braybrook, J., Petzing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+flow+cytometry+automated+data+analysis+software%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Current trends in flow cytometry automated data analysis software.</a> Cytometry A. 99 (10), 1007-1021 (2021).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillère, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nat Rev Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
</ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Antikanser immün yanıtının izlenmesi, TME'de rol oynayan ve üstünlük için sürekli bir savaşı destekleyen karmaşık moleküler ve hücresel etkileşimleri aydınlatmak ve anlamak için son derece önemlidir23. Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımların izlenmesi ve karakterizasyonu için basit bir mFC ve ToC destekli protokolü detaylandırıyoruz. Küçük varyasyonlarla, murin hücre hatlarına ve fare kaynaklı bağışıklık hücrelerine dayanan bu protokol, hem insan ölümsüzleştirilmiş hem de hatta birincil kanser hatlarına ve insan periferik kandan türetilmiş bağışıklık hücrelerine uyarlanabilir. Ayrıca, spesifik yolakların genetik veya farmakolojik inhibisyonunu ve bunların kognat-uygun kontrollerini birleştiren bu protokol, immünosürveyansı düzenleyen biyobelirteçlerin tanımlanmasına ve dolayısıyla immünojenik ve immün tedavilere yanıt verilmesine izin verir.
mFC, çeşitli bağışıklık parametrelerinin yüksek verimli analizine olanak tanır ve kısa sürede milyonlarca hücreyi analiz etme yeteneğini nadir olayları tanımlama, hücre çoğalmasını ve hücre ölümünü değerlendirme, küçük hacimli numunelerde aynı anda birden fazla parametreyi tespit etme olanağıyla birleştirir ve floresan bazlıhücre sınıflandırma sonrası aşağı akış moleküler ve fonksiyonel analizlerin gerçekleştirilmesine olanak tanır 9. Bu özellikler, düşük maliyetle birlikte, mFC erişilebilirliğini ve araştırma ve klinik laboratuvarlarda geniş kullanımı tercih etmiştir. Bununla birlikte, bazı önemli sınırlamalar devam etmektedir. İlk olarak, mFC analizi, numune hazırlama sırasında tek hücreli süspansiyonlar elde etmek için doku ayrışmasını gerektirir, böylece tümör dokusunun uzamsal bilgisini yok eder. Son on yılda, yüksek katlı uzamsal transkriptomik, proteomik ve epigenomik dahil olmak üzere uzamsal teknolojilerin ortaya çıkışı, kanser, bağışıklık ve stromal hücrelerin konumunu ve bunların karşılıklı etkileşimlerini analiz ederek TME'nin profilini çıkarma yeteneğimizi genişletti24. İkincisi, mFC aynı anda on altıya (veya daha fazla) parametrenin saptanmasına izin verir ve bu nedenle tek bir numunedeki tüm hücre tanımlama, olgunlaşma ve aktivasyon durumu belirteçlerini kapsamaz. Yine, yukarıdaki en son teknolojiler,25,26,27'den önce bile, tek hücreli ve hatta hücre altı çözünürlükte aynı anda yüze kadar parametrenin algılanmasına izin verir. Üçüncüsü, boylamsal ve karşılaştırmalı çalışmaların bağışıklık izlemesi, tekrarlanabilir protokoller ve veri toplama ve analizi de dahil olmak üzere iş akışının her adımının standardizasyonunu gerektirir. Geleneksel manuel geçit öznel olabilir ve cihaz bakımı ve kalite kontrolleri değişebilir, bu da veri madenciliğini ve yorumlamasını etkiler. Veri analizi uygulayan otomatik toplama ve eklentiler, veri değişkenliğini en aza indirmeye yardımcı olur28.
ToC'ler, TME'nin çeşitli ayırt edici özelliklerini yakından kopyalama ve en azından bazı deneysel ortamlarda in vivo tümörlerin yerini alma yetenekleri nedeniyle kanser araştırmalarında büyük ilgi görmektedir12. Tümör dokusu mimarisi, çok hücreli karmaşıklık ve TME'nin hücresel bileşenleri arasındaki dinamik etkileşim için oldukça gerçekçi bir model sağlarken, İçindekiler, sistemik bağışıklık tepkilerinin karmaşıklığını, özellikle de kanser-bağışıklık döngüsünün12 adımlarının her biri için hız sınırlayıcı adımların ortaya çıkmasından sorumlu mekanizmalar dizisini yansıtma açısından hayvan çalışmalarının yerini tam olarak alamamaktadır. 29. Bu yönün ötesinde, onko-immünoloji alanı, bilimsel yeniliklerin turları ve hızı onları in vivo modellere giderek daha yakın hale getirdiğinden, ToC'lerin kullanımından yararlanmaya ve fayda sağlamaya devam edecektir12.
Sonuç olarak, burada açıklanan protokol, TME'nin dinamik karmaşıklıklarını çözmek için güçlü ve basit bir analitik ve keşif aracı olarak hizmet eder. Ayrıca, bu protokolün zaman ve maliyetle ilgili özellikleri, büyük ölçekte fizibilitesine izin verir. Önümüzdeki zorluk, kanser hastaları için tedavi kararlarını daha iyi bilgilendirmek ve yönlendirmek için klinik kullanım için standartlaştırmaktır.

Son birkaç on yılda, immünoterapi, kanser tedavisi için en son seçeneklerin ön saflarında yer almıştır. Bağışıklık sistemini antitümör amaçlarla kullanmak, tarihsel olarak kötü prognozlara sahip çeşitli hematolojik ve katı malignitelerde hasta yararı için güçlü bir kavram kanıtı sağlamıştır. İmmünoterapi, aksi takdirde tedavi edilmesi zor kanserler için bir fırsat sunduğundan, şaşırtıcı derecede hızlı bir ilerleme hızı yaşamaktadır. Bu tür bir ilerleme, en azından kısmen, kanser hücreleri ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimin rafine bir şekilde anlaşılmasına bağlanabilir. Bu etkileşim, bağışıklık sisteminin kanser-bağışıklık döngüsü olarak adlandırılan kanser hücrelerini yok etmek için ateşlediği ileri beslemeli bir "motora" benzer. Bu antikanser bağışıklık tepkisi üç ana seviyede ilerler: tanıma, işleme ve reaksiyon. İlk olarak, tanıma aşamasında, tümör oluşumu sırasında üretilen tümör antijenleri (Ag'ler), tümör mikroçevresinde ölen kanser hücreleri tarafından salınır (TME, adım 1) ve tümöre sızan dendritik hücreler tarafından yutulur (DC'ler, adım 2). Daha sonra, işleme aşamasında, DC'ler, yakalanan tümör Ag'lerinin epitoplarını majör histouyumluluk kompleksi (MHC) molekülleri aracılığıyla sunar, yüzeylerinde daha yüksek seviyelerde kostimülatör molekülleri eksprese eder (aşama 3) ve yüklerini saf CD8 T hücrelerine çapraz sunmak için tümör boşaltan lenf düğümlerine (dLN'ler) hareket eder (CD8N, adım 4). Tüm bu adımlar, tümör Ag'ye özgü çapraz astarlı CD8 T hücrelerinin (CD8C-P) aktive edildiği, efektör CD8 T (CD8E) hücrelerine olgunlaştığı ve klonal bir genişlemeye uğradığı son reaksiyon sürecinde birleşir (aşama 5). CD8E hücreleri daha sonra dLN'leri terk eder ve kan yoluyla TME'ye (adım 6) gider, burada T hücresi reseptörü (TCR) ile akraba tümörleri Ags arasındaki etkileşim yoluyla kanser hücrelerini spesifik olarak tanır ve bunlara bağlanır, sitotoksik molekülleri serbest bırakır [yani, interferon (IFN)-γ, perforinler ve granzimler (Grzs)] ve kanser hücrelerini öldürür (adım 7)1, 2. Kanser hücresinin öldürülmesi, kanser-bağışıklık döngüsünü beslemek için daha fazla tümör Ag'sinin salınmasına yol açar. Nitekim, tüm bu adımlar sayesinde, bağışıklık sistemi kanser hücrelerini tahmin edilenden çok daha sık yok eder ve reddeder. Ancak kanser hastalarında bu adımlardan en az biri düzgün çalışmaz. Biz ve diğerleri, kanser hücrelerinin ya daha agresif ve bağışıklık ayrıcalıklı varyantlara evrimleşerek ya da T hücresi etkinliğiniengelleyerek bağışıklık tepkisini durdurmaya çalıştığınıgösterdik 3,4,5 ya da T hücresi etkinliğini 6,7 engelleyerek.
Kanser araştırmaları ve kanser ilacı geliştirme, onko-immünoloji olarak adlandırılan kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki ilişkinin incelenmesine izin veren deneysel modellere dayanır. Burada, onko-immünoloji döngüsünün her adımını kapsamlı bir şekilde yeniden üreten ve immünosürveyans ve nihayetinde immüno-düzenlemenin fenotipik ve fonksiyonel özellik setlerinin hızlı ve net bir görünümü sunulan hızlı, güvenilir, tekrarlanabilir ve düşük maliyetli in vitro modeller açıklanmaktadır.
Multiparametrik akış sitometrisi (mFC), kanser klinik çalışmalarında temel kanser araştırmaları, teşhisi ve translasyonel araştırmalarda en başarılı tek hücreli analitik araçlardan biridir. Her hücrede aynı anda daha fazla özellik yakalamaya izin verdiği için mFC, onko-immünolojide altın standart bir analiz platformu olarak yerini almıştır. Yüksek hassasiyet ve özgüllüğü, TME 8,9,10'dan olduğu gibi, heterojen ve hatta heterotipik hücre süspansiyonlarından tek bir hücre düzeyinde çoklu protein ekspresyon paternlerini ve fonksiyonel özellikleri hızlı ve tekrarlanabilir bir şekilde ölçme olasılığı ile birleştirir. Hem fenotipik hem de fonksiyonel ifade kalıpları zamana duyarlı olduğundan, deney tasarımına, uygun panellerin, kontrollerin ve titre edilmiş antikorların seçimine ve uygun numune işleme ve enstrümantasyon kullanımına dikkat edilmesi, sonuçların güvenilirliği, karşılaştırılabilirliği ve tekrarlanabilirliği için kritik öneme sahiptir ve deney sonucunu güvenle yorumlamak için kritik öneme sahiptir11.
Çip üzerinde tümör mikroakışkan cihazlar (ToC'ler), kanser ve bağışıklık hücresi dinamiklerinin in vitro mikro ölçekli biyomimetiklerine ve etkileşimlerine izin vererek TME'yi modeller 12,13,14,15. Spesifik olarak, ToC'ler, iki boyutlu (2D) veya üç boyutlu (3D) kültür ayarlarında organize edilmiş çeşitli hücre tiplerini barındırabilen ve yüksek doğrulukla modelleme yapabilen ve yüksek hassasiyetle kontrol edebilen çok kanallı mikroakışkan hücre kültürü cihazlarıdır, heterotipik hücresel etkileşimler ve TME12'de fizyolojik olarak meydana gelen kimyasal gradyan akışları gibi temel yapısal ve fonksiyonel birimleri, 13,14,15. Özellikle, immün kemocazibe ve yörüngelerin yanı sıra kanser hücreleri ile immün hücre etkileşimi, gerçek zamanlı olarak izlenebilir ve hızlandırılmış mikroskopi ve otomatik izleme analiziile ölçülebilir 5,12,13,14,15,16. Ayrıca, İçindekiler, kanserin başlangıcını ve ilerlemesini ve tedaviye yanıtı düzenleyen önemli süreçleri hem analiz etme hem de manipüle etme imkanı sunar17.
Bu makalede, kanser Ag'lerinin DC aracılı fagositozu (aşama 1-3), T hücresi çapraz hazırlama (adım 4), aktivasyon ve klonal genişleme (sonuncusu 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ve Cu (I) katalizli siklo ekleme [tıklama] teknolojisi, son derece hassas ve doğru bir metodoloji aracılığıyla, adım 5), TME'ye CD8E hücresi homing (adım 6) ve son olarak CD8E hücresi aracılı kanser hücresi öldürme (adım 7, Şekil 1).
Bu çalışma, kanser-bağışıklık döngüsünü incelemek için basit, hızlı ve güvenilir standart protokoller oluşturma çabasına katkıda bulunur. mFC ve ToC modellerinin kanser araştırmalarına, TME dinamiklerine ve tedaviye yanıta iyileştirilmesi ve entegrasyonu, bu modeller deneysel kontrol ile birlikte biyolojik doğruluk sağladığı için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu nedenle, bu protokol, bireysel hücre oyuncularının rollerini ve doğal ve edinilmiş immünosürveyans üzerindeki karşılıklı etkileşimlerini karakterize etmeyi, izlemeyi ve zamanında manevra yapmayı mümkün kılarak kanser-bağışıklık döngüsünün aşamalı bir şekilde yeniden oluşturulmasına yardımcı olur. Bu, sonuçta, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlarken, hayvan çalışmalarının rafine edilmesine, azaltılmasına ve değiştirilmesine yardımcı olacaktır. Son olarak, mFC ve ToC avantajları ve sınırlamaları eleştirel bir şekilde tartışılır ve onko-immünoloji araştırmalarını ve tedavisini ilerletmek için en son teknolojilerle (örneğin, tek hücreli ve hatta hücre altı çözünürlükte yüksek plex uzamsal analizler) karşılaştırılır.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrotüpler ve nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>100 kV e-beam litografi</td><td>Vistec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petri kapları&nbsp;</td><td>Greiner Bio One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plakalar</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET3012</td><td></td></tr><tr><td>15 ve 50 mL tüpler</td><td>Corning&nbsp;</td><td>352096; 352070</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; M hücre süzgeci&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431750</tr><tr><td>5 mL polistiren tüpler&nbsp;</td><td>Greiner Bio-Bir</td><td>120180</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M hücre süzgeci&nbsp;</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>CLS431751</tr><tr><td>75 cm2 hücre kültürü ile muamele edilmiş şişe</td><td>Euroclone</td><td>&nbsp; ET7076</td><td></td></tr><tr><td>Adsorban mendiller</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Allumin folyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD107a (LAMP-1) Antikor</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-111-319</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD25 (7D4) Antikor&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-678</td><td></td></tr><tr><td>anti-fare CD3 (17A2) Antikor</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td></td></tr><tr><td>Aptes</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440140</td><td></td></tr><tr>BD GolgiPlug <td>BD Biosciences</td> ile<td>Sitofiks / Cytoperm Plus Fiksasyon / Geçirgenleştirme Çözüm Kiti</td><td>555028</td><td></td></tr><tr><td>BD GolgiPlug Protein Taşıma İnhibitörü (Brefeldin A İçeren)</td> <td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>555029</tr><tr><td>BD GolgiStop Protein Taşıma İnhibitörü (Monensin İçeren)</td><td>BD Biosciences</td><td>554724</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>US Biological, Salem</td><td>A1312</td><td></td></tr><tr><td>CD11c Monoklonal Antikor (N418)</td><td>eBioscience</td><td>12-0114-81</td><td></td></tr><tr><td>CD137 (4-1BB) Monoklonal Antikor (17B5)</td><td>eBioscience</td><td>17-1371-82</td><td></td></tr><tr><td>CD3 Monoklonal Antikor (17A2)</td><td>eBioscience</td><td>25-0032-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 Monoklonal Antikor (IM7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0441-82</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Monoklonal Antikor (30-F11)</td><td>İnvitrojen</td><td>MCD4528</td><td></td></tr><tr><td>CD69 Monoklonal Antikor (H1.2F3)</td><td>eBioscience</td><td>48-0691-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a Monoklonal Antikor (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>11-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD8a Monoklonal Antikor (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>17-0081-82</td><td></td></tr><tr><td>CD95 (APO-1/FAS) Monoklonal Antikor (15A7)</td><td>eBioscience</td><td>53-0951-82</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sayma slaytları</td><td>Kova International</td><td>87144E</td><td></td></tr><tr><td>Krom kuvars maskeleri</td><td>MB W & A, Almanya</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Akış Sitometrisi Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>C10635</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Akış Sitometresi</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ölü Hücre Temizleme Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Salin (D-PBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECB4053L</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu (FBS)</td><td>EuroClone</td><td>ECS0180L</td><td></td></tr><tr><td>Flowjo v10.0.7</td><td>Flowjo, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Granzyme B Monoklonal Antikor (NGZB)</td><td>eBioscience</td><td>12-8898-82</td><td></td></tr><tr><td>H2O2Sigma</td> <td>Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ocak gözü</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hümiklenmiş hücre kültürü inkübatörü (37&�;, %5 CO2)</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz makinesi</td><td>Brema Buz Makineleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IFN gama Monoklonal Antikor (XMG1.2)</td><td>eBioscience</td><td>11-7311-82</td><td></td></tr><tr><td>Illustrator CC 2015</td><td>Adobe Sistemleri A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td><td></td>Enstitüsü</tr><tr><td>Incucyte 2022A Yazılımı</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incucyte Ölü Hücreleri Saymak İçin Sitotoks Boyası</td><td>Sartorius</td><td>4632</td><td></td></tr><tr><td>Incucyte SX5 Canlı Hücre Analiz Sistemi&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JuLi Akıllı Floresan Canlı Hücre Görüntüleme Mikroskobu</td><td>Bulldog Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar tezgahı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar buzdolabı (4 & derece; C)</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Laboratuvar Güvenlik Kabini (Sınıf II)</td> <td>Angelantoni</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin 200 mM</td><td>EuroClone</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Aqua Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L34957</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Yakın IR Ölü Hücre Leke Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>L10119</td><td></td></tr><tr><td>MACS sütunları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201; 130-042-401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MACS separatörler</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-10; 130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MCA205 fare fibrosarkom hücre hattı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SCC173</td><td></td></tr><tr><td>Sınıf II güvenlik kabini</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Mikrosantrifüj</td><td>ile</td> donatılmış mikrobiyolojik olarak kontrol edilen hayvan tesisi Thermo Scientific <td>75002552</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel&nbsp;</td><td>Microsoft, Redmond&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fare: C57BL/6J</td><td>Jackson Laboratuvarı</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Naive CD8a+ T Hücre İzolasyon Kiti, fare</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-543</td><td></td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ts2</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elemanları BR 5.30.0064-BIT</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optik litografi</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G sodyum tuzu ve streptomisin sülfat</td><td>EuroClone</td><td>ECB3001D/1</td><td></td></tr><tr><td>Pipet yardımı</td><td>Drummond Scientific Co., Broomall, PA</td><td>&nbsp; 4-000-201</td><td></td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PKH67 Floresan Hücre Bağlayıcı Kitleri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PKH67GL-1KT</td><td>floresan hücre bağlayıcı ve kit</td></tr><tr><td>plastik lamel</td><td>IBIDI</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum İyodür</td><td>Termo Bilimsel</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Reaktif İyon Aşındırma sistemi</td><td>Oxford plazma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Enstitüsü 1640 (RPMI 1640)</td><td>EuroClone</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetler (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)</td> <td>Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO</td><td>CLS4486; CLS4487; CLS4488; </td><td></td>CLS4489</tr><tr><td>SL 16 Santrifüj Serisi</td><td>Thermo Scientific</td><td>75004031</td><td></td></tr><tr><td>Steril neşterler, cerrahi forsepsler, makaslar ve pense</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Steril uçlar (1&ndash; 10 & mu; L, 20&ndash; 200 &mu; L, 1000 &mu; L)</td> <td>EuroClone Spa, Milano, İtalya</td><td>ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; </td><td></td>ECTD01005</tr><tr><td>SU-8 3000 serisi</td><td>MicroChem corp, Newton, (MA)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Dermal biyopsi yumrukları takımı</td><td>Kai Medical, Tedpella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dowsil, Dow Corning</td><td>101697</td><td></td></tr><tr><td>TCR beta Monoklonal Antikor (H57-597)</td> <td>eBioscience</td><td>12-5961-82</td><td></td></tr><tr><td>Termostatik banyo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zamanlayıcı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TMCS&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>92360</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavi Leke (% 0.4)</td> <td>Termo Bilimsel</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA, Fenol Kırmızısı</td><td>EuroClone</td><td>ECM0920</td><td></td></tr><tr><td>Vakumlu dessikatörlü</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kanser-bağışıklık döngüsünü Çoğaltmak için İn vitro sistemlerde ko-kültür

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

Temel kanser araştırmaları ve etkili karşı saldırı tedavilerinin geliştirilmesi, kanser-bağışıklık döngüsü olarak adlandırılan kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri detaylandıran deneysel çalışmalara dayanmaktadır. Multiparametrik akış sitometrisi (mFC) ve çip üzerinde tümör mikroakışkan cihazları (ToC'ler) ile birleştirilmiş in vitro ko-kültür sistemleri, kanser-bağışıklık döngüsünün her adımının basit, hızlı ve güvenilir bir şekilde izlenmesini ve karakterizasyonunu sağlar ve kanser immünosürveyansı ile immünoevazyon arasındaki dengeyi bozmaktan sorumlu mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. Kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki dinamik etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek için kritik bilgiler sağlar ve hastalarda terapötik kişiselleştirme ve optimizasyonun hızını hızlandırır. Spesifik olarak, burada, murin kanseri hücre dizilerinde ve fareden türetilen bağışıklık hücrelerinde kanser-bağışıklık döngüsünün her adımının dinamik karmaşıklıklarını çözmek ve immünosürveyansa odaklanmak için basit bir mFC ve ToC destekli protokolü detaylandırıyoruz. Bu protokolün zaman ve maliyetle ilgili özellikleri göz önüne alındığında, kesinlikle büyük ölçekte uygulanabilir. Ayrıca, küçük varyasyonlarla, bu protokol hem insan kanser hücre hatlarına hem de insan periferik kan kaynaklı bağışıklık hücrelerine uyarlanabilir ve bağışıklık yanıtının biyobelirteçlerini tanımlamak için spesifik yolların genetik ve / veya farmakolojik inhibisyonu ile birleştirilebilir.

Çapraz sunum21,22 için özelleşmiş ve Şekil 2A'da gösterildiği gibi kapılı, yaygın olarak bilinen fagosit alt kümesi olan CD11c+ DC'lerin, daha önce PKH67 floresan hücre bağlayıcısı ile etiketlenmiş UV ışınlanmış MCA205 kanser hücrelerinden apoptotik cisimleri yutma yeteneği mFC tarafından değerlendirildi. Beklendiği gibi, CD11c + DC'ler, apoptotik MCA205 hücrelerini in vitro olarak 37 ° C'de verimli bir şekilde yakaladı, ancak 4 ° C'de değil (Şekil 2B, kanser-bağışıklık döngüsünün 1-3 adımları). Tümör Ag alımından sonra DC olgunlaşmasını daha fazla karakterize etmek için, kostimülatör ve immün kontrol noktası ligand moleküllerinin yüzey ekspresyonu kontrol edildi ve DC'lerin fagositoz öncesi ve sonrası (sırasıyla DCN ve DCPHAGO) karşılaştırıldı. DCPHAGO hücreleri, azalmış PDL1 seviyeleri ile birlikte önemli ölçüde artmış CD86 ve MHC-II seviyeleri gösterdi (Şekil 2C, kanser-bağışıklık döngüsünün 4. adımı). Ayrıca, bir kez DCPHAGO (CD8C-P) ile çapraz astarlanmış CD8 T hücrelerinin klonal genişlemesi, EdU timidin analoğunun dahil edilmesinin değerlendirilmesiyle değerlendirildi (kanser-bağışıklık döngüsünün 5. adımı). Canlı CD3 + CD8 + T hücrelerini düzgün bir şekilde geçitleyerek (Şekil 3A), CD95 molekülünü eksprese eden klonları temsil eden ve tümör Ag'ye özgü TCR'leri taşıyan CD8C-P'nin ~% 20'sinin (Ek Şekil 1), naif CD8 T hücrelerine kıyasla proliferasyona uğradığı bulundu (CD8N, Şekil 3B). ToC modelleri kullanılarak (Şekil 3C), CD8C-P'nin kanser hücreleri tarafından salınan alarminler tarafından kemoçekimi algılama ve buna tepki verme yeteneği değerlendirildi, böylece tümöre özgü CD8 T hücresi TME'ye hedef gösterme (kanser-bağışıklık döngüsünün 6. adımı) yansıtıldı. Spesifik olarak, ToC'ler, bağışıklık odasından tümör odasına hareket eden yapışık olmayan bağışıklık hücreleri ile tümör odasında dinlenen yapışık kanser hücreleri arasındaki kimyasal ve fiziksel çekim ve etkileşime izin vermek ve takip etmek için kullanıldı. Ko-kültür sonrası farklı zaman noktalarında çekilen mikrofotoğraflar, CD8C-P'nin mikrokanalları geçerek kanser hücrelerine doğru ilerleyici bir göçünü gösterdi (Şekil 3C). İlgi çekici olan, yaklaşan bağışıklık hücrelerinin 24 saat, 48 saat ve 72 saatte kanser hücreleri ile kararlı ve verimli bir şekilde etkileşime girebilmesiydi (Şekil 3D). Son olarak, erken CD69 (Ek Şekil 2A) ve geç CD44, CD25 (Şekil 4A) aktivasyon belirteçlerinin yüzey ekspresyon seviyelerinin yanı sıra CD137 (Şekil 4B) ve CD107a (Ek Şekil 2B) tümör reaktivite belirteçlerinin membran ekspresyonu ile mFC aracılığıyla değerlendirilerek TME'ye ev sahipliği yapan ve kansere maruz kalan Ags (CD8E) tarafından yeniden uyarılan CD8C-P'nin yanıtı analiz edildi (kanser-bağışıklık döngüsünün 7. adımı). Ayrıca sitotoksik moleküller Grz-B (Şekil 5A) ve IFN-γ'in (Şekil 5B) hücre içi üretimini de değerlendirdik. İlginç bir şekilde, tüm bu belirteç seviyeleri aşamalı ve önemli ölçüde arttı ve 72 saatlik ko-kültürde bir ifade seçimine ulaştı, böylece geç ve etkili bir aktivasyonu yansıttı. Buna göre, aynı kökenli birlikte kültürlenmiş MCA205 hücreleri, canlı hücre analiz sistemi ve mFC analizleri ile ortaya konduğu gibi önemli seviyelerde CD8E aracılı ölüme maruz kalmıştır (Şekil 6).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig01.jpg"> Şekil 1: Kanser-bağışıklık döngüsünü incelemek için deneysel protokole genel bakış. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig02.jpg"> Şekil 2: DC aracılı kanser hücresi Ag alımı ve sunumu. (A) DC mFC analizi için geçit stratejisi. mFC edinimi ve veri analizi sırasında, numuneler FSC-A ve SSC-A'yı çizerek morfoloji için sırayla (1); (2) FSC-A ve FSC-H'yi çizerek tekiller için; ve (3) Near-IR ve SSC-A'yı çizerek uygulanabilirlik için. Canlı hücreler son olarak spesifik yüzey işaretleyici CD11c için analiz edildi. (B) CD11c + DC'lerin PKH67 etiketli, UV ışınlanmış MCA205 kanser hücrelerinden apoptotik cisimleri 37 ° C ve 4 ° C'de yutma yeteneğinin mFC analizi (kanser-bağışıklık döngüsünün 1-3. adımları). Temsili biparametrik çizimler ve CD11c+PKH67+ hücre yüzdesini gösteren bir histogram (tek bir veri noktasıyla ortalama ± s.e.m., üç üzerinden bir temsili deney gösterilir). (C) fagositoz öncesi ve sonrası DC'lerde kostimulatör ve bağışıklık kontrol noktası ligand yüzey moleküllerinin mFC analizi (sırasıyla DCN ve DCPHAGO; kanser-bağışıklık döngüsünün 4. adımı). Histogramlar, CD11c+CD86+, CD11c+MHC-II+ ve CD11c+PDL1+ hücrelerinin yüzdesini (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, n = 11 bağımsız deney) temsil eder. (B) 4 °C ile karşılaştırıldığında Welch düzeltmesi ile eşleştirilmemiş iki taraflı Öğrenci t-testi. (C) DCN ile karşılaştırıldığında eşleşmemiş iki taraflı Öğrenci t-testi. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig02large.jpg" target="_blank">rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig03.jpg"> Şekil 3: CD8 T hücresi proliferasyonu ve çapraz astarlamadan sonra kanser hücrelerine kaçakçılığı. (A) CD3 + CD8 + T hücresi analizi için geçit stratejisi. mFC edinimi ve veri analizi sırasında, numuneler FSC-A ve SSC-A'yı çizerek morfoloji için sırayla (1); (2) FSC-A ve FSC-H'yi çizerek tekiller için; ve (3) Aqua ve SSC-A'yı çizerek yaşayabilirlik için. Canlı hücreler son olarak spesifik proliferasyon EdU boyaması için analiz edildi. (B) EdU teknolojisi ile CD8 T hücrelerinin klonal genişlemesinin mFC analizi (kanser-bağışıklık döngüsünün 5. adımı). Monoparametrik histogramlar, çoğalan EdU + naif ve çapraz asetli CD8 T hücrelerinin (sırasıyla CD8N ve CD8C-P) yüzdesini (bireysel veri noktasıyla ortalama ± s.e.m., üçte biri temsili deney gösterilmiştir) temsil eder. (C,D) TME'ye odaklanan CD8 T hücresinin ToC mikroakışkan modeli (kanser-bağışıklık döngüsünün 6. adımı). (C) Bir İçindekiler'in şematik planimetrisi. İmmün ve kanser hücrelerini barındıran iki yan kültür odası, mikron boyutunda kanallarla bağlanır (genişlik = 12 μm, uzunluk = 10 μm, yükseklik = 10 μm). Hücre kültürü bölmeleri 1 mm genişliğinde, 8 mm uzunluğunda ve 100 μm yüksekliğindedir. Hızlandırılmış kayıtlar sırasında oluşturulan mikrofotoğraflar, CD8C-P'nin farklı zaman noktalarında (0-72 saat; ölçek çubuğu, 100 μm) kanser hücrelerine doğru göçünü temsil eder. (D) Bireysel CD8C-P'nin (koşul başına n = 100 hücre) 24-72 saat içinde hedef kanser hücrelerine (siyah noktalar) doğru yörüngelerini temsil eden grafikler gösterilir (ölçek çubuğu, 10 μm). (A) CD8N ile karşılaştırıldığında Welch düzeltmesi ile eşleştirilmemiş iki taraflı Öğrenci t-testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig04.jpg"> Şekil 4: Canlı kanser hücreleri ile yeniden uyarılma sonrası CD8 T hücresi tümör reaktivitesi. (A) kansere maruz kalan Ags (CD8E) tarafından yeniden uyarılan CD8 T hücreleri üzerindeki CD44, CD25 aktivasyon belirteçlerinin yüzey ekspresyon seviyelerinin mFC analizi (kanser-bağışıklık döngüsünün 7. adımı) 72 saate kadar. Temsili biparametrik grafikler ve 48 saat ve 72 saatte CD8 N, CD8C-P, CD8E'de CD44 + CD25 + CD8 T hücre yüzdesini gösteren bir histogram (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, n = 3 bağımsız deney). (B) CD8E'de tümör reaktivite belirteci CD137'nin membran ekspresyonunun mFC analizi. Temsili biparametrik grafikler ve 48 saat ve 72 saatte CD8N, CD8C-P, CD8E'de CD137+ CD8 T hücre yüzdesini gösteren bir histogram (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, üç temsili deneyden biri gösterilmiştir). (A,B) Sıradan tek yönlü ANOVA testi ve ardından Bonferroni düzeltmesi CD8N ile karşılaştırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig05.jpg"> Şekil 5: Grz-B ve IFN-γ'nin CD8 T hücresi üretimi. (A) CD8 E'de Grz-B'nin hücre içi ekspresyon seviyelerinin mFCanalizi (kanser-bağışıklık döngüsünün 7. adımı). 48 saat ve 72 saatte CD8N, CD8C-P, CD8E'de Grz-B + CD8 T hücresi MFI'yi gösteren temsili histogram grafikleri (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, n = 3 bağımsız deney). (B) CD8E'de hücre içi IFN-γ mFC analizi. 48 saat ve 72 saatte CD8N, CD8C-P, CD8E'de IFN-γ+ CD8 T hücre yüzdesini gösteren temsili histogram grafikleri (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, n = 3 bağımsız deney). (A,B). Sıradan tek yönlü ANOVA testi ve ardından Bonferroni düzeltmesi CD8N ile karşılaştırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66729/66729fig06.jpg"> Şekil 6: CD8 T hücre aracılı tümör öldürme. (A) 72 saatlik ko-kültürden sonra CD8E tarafından yönlendirilen CD45 hücre ölümünün mFC analizi (kanser-bağışıklık döngüsünün 7. adımı). Histogramlar, ölmekte olan PI+CD45− hücrelerinin yüzdesini (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, n = 3 bağımsız deney) temsil eder. (B) CD8E aracılı kanser hücresi ölümünün canlı hücre analizi. Temsili resimler ve Cytotox Red'in ölmekte olan ve ölü kanser hücreleri tarafından dahil edildiğini gösteren bir çizim (üç temsili deneyden biri gösterilmiştir). (A) Tek başına kanser hücreleri (CTR) ile karşılaştırıldığında eşleştirilmemiş iki taraflı Öğrenci t-testi. (B) CTR ile karşılaştırıldığında iki kuyruklu Mann-Whitney testi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/66729fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: Histogram grafikleri, CD95+TCR-β+ CD8N ve CD8C-P'nin MFI'sini temsil eder. Eşlenmemiş iki taraflı Öğrenci t-testi CD8N ile karşılaştırılmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%201_revised.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: CD8 T hücresi aktivasyonu. (A) CD8 E'deki erken CD69 aktivasyon markörünün yüzey ekspresyon seviyelerinin mFCanalizi (kanser-bağışıklık döngüsünün 7. adımı). Temsili biparametrik grafikler ve 48 saat ve 72 saatte CD8N, CD8C-P, CD8E'de CD69+ CD8 T hücre yüzdesini gösteren bir histogram (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, üç deneyden biri). (B) CD8E üzerindeki CD107a lizozomal ilişkili proteinin membran ekspresyonunun mFC analizi. Temsili biparametrik çizimler ve 48 saat ve 72 saatte CD8N, CD8C-P, CD8E'de CD107a + CD8 T hücre yüzdesini gösteren bir histogram (ortalama ± s.e.m. ve bireysel veri noktaları, üç temsili deneyden biri gösterilmiştir). (A,B). Sıradan tek yönlü ANOVA testi ve ardından Bonferroni düzeltmesi CD8N ile karşılaştırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Suppl.%20Figure%202_revised%20.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo 1: Antikor karışımları adım 3.3.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66729/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada, kanser-bağışıklık döngüsünü oluşturan adımları izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir multiparametrik akış sitometrisi ve çip üzerinde tümör destekli protokolü detaylandırıyoruz. Gerçekten de, kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde anlaşılması, tümörleri alt etmek ve klinik bakıma rehberlik etmek için kritik bilgiler sağlar.

Kanser-Bağışıklık Döngüsünü Çoğaltmak için İn Vitro Sistemlerde Ko-Kültür

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

co-culture-in-vitro-systems-to-reproduce-the-cancer-immunity-cycle

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

Bu videoda, yüksek tümör hücresi yükleri sırasında CAR T hücrelerinin tekrarlayan tümör öldürme potansiyelini değerlendirmek için tekrarlayan tümör zorluğu testini gösteriyoruz. Ayrıca, CAR T hücreleri, numunedeki CAR T hücrelerinin farklı alt popülasyonlarını belirlemek için akış sitometrisi kullanılarak analiz edilebilir.

Tekrarlayan Tümör Zorluk Testi: Tekrarlayan Tümör Öldürme Potansiyeli için Kimerik Antijen Reseptörü (CAR) T Hücrelerini Değerlendirmek İçin Bir İn Vitro Kültür Testi

Tümör başlatıcı hücreler (TIC'ler), oldukça tekrarlayan ve ölümcül bir hastalık olan yumurtalık kanserinin tedavisi için uygun bir terapötik hedef olabilir. Bu yüksek derecede tümörjenik hücre popülasyonu için zenginleştiren kültür koşulları için bir protokol sunuyoruz.

Yumurtalık Kanseri Tümör başlatan Hücrelerinin in vitro Zenginleşmeden içinde

Tümör mikroçevresini (TME) taklit etmek için geçirgen bir mikro gözenekli membran ekini uyarladık. Model, karışık bir hücre kültüründen oluşur, floresan etiketleme veya hücre sıralama kullanmadan yüksek oranda zenginleştirilmiş bireysel hücre popülasyonlarının basitleştirilmiş üretimine izin verir ve normal veya stres koşulları altında TME içinde hücreler arası iletişimin incelenmesine izin verir.

Tümör mikroçevresinin A Mimik: Hücreler arası İletişim Zenginleştirilmiş hücre popülasyonları oluşturma ve incelenmesi için Basit Bir Yöntem

Burada, antitümör T hücre etkinlik fenotipik ve fonksiyonel analiz için izin veren bir tüp bebek ortak kültür yöntemi yinelemeli olarak meydan tümör hedefli T hücreleri, açıklayın.

Vitro tümör hücre Rechallenge içinde akıllı Chimeric antijen reseptör T hücre antitümör işlevi değerlendirilmesi için

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

İmmünoterapi ve tek hücreli genomik profilleme çağında, kanser biyolojisi, tümör-bağışıklık arayüzünü uygun bir mekansal zamansal bağlamda araştırmak için yeni in vitro ve hesaplama araçları gerektirir. Hücresel fonksiyonların dinamik, multiparametrik izlenmesi ile uyumlu, 2D ve 3D ortamlarda tümör-immün mikroakışkan ko-kültürlerden yararlanmak için protokolleri açıklıyoruz.

İn vitro tümör mikroortamlarında immün yanıtı diseksiyon için mikroakışkan ko-kültür modelleri

Mevcut protokol, önceden tedavi edilmiş tümör hücreleri ile allojenik bir ko-kültür sisteminde insan T hücresi stimülasyonunun ex vivo analizine izin veren deneysel bir iş akışını açıklamaktadır.

Önceden İşlem Görmüş Tümör Hücrelerinin Allojenik Ko-Kültür Ortamında İnsan T Hücresi Aktivitesinin Analizi

Protokol, etkileşimlerini ve terapötik potansiyellerini incelemek için tümör infiltre eden lenfositler (TIL'ler) ile birlikte kültürlenmiş, hasta kaynaklı bir kolorektal kanser (CRC) organoid modeli oluşturmak için bir yöntemi açıklar. Bu model, tümör mikroçevresindeki immün yanıtları araştırmak ve kişiselleştirilmiş KRK tedavisi için TIL bazlı tedavinin etkinliğini tahmin etmek için klinik öncesi bir platform sağlar.

Hasta Kaynaklı Kolorektal Tümör Organoidleri ve Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerden (TIL'ler) Oluşan Bir Ko-Kültür Sisteminin Kurulması

Bu protokol, fare kanseri hücrelerinin, transkripsiyon faktörleri PU.1, IRF8 ve BATF3'ün zorunlu ekspresyonu yoluyla tümör mikroçevresi içinde tip 1 dendritik benzeri hücrelere in vivo olarak yeniden programlanmasını tanımlar.

Tümör Hücrelerinin Tip 1 Konvansiyonel Dendritik Hücre Benzeri Hücrelere İzlenebilir İn Vivo Yeniden Programlanması

Öğrenin, kanser-bağışıklık döngüsünün her adımını izlemek ve karakterize etmek için basit, hızlı ve güvenilir bir in vitro ko-kültür protokolü. Bu yöntem, akış sitometrisi ve tümör-çip modelleri kullanarak kanser ve bağışıklık hücreleri arasındaki etkileşimleri anlamanıza yardımcı olur.

Kanser-Bağışıklık Döngüsünü Çoğaltmak için İn Vitro Sistemlerde Ko-Kültür

Daha fazla video keşfet