Name: DNA Ekstraksiyonu ve Eski ve Taze Nekrofilik Sinek Örnekleri Arasında Karşılaştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Öğrenin necrophilic sineklerden DNA ekstraksiyonunu ve taze ile eski örnekler arasındaki konsantrasyon farklarını karşılaştırmayı. Bu uygun maliyetli yöntem adli biyoloji ve moleküler analizler için erişilebilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (82060341,81560304) ve Hainan Eyaleti Akademisyen İnovasyon Platformu Bilimsel Araştırma Projesi (YSPTZX202134) tarafından desteklenmektedir.

NOT: Bu protokolde toplam beş C . megacephala numunesi kullanıldı - üç taze numune (Taze 1, Taze 2 ve Taze 3), 2 yıl boyunca alkolde saklanan bir numune (Eski 1) ve 2 yıl boyunca kuru kapalı depoda saklanan bir numune sadece ışıktan korunarak (Eski 2). Numuneler deney gereksinimlerine göre etiketlenmelidir.
1. Genel numune saklama ve hazırlıklar
<ol><li>Numune seçimi ve hazırlanması NOT: Nekrofag sineklerini yürütmek için etil asetat uygularken çeker ocakta çalıştığınızdan emin olun. Tartmadan önce sıvıyı sineğin yüzeyinden çıkarın.<ol><li>Taze numuneler: Toplanan üç sinek numunesini etil asetat ile öldürdükten sonra gaz şişelerine koyun. Numuneleri tartın ve Taze 1, Taze 2 ve Taze 3 olarak adlandırın ve deneylerde hemen kullanın. NOT: Bu protokoldeki taze sinek örneklerinin kütleleri 56.8 mg, 49.3 mg ve 52.1 mg'dır.</li>
		<li>Eski numune 1: Etil asetat tarafından öldürülen ve alkol dolu santrifüj tüplerinde 2 yıl boyunca hava geçirmez bir muhafaza içinde, oda sıcaklığında ışıktan korunan sinek numunelerini çıkarın. Yüzey sıvısını filtre kağıdı ile adsorbe ettikten sonra numuneyi tartın; Eski 1 deyin. NOT: Bu protokolde Eski 1'in kütlesi 42.3 mg idi.</li>
		<li>Eski numune 2: Etil asetat tarafından öldürülen ve oda sıcaklığında ışıktan korunarak hava geçirmez bir muhafaza altında 2 yıl boyunca bir santrifüj tüpünde saklanan sinek örneğini çıkarın. Tartın ve ona Eski 2 deyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Ekstraksiyon öncesi hazırlık<ol><li>Paslanmaz çelik bir kabı soğutmak için az miktarda sıvı nitrojen ekleyin; Tüm sıvı nitrojen buharlaşana kadar bekleyin.</li>
		<li>Kabın içine bir sinek örneği koyun; Sıvı nitrojenin sıçramasını ve böcek örneğine çarpmasını önlemek için sıvı nitrojeni yavaşça dökün.</li>
		<li>Numuneleri sıvı nitrojen içinde dondurun. Sıvı nitrojen buharlaştıktan sonra numuneleri çıkarın.</li>
		<li>Göğüs kafesini ayrı ayrı ayırın, 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve mümkün olan en küçük dilimler halinde kesin. NOT: Numuneyi tamamen parçalanabilmesi için küçük parçalara ayırın ve DNA büyük miktarlarda salınabilir.</li>
		<li>Her sinek için yukarıdaki adımları tekrarlayın, ayrı ayrı dondurun ve ardından DNA çapraz kontaminasyonunu önlemek için yeni bir santrifüj tüpüne çıkarın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. DNA ekstraksiyonu
NOT: Tüm santrifüj adımları, oda sıcaklığında (15-25 °C) bir mikrosantrifüjde gerçekleştirilmelidir. Tüm adımlar, asepsi ilkelerine sıkı sıkıya bağlı kalarak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Doku lizisi<ol><li>Kırpılmış bir numune içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne 180 μL doku lizis tamponu ekleyin.</li>
		<li>20 μL proteinaz K ekleyin. 3 000 rpm'de 10 saniye girdaplayarak iyice karıştırın ve böcek dokuları tamamen parçalanana kadar 56 ° C'de inkübe edin. NOT: Doku tam olarak sindirilmemişse daha fazla Proteinaz K eklenmelidir. Lizis genellikle 1-3 saat içinde tamamlanır, ayrıca gece boyunca lizis süresini uzatabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>DNA çökelmesi<ol><li>15 saniye boyunca 3.000 rpm'de girdap. Numuneye 200 μL lizis tamponu ekleyin ve 15 saniye boyunca 3.000 rpm'de girdaplayarak iyice karıştırın.</li>
		<li> </li></ol></li><li></li><li></li><li> </li><li> </li><li></ol><ol><li><li><ol><li> </li><li> </li><li> </li><li></ol></li></ol><img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"><ol><li></li><li><li></ol>

Taze ve Eski Nekrofilik Sinek Örneklerinde DNA Saflığı ve Konsantrasyonunun Değerlendirilmesi

<ol><li>Amendt, J., Richards, C. S., Campobasso, C. P., Zehner, R., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forensic+entomology%3A+applications+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">Forensic entomology: applications and limitations.</a> Forensic Sci Med Pathol. 7 (4), 379-392 (2011).</li>
<li>Wydra, J., Matuszewski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+optimal+post-eclosion+interval+while+estimating+the+post-mortem+interval+based+on+an+empty+puparium%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Med+Pathol%22%5BJournal%5D)">The optimal post-eclosion interval while estimating the post-mortem interval based on an empty puparium.</a> Forensic Sci Med Pathol. 17 (2), 192-198 (2021).</li>
<li>Mazzanti, M., Alessandrini, F., Tagliabracci, A., Wells, J. D., Campobasso, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+degradation+and+genetic+analysis+of+empty+puparia%3A+genetic+identification+limits+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">DNA degradation and genetic analysis of empty puparia: genetic identification limits in forensic entomology.</a> Forensic Sci Int. 195 (1-3), 99-102 (2010).</li>
<li>Odeniran, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((molecular+identification+and+distribution+of+Trypanosome-transmitting+Dipterans+from+cattle+settlements+in+Southwest+Nigeria%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Parasitol%22%5BJournal%5D)">molecular identification and distribution of Trypanosome-transmitting Dipterans from cattle settlements in Southwest Nigeria.</a> Acta Parasitol. 66 (1), 116-128 (2021).</li>
<li>Wells, J. D., Stevens, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+DNA-based+methods+in+forensic+entomology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Application of DNA-based methods in forensic entomology.</a> Annu Rev Entomol. 53, 103-120 (2008).</li>
<li>Kotrba, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+barcoding+in+forensic+entomology-establishing+a+DNA+reference+library+of+potentially+forensic+relevant+arthropod+species%5BTitle%5D)+AND+%22J+Forensic+Sci%22%5BJournal%5D)">DNA barcoding in forensic entomology-establishing a DNA reference library of potentially forensic relevant arthropod species.</a> J Forensic Sci. 64 (2), 593-601 (2019).</li>
<li>Weedon, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+SNP+chips+to+detect+rare+pathogenic+variants%3A+Retrospective%2C+population+based+diagnostic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ%22%5BJournal%5D)">Use of SNP chips to detect rare pathogenic variants: Retrospective, population based diagnostic evaluation.</a> BMJ. 372, 214(2021).</li>
<li>Cai, J. -F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+availability+of+mitochondrial+DNA+cytochrome+oxidasegene+for+the+distinction+of+forensically+important+flies+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Entomologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">The availability of mitochondrial DNA cytochrome oxidasegene for the distinction of forensically important flies in China.</a> Acta Entomologica Sinica. 48 (3), 380-385 (2005).</li>
<li>Khayrova, A., Lopatin, S., Varlamov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obtaining+chitin%2C+chitosan+and+their+melanin+complexes+from+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Obtaining chitin, chitosan and their melanin complexes from insects.</a> Int J Biol Macromol. 167, 1319-1328 (2021).</li>
<li>Guo, Y. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+DNA+extracting+methods+from+different+parts+of+common+necrophagous+flies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Henan+Univ+Sci+Tech+%28Med+Sci%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of three DNA extracting methods from different parts of common necrophagous flies.</a> J Henan Univ Sci Tech (Med Sci). 36 (02), 130-133 (2018).</li>
<li>Du, H., Xie, H., Ma, M., Igarashi, Y., Luo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+methods+obtain+high-quality+DNA+and+RNA+from+anaerobic+activated+sludge+at+a+wide+range+of+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Modified methods obtain high-quality DNA and RNA from anaerobic activated sludge at a wide range of temperatures.</a> J Microbiol Methods. 199, 106532(2022).</li>
<li>Sukumaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+determination+of+nucleic+acids+and+proteins+using+the+micro-volume+BioSpec-nano-spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Concentration determination of nucleic acids and proteins using the micro-volume BioSpec-nano-spectrophotometer.</a> J Vis Exp. (48), e2699(2011).</li>
<li>Masago, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+between+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+DNA+and+RNA+extracted+from+frozen+and+FFPE+tissues+from+lung+cancer+patients%3A+A+real-world+use+of+genomic+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Medicina+%28Kaunas%29%22%5BJournal%5D)">Comparison between fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of DNA and RNA extracted from frozen and FFPE tissues from lung cancer patients: A real-world use of genomic tests.</a> Medicina (Kaunas). 57 (12), 1375(2021).</li>
<li>Ponti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+value+of+fluorimetry+%28Qubit%29+and+spectrophotometry+%28NanoDrop%29+in+the+quantification+of+cell-free+DNA+%28cfDNA%29+in+malignant+melanoma+and+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The value of fluorimetry (Qubit) and spectrophotometry (NanoDrop) in the quantification of cell-free DNA (cfDNA) in malignant melanoma and prostate cancer patients.</a> Clin Chim Acta. 479, 14-19 (2018).</li>
<li>Adams, Z. J., Hall, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+used+for+the+killing+and+preservation+of+blowfly+larvae%2C+and+their+effect+on+post-mortem+larval+length%5BTitle%5D)+AND+%22Forensic+Sci+Int%22%5BJournal%5D)">Methods used for the killing and preservation of blowfly larvae, and their effect on post-mortem larval length.</a> Forensic Sci Int. 138 (1-3), 50-61 (2003).</li>
<li>Fliegerova, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+DNA+extraction+and+sample+preservation+method+on+rumen+bacterial+population%5BTitle%5D)+AND+%22Anaerobe%22%5BJournal%5D)">Effect of DNA extraction and sample preservation method on rumen bacterial population.</a> Anaerobe. 29, 80-84 (2014).</li>
<li>Rodrigues, B. L., Galati, E. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+taxonomy+of+phlebotomine+sand+flies+%28Diptera%2C+Psychodidae%29+with+emphasis+on+DNA+barcoding%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Trop%22%5BJournal%5D)">Molecular taxonomy of phlebotomine sand flies (Diptera, Psychodidae) with emphasis on DNA barcoding: A review.</a> Acta Trop. 238, 106778(2023).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

DNA ekstraksiyonu, nekrofilik sineklerin moleküler tanımlanmasında en kritik bağlantıdır ve ekstraksiyon yöntemi ve ekstrakte edilen DNA'nın kalitesi, sonraki tespiti doğrudan etkiler. Bu deneyde, özel bir böcek DNA ekstraksiyon kiti satın almaya gerek kalmadan, ortak bir kan kiti kullanarak nekrofil sineklerden DNA'yı başarıyla çıkardık, bu da böcek DNA'sı ekstraksiyonunun gerçekleştirilmesini kolaylaştırıyor.
Sineklerin yüzeyi, özellikle epidermal kitinin% 60-70'e ulaşabildiği larva ve pupa aşamalarında kitin bakımından zengindir, bu da nekrofilik sineklerden DNA ekstraksiyonunu zorlaştırır9. Ekstraksiyon işlemi sırasında, numunenin ıslak olması durumunda, numuneyi yeterince kesmiş olmamıza rağmen, sindirim için proteinaz K uygulandığında numunenin jelatinimsi kaldığını bulduk. Bu, eklenen sıvının adsorpsiyon kolonundan geri geçmesini engelledi. Bu sorunu çözmek için, sineklerin kırılgan ve öğütülmesi kolay olmasının yanı sıra tamamen sindirimi kolay hale getirmek için önce numuneleri hızlı bir şekilde dondurmak için sıvı nitrojen uyguladık. Öğütme için sıvı nitrojen mevcut değilse ve DNA ekstraksiyon verimliliği hala iyileştirilecekse, sinek örnekleri yaklaşık 48 saat boyunca havalandırılan bir alana yerleştirilebilir. Numuneler, yeterince kesilmeden önce kurumaya bırakılabilir ve ardından DNA ekstrakte edilebilir.
Eski örneklerin DNA bozulmasının daha büyük bir endişe kaynağı olduğu göz önüne alındığında, yüksek toraks DNA içeriği nedeniyle bu deneyde DNA ekstraksiyonu için sinek toraks örnekleri seçildi. Bununla birlikte, toraksın kullanımı, sonraki kanıtların tam olarak korunması ve morfolojik tanımlama ihtiyacı için sineğin morfolojik bütünlüğüne çok zarar verir. Göğüs kafesi çürürken örneklerin çıkarılması zordur. Numuneler taze ise, ayak ve kanadın DNA ekstraksiyonu tercih edilebilir. Ayak ve kanat simetrik ve iki taraflı olarak dağılmıştır ve bir taraftan doku çıkarıldıktan sonra daha tam morfolojik özellikler korunabilir. Bununla birlikte, kanat ve ayaktan ekstrakte edilen DNA konsantrasyonu nispeten düşüktür, bu da sonraki çalışmalar için risklidir. Ek olarak, numuneler küçüktü ve kolayca kayboldu10.
DNA ekstraksiyonu için DNA ekstraksiyon kitini kullanırken, mikroplaka okuyucu tarafından ölçülen OD260 / OD280 değerleri, Eski numune 2 dışında 2'den büyüktü. İlk olarak, proteinin daha kapsamlı bir şekilde çıkarıldığı belirlenebilir, ancak RNA kontaminasyonu, tekrarlanan santrifüjlemeye bağlı DNA çift sarmallı kırılmalar veya eski örneklerde DNA bozulması olabilir11. İkincisi, alkolün RNA'nın korunmasını uzattığını da gösterebilir.
DNA konsantrasyonu, mikroplaka okuyucunun OD260 değerinden hesaplanırken, Qubit florometre önce standart bir eğri oluşturmak için kullanılır ve ardından DNA konsantrasyonunu hesaplamak için absorbans değerini ölçer. Her iki yöntem de eser DNA konsantrasyonunun ölçümünü gerçekleştirebilir, ancak her birinin avantajları ve dezavantajları vardır: Mikroplaka okuyucu, DNA konsantrasyonunu hesaplamak için OD260 uygular, ancak hesaplama yöntemi de bir tahmindir. Numune çok sayıda nükleotid veya protein ve ultraviyole ışığı emebilen diğer maddelerle karıştırılırsa, fotometrik hata daha büyük olacaktır, bu nedenle bunları önceden çıkarmaya çalışmalıyız.
Mikroplaka okuyucular ve UV spektrofotometreleri, DNA, RNA, bozulmuş nükleik asitler, serbest nükleotidler ve diğer safsızlıklar arasında ayrım yapamayan algılama için UV absorbansını kullanır ve absorbans, diğer maddelerin kontaminasyonundan da büyük ölçüde etkilenir ve bu da okumalarını nispeten güvenilmez hale getirir. Genellikle damlalar halinde ölçülen numuneler dikilirken, numuneler seyreltme veya işleme tabi tutulmadan doğrudan çivilenir, bu da birden fazla numunenin aynı anda ölçülmesine ve OD260/OD280 ölçümlerinden DNA saflığının doğrudan hesaplanmasına olanak tanır. Öte yandan Qubit florometre, standart bir eğri oluşturmak için bilinen konsantrasyonda iki standart çözelti uygulayarak ve özellikle çift sarmallı DNA'ya bağlanan floresan boyaların özelliklerini uygulayarak yalnızca çift sarmallı DNA konsantrasyonunu ölçmek için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, her numunenin ayrı ayrı ön işleme tabi tutulması ve daha sonra ayrı ayrı ölçülmesi gerekir, bu da toplu numune uygulamaları için zahmetlidir ve ekstrakte edilen DNA'nın saflığı ölçülemez. İkisinin spesifik uygulamasında, DNA'nın kalite testi için kendi ihtiyaçlarına göre seçilebilir 12,13,14.
Taze numunelerin DNA konsantrasyonu, DNA konsantrasyonunun bir mikroplaka okuyucu veya bir Qubit florometre ile ölçülüp ölçülmediğine bakılmaksızın, alkole yerleştirilen eski numunelerden daha büyüktü ve işlenmemiş eski numunelerinkinden daha büyüktü. Uzun süreli saklama için, bakteri ve mantarlarınbüyümesini önlemek için numuneler alkole daldırılabilir 15,16.
Farklı ölçüm yöntemleri, herhangi bir tedavi olmaksızın eski örneklerin DNA ölçümleri üzerinde daha az etkiye sahipti, çünkü muhtemelen eski örnekler daha fazla bozulmuştu, özellikle protein ve RNA'nın tümü DNA'dan daha hızlı bozunabilirdi. Buna karşılık, taze numuneler daha fazla protein ve RNA'ya sahipti ve bu nedenle sonuçlar üzerinde daha büyük bir etkiye sahipti. Sadece çift sarmallı DNA konsantrasyonları karşılaştırılırsa, Qubit florometresinin sonuçlarını kullanmalıyız ve deneylerimizin sonuçları da eski ve yeni örneklerde önemli bir DNA konsantrasyon gradyanı yarattı.
DNA ekstraksiyonundan sonra hem taze hem de eski numunelerin DNA içeriği, sonraki moleküler biyoloji analizleri için kullanılabilir. Bu deneyde olduğu gibi, mitokondriyal CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> geni için seçilen primerler sadece 278 bp idi ve hepsi DNA tarafından başarılı bir şekilde amplifiye edilebildi. Mitokondriyal CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> geni, sırayla, DNA barkodlama potansiyeli için sineklerde tanınan bir lokustur, böylece müteakip dizileme analizi17 ile nekrofilik sinek türlerinin tanımlanmasına izin verir. Daha uzun süre korunmuş örneklerin moleküler biyolojisi, diğer daha kısa DNA dizileri için primerlerin seçilmesiyle başarılı bir şekilde elde edilebilir. Dikkat çekici bir şekilde, eski numunelerin elektroforetik bantları, muhtemelen düşük tavlama sıcaklığı ile birlikte DNA'nın bozulmasının neden olduğu primerlerin spesifik olmayan amplifikasyonu nedeniyle, farklı konumlara ve daha kısa dizilere sahip iki banda sahipti.
Bununla birlikte, bu deneyde, tekrarlayan deneylere olan ihtiyacı karşılamak için uzun bir süre boyunca daha az numune korunurken, sonuçlar yalnızca temsili numuneler gerektiriyordu. Bu nedenle, eski ve yeni numunelerin korunması için keşif amaçlı olabilecek ancak nekrofilik sinek numunelerinin başarılı bir şekilde çıkarılmasını etkilemeyen bir tekrarlanabilirlik testi yapmadık.
Özetle, bir kan DNA ekstraksiyon kitinin kullanılması, nekrofilik sinek DNA'sının ekstraksiyonuna da yardımcı olabilir. Hem eski hem de yeni numuneler başarılı bir şekilde ekstrakte edilebilir ve ekstrakte edilen tüm DNA sonraki analizler için kullanılabilir. Alkol, sinek DNA örneklerinin uzun süreli korunması için de uygundur.

<a href="https://app.jove.com/t/6604">This corrects</a> the article <a href="https://dx.doi.org/10.3791/66737">10.3791/66737</a>

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/66737">DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples</a>. The Authors section was updated.

Erratum: DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Ölüm zamanının çıkarımı, yargı pratiğinde her zaman çözülmesi gereken kilit ve zor konulardan biri olmuştur. Adli tıp pratiğinde, bir ceza davası için, ölüm sonrası aralığın belirlenmesi, suçun zamanının çıkarılmasında, şüphelinin kilitlenmesinde ve soruşturmanın kapsamının daraltılmasında çok önemli bir rol oynar. Ölüm zamanını belirlemenin geleneksel yöntemleri, esas olarak, genellikle yalnızca 24 saat içindeki ölüm zamanını çıkarmak için kullanılabilen erken ölüm sonrası olaylara dayanır. Bununla birlikte, uzun ölüm süresi ölüm sonrası olaylarla belirlenemez. Artık adli bilim camiasında, adli entomolojinin daha uzun bir ölüm süresini çıkarmada etkili bir yöntem olma potansiyeline sahip olduğu genel olarak kabul edilmektedir.
Nekrofag böcekler, cesetlerle beslenen larvaları için adlandırılır. Bunların arasında, bir ceset mevcut olduğunda, yetişkin nekrofil sinekler cesede ilk ulaşan ve yumurtalarını veya larvalarını bırakan ilk sinekler olacaktır. Larvalar ceset dokusuyla beslenir ve olgunlaşarak yetişkinlere dönüşen pupalara dönüşür. Nekrofilik sinekler, düzenli yaşam döngüleri ve coğrafi dağılımları nedeniyle adli bilimlerin uygulanmasında büyük bir rol oynamaktadır, örneğin, ölüm zamanının düşülmesi ve ölüm yerininbelirlenmesi 1,2. Bununla birlikte, adli uygulamada nekrofil sineklerin kullanılmasının önündeki engel tür tanımlamasıdır. Morfolojik yöntemler, nekrofilik sineklerin tür tanımlaması için yetkili yöntem olarak hala kullanılmaktadır. Bununla birlikte, morfolojik türlerin tanımlanması, yüksek derecede böcek bütünlüğü gerektirir. Sinekler farklı gelişim aşamalarındaysa veya çevresel seçimlerin neden olduğu morfolojik değişiklikler nedeniyle, bunların hepsi morfolojik incelemeyi daha zor hale getirir. Özellikle, suç mahallinde en sık bulunan pupa ve pupa kabuklarının morfolojisi zar zor tanınabilir. Bu, morfolojik uzmanların azlığı ile birlikte, türlerin morfolojik olarak tanımlanmasında büyük zorluklar yaratmaktadır. Bu nedenle, sineklerin tür tanımlaması için moleküler biyoloji yöntemlerinin uygulanması ortaya çıkmıştır, bu da morfolojik tanımlamanın zorluğunu azaltır ve gelişim evresi 3,4,5,6,7'den bağımsızdır.
Moleküler biyoloji yöntemlerine dayalı olarak nekrofil sineklerin tür tanımlamasındaki ilk adım, DNA'nın verimli bir şekilde ekstraksiyonudur, ancak böcek DNA ekstraksiyonu için özel kitler şu anda yaygın olarak mevcut değildir. Ve nekrofilik sineklerin DNA ekstraksiyonu için ortak kan kitlerinin nasıl kullanılacağı adli olarak daha alakalı hale gelir. Suç mahallerinde bulunan nekrofilik sinekler genellikle sakatlanır veya çürüme ve DNA bozulmasına uğrar. Sinek örnekleri, alındıktan sonra DNA ekstraksiyonu için hemen mevcut değildir veya mümkünse, kanıt koruma gereklilikleri nedeniyle tam örneklerin saklanması gerekir. Yukarıdaki gereksinimlere dayanarak, bu çalışmada, proteinaz K sindirimine dayalı kan DNA kitini uyguladık ve üç taze Chrysomya megacephala (Diptera, Lepidoptera) örneği seçtik (Şekil 1), iki yıl boyunca alkole yerleştirilmiş bir eski C. megacephala örneği ve iki yıl boyunca ışık korumalı depoya yerleştirilen bir C. megacephala örneği, beş örneğin her birini tarttık, DNA ekstraksiyonu için böcek toraks dokusunu seçti. Eski ve yeni örneklerden ekstrakte edilen DNA'nın kalitesi ve saflığı karşılaştırılarak, ekstrakte edilen DNA'nın PCR amplifikasyonu ve elektroforezi, mitokondriyal CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> gen dizisinde bulunan nekrofilik sinek spesifik primerler ile gerçekleştirildi.

<table><tbody><tr><td>Tampon AE</td><td>Qiagen</td><td>172026832</td><td>DNA elüsyon tamponu</td></tr><tr><td>Tampon AL</td><td>Qiagen</td><td>172028374</td><td>lizis tamponu</td></tr><tr><td>Tampon ATL</td><td>Qiagen</td><td>172028162</td><td>doku lizis tamponu</td></tr><tr><td>Tampon AW1</td><td>Qiagen</td><td>172028760</td><td>protein uzaklaştırma tamponu</td></tr><tr><td>Tampon AW2</td><td>Qiagen</td><td>57203108</td><td>tuzdan arındırma tamponu</td></tr><tr><td>C1-J-2495</td><td>Taihe Biyoteknoloji</td><td>TW21109216</td><td>forword astar</td></tr><tr><td>C1-N-2800</td><td>Taihe Biyoteknoloji</td><td>TW21109217</td><td>ters astar</td></tr><tr><td>D2000 DNA merdiveni</td><td>Gerçek Zamanlar(Pekin) Biyoteknoloji</td><td>RTM415</td><td>Elektroforetik bantların konumunu ölçün</td></tr><tr><td>DNeasy Mini döndürme sütunu</td><td>Qiagen</td><td>166050343</td><td>DNA adsorpsiyon sütunu</td></tr><tr><td>Kuru Banyo İnkübatörü</td>MIX-30S Mini Mikseri <td>ısıtmak için kullanılan</td> <td>Miulab</td><td>DKT200-2D</td></tr><tr><td></td><td>Miulab</td><td>MUC881206</td> salınım <td>etkisi</td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>172026218</td><td>Hücre içi nükleazların ve diğer proteinlerin inaktivasyonu</td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Florometre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2321611188</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Mikro Santrifüj</td><td>Scilogex</td><td>9013001121</td><td>santrifüj</td></tr><tr><td>Standardı # 1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Standardı # 2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr><tr><td>Tanon 3500R Jel Görüntüleyici</td><td>Tanon</td><td>16T5553R-455</td><td>jel görüntüleme</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Karışımı</td></tr><tr><td>Taq Mix Pro</td><td>Monad</td><td>00007808-140534</td><td>PCR Karışımı</td></tr><tr><td>Thermo Cycler</td><td>Zhuhai Hema</td><td>VRB020A</td><td>sıradan PCR</td></tr><tr><td>Çalışma Çözümü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2342797</td><td></td></tr></tbody></table>

dna ekstraksiyonu ve eski ve taze nekrofilik sinek Örnekleri arasında karşılaştırma

DNA Extraction and Comparison Between Old and Fresh Necrophilic Fly Samples

Chrysomya megacephala örneklerinin toplam beş örneği - üç taze örnek, 2 yıl boyunca alkolde saklanan bir örnek ve 2 yıl boyunca sadece ışıktan korunan kuru kapalı depoda saklanan bir örnek - bir kan DNA ekstraksiyon kitinin nekrofilik sineklerden DNA çıkarıp çıkaramayacağını araştırmak ve alkolün nekrofilik sineklerin DNA'sının korunmasını uzatıp uzatamayacağını belirlemek için seçildi. İlk olarak, göğüs dokularından DNA'yı çıkarmak için kan DNA ekstraksiyon kiti kullanıldı. Daha sonra, DNA saflığı ve konsantrasyonu bir mikroplaka okuyucu ve bir florometre kullanılarak incelendi. Son olarak, ekstrakte edilen DNA'nın PCR amplifikasyonu ve elektroforezi, mitokondriyal CO I gen dizisinde bulunan nekrofilik sinek spesifik primerler ile yapıldı. Sonuçlar, tüm örneklerin DNA saflığının 2.0'dan büyük olduğunu gösterdi. DNA konsantrasyonunun şu sırada olduğu gözlendi: taze numuneler > alkolle korunmuş eski numuneler > işlenmemiş, eski numuneler. PCR amplifikasyonundan sonra tüm örneklerde spesifik elektroforetik bantlar vardı. Sonuç olarak, nekrofilik sineklerden DNA'yı başarılı bir şekilde çıkarmak için bir kan DNA ekstraksiyon kiti kullanılabilir ve taze sinek örneklerinin DNA konsantrasyonu eski sinek örneklerinden daha fazladır. Sinekler uzun süre alkolde saklanabilir.

Ekstrakte edilen DNA çözeltisinin OD260 ve OD280 değerlerini ölçmek için bir mikroplaka okuyucu kullandık ve ardından DNA'nın saflığını değerlendirmek için OD260 / OD280 değerlerini elde ettik. Tüm taze numunelerin OD260/OD280'i ve eski numune 1'in 2'den büyüktü. Eski numune 2'nin OD260/OD280'i, ortalama 2.187 olmasına rağmen maksimum 1.753 değerine sahipti ve hem OD280 hem de OD280'in küçük (≤0.01) değerleri nedeniyle üç ölçümü büyük ölçüde dalgalandı (Tablo 1). Elde edilen OD260 değerine dayanarak, DNA konsantrasyonunu tahmin ettik. Üçünün DNA konsantrasyonu şu sıradaydı: eski numune 1 &gt; eski numune 2 &gt; taze numuneler, mikroplaka okuyucu kullanılarak ölçüldü, ancak taze numuneler ile eski numuneler arasındaki fark küçüktü, sadece ~ 10-20 ng / μL (Tablo 1), Qubit florometre ile ölçülen üç taze numunenin DNA konsantrasyonu, mikroplaka okuyucu tarafından ölçülenden 125-130 ng / μL daha büyüktü, eski numune 1'de 15 ng/μL ve eski numune 2'de sadece 1.3 ng/μL farkla. Eski numune 1 &gt; eski numune 2 &gt; taze numunelerin DNA konsantrasyonu (Tablo 2).
Halihazırda kullanılan ekstraksiyon yöntemiyle ekstrakte edilen DNA, numunedeki farklı kaynaklardan gelen tüm DNA bileşenlerini içerir. Bu, DNA çözeltisinin sadece sinek genomik DNA'sının bir çözeltisi olmadığı anlamına gelir. Sinek mitokondriyal CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> gen fragmanlarını spesifik olarak amplifiye etmek için primerler literatüre danışılarak seçildi ve NCBI-Blast Primer ile doğrulandı. Sonuçlar, mitokondriyal CO <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66737/66737eq01v2.jpg" style="margin: auto;"> geninin ileri primer C1-J-2495 ve ters primer C1-N-2800'ün, dizi polimorfizmine sahip sinek spesifik primerler olduğunu ve birçok sinek türünü kapsadığını gösterdi. Amplifikasyon sonuçları insan genlerini göstermedi. Bunlar, nekrofil sinek tanımlaması için bir çift güvenilir DNA biyobelirteçleriydi ve bu deneyin sonuçlarının doğrulanması için seçildiler.
Tüm farklı numuneler, uzunlukları 250 bp-400 bp arasında değişen belirgin elektroforetik bantlar gösterdi. Bantlar taze numunelerde eski numunelere göre daha parlaktı ve alkol yerleştirilmiş eski numuneler (Şekil 2, Eski1), işlenmemiş eski numunelerden (Şekil 2, Eski2) daha parlaktı, ancak eski numunelerde ayrıca farklı pozisyonlarda iki bant vardı. Boş kontrolde bant yoktu (Şekil 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig01.jpg"> Şekil 1: Chrysomya megacephala'nın farklı açılardan görüntüleri. (A) Erkek; (B) kadın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66737/66737fig02.jpg"> Şekil 2: PCR amplifikasyon ürünlerinin elektroferogramı. Soldan ilk üç bant, taze sinek örneklerinden alınan DNA'nın PCR amplifikasyon ürünleridir. Dördüncü elektroforetik bant, alkolde korunan eski sinek örneğinden alınan DNA'nın PCR ürünüdür. Beşinci bant, herhangi bir özel koruma olmaksızın eski sinek örneğinden alınan DNA'nın PCR ürünüdür. Altıncı bant boş bir kontroldür; temizdir ve PCR amplifikasyonu sırasında herhangi bir kontaminasyon meydana gelmediğini kanıtlar. En sağda, 250 bp ve 400 bp uzunluklarında DNA pozisyonlarını etiketlediğimiz DNA merdiveni var. Tüm örneklerin PCR ürünlerinin elektroforetik bantları 250 bp'nin biraz üzerinde ve 400 bp merdiven bantlarının altındaydı. Bu pozisyon, 278 bp hedef genin uzunluğuyla eşleşir. Taze örnekleri temsil eden DNA bantlarının eski örneklerden daha parlak olduğu çıplak gözle daha açıktır. Eski örnekler, orada farklı uzunluklarda daha az yoğun, hedef olmayan genlerde bulunan diğer DNA bantlarını içerir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66737/66737fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Örnek</td>
			<td>Taze1</td>
			<td>Taze2</td>
			<td>Taze3</td>
			<td>Eski1</td>
			<td>Eski2</td>
		</tr><tr><td>OD260 / OD280</td>
			<td>2.354±0.036</td>
			<td>2.245±0.027</td>
			<td>2.060±0.038</td>
			<td>2.143±0.012</td>
			<td>1.753±0.421</td>
		</tr><tr><td>DNA (ng/μL)</td>
			<td>119.91±1.686</td>
			<td>116.084±4.965</td>
			<td>95.239±3.401</td>
			<td>86.845±6.14</td>
			<td>10.151±0.168</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Bir mikroplaka okuyucu ile DNA saflığının ve konsantrasyonunun ölçülmesi.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Örnek</td>
			<td>Taze1</td>
			<td>Taze2</td>
			<td>Taze3</td>
			<td>Eski1</td>
			<td>Eski2</td>
		</tr><tr><td>DNA (ng/μL)</td>
			<td>243.333±1.528</td>
			<td>237.667±2.082</td>
			<td>226.000±2.000</td>
			<td>101.000±0.000</td>
			<td>11.433±0.058</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Bir florometre ile DNA konsantrasyonunun ölçülmesi.

Bu makale, modifiye edilmiş bir ortak DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak taze ve eski nekrofilik sinek DNA ekstraksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır.

DNA Ekstraksiyonu ve Eski ve Taze Nekrofilik Sinek Örnekleri Arasında Karşılaştırma

A total of five samples of Chrysomya megacephala samples - three fresh samples, one sample stored in alcohol for 2 years, and one sample stored in dry ...

dna-extraction-comparison-between-old-fresh-necrophilic-fly

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu video makalede izole etmek için bir yöntem mevcut tek veya birden...

Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon Drosophila Periferik Nöronlar

Bu video, yetişkin Drosophila beyninin nasıl inceleneceğini ve izole edileceğini açıklar – aksi takdirde kütikül, göz ve trakeal doku tarafından gizlenen organı görselleştirmek için gerekli bir prosedür. Örnek protokol, Drosophila nörobiyolojisinde immün boyama ve görüntüleme yöntemleri için kullanılabilecek yüksek kaliteli preparatları veren ayrıntılı bir gösterimi göstermektedir.

Drosophila Erişkin Beyin Diseksiyonu: Sinek Nörobiyolojisinde Bir Yöntem

Biz burada mRNA ekstraksiyonu ve saflaştırılması için işlemler ve metabolitlerin...

Transkript ve Metabolitler gelen saflaştırılması<em&gt; Drosophila</em&gt; Kafaları

Burada dopaminerjik (DA) nöronların yaşa bağlı nörodejenerasyon incelemek için kurulmuştur iki deneyleri...

Içinde Nörodejeneratif fenotipleri değerlendirilmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Tırmanma Tahliller tarafından Dopaminerjik nöronlar ve Tüm Beyin immün

Drosophila yaygın nörodejenerasyonu incelemek için bir model sistem olarak kullanılmaktadır. Bu protokol, beyinde vakuol oluşumu ile tespit edildiği üzere, sayısal edilebilir dejenerasyonu bir yöntemi tarif etmektedir. Aynı zamanda dolayı bir örnek olarak işleme ve kesit kontrol ve deney sinekler tarafından deneysel prosedüre etkileri en aza indirir.

Kitle Histoloji nörodejenerasyon belirlememize<em&gt; Drosophila</em

Yetişkin Drosophila beyin nöronal devreleri, yüksek beyin fonksiyonları ve karmaşık bozuklukları çalışmak için değerli bir sistemdir. Etkin bir yöntem, beyin temelli çalışmalar kolaylaştıracak küçük sinek kafasından tüm beyin dokusu incelemek için. Burada iyi korunmuş morfolojisi ile yetişkin beyinlerinde basit, tek adımlı diseksiyon protokol açıklar.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

Protein toplama ve merkezi sinir sistemi Drosophila modellerinin autophagic akı floresan-görüntüleme tabanlı cep biyolojik çalışmalar nicel veri ayıklamak için bir basit ve uyarlanabilir iş akışı geliştirdiğimiz ateş.

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

Drosophila melanogaster'da nörodejenerasyon gösteren mutantlar için ekrana ileri genetik bir yaklaşım kullanarak bir protokol sunuyoruz. Bu bir tırmanma tahlil, Histoloji analizi, gen haritalama ve sonuçta nörokoruma süreci ile ilgili yeni genler belirlemek için DNA sıralaması içerir.

In vivo Ileri genetik ekran Drosophila melanogaster yeni Nörokoruyucu genler tanımlamak için

Bu işlemin amacı Drosophila melanogasterkullanarak nörodejeneratif hastalık modellerinde DLM nöromüsküler kavşaklar (NMJs) yapısal bütünlüğünü değerlendirmek için dorsal uzunlatanal kas (DLM) doku incelemektir.

Nörodejenerasyon ile Birlikte Erişkin Drosophila'da Sinaptik Dejenerasyonun Görselleştirilmesi

Bu makale, erişkin Drosophila'ya Penetrasyon Travmatik Beyin Hasarı (PTBI) uygulamak ve ortaya çıkan nörogenezleri incelemek için ayrıntılı protokoller sunmaktadır.

Drosophila Merkezi Beyninde Yetişkin Nörogenezini Uyarmak ve Analiz Etmek

Öğrenin necrophilic sineklerden DNA ekstraksiyonunu ve taze ile eski örnekler arasındaki konsantrasyon farklarını karşılaştırmayı. Bu uygun maliyetli yöntem adli biyoloji ve moleküler analizler için erişilebilir bir protokol sunar.

DNA Ekstraksiyonu ve Eski ve Taze Nekrofilik Sinek Örnekleri Arasında Karşılaştırma

Daha fazla video keşfet