Name: İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: Keşfedin, farelerde Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans görüntüleme ile gerçek zamanlı izlenmesini. Bu protokol, antiparaziter ilaçların etkinliğini değerlendirmek ve parazitolojik iyileşmeyi sağlayan bileşikleri belirlemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, ilaç etkinliği deneyleri konusunda BLI eğitimi ve desteği sağladıkları için Amanda Franscisco, John Kelly ve Fanny Escudié'ye, parazitler sağladıkları için John Kelly ve Simone Calderano'ya ve hayvan çalışmalarına destek için Gabriel Padilla'ya teşekkür eder. A.C.S, London School of Hygiene and Tropical Medicine'de (Birleşik Krallık) eğitim almak için CAPES PSDE Bursu aldı. Yazarlar ayrıca, IVIS Spektrum ekipman analiziyle ilgili teknik destek için Sao Paulo Üniversitesi (CEFAP-USP) Bilimsel Araştırma Çekirdek Tesisi'ndeki Akış Sitometrisi ve Görüntüleme Araştırmaları (FLUIR) Platformuna ve Genetik ve Sıhhi Kontrol Laboratuvarı'na teşekkür etmek isterler. Bu proje DNDi tarafından finanse edilmiştir. DNDi, 2003 yılındaki kuruluşundan bu yana tüm DNDi faaliyetleri için finansman sağlayan kamu ve özel bağışçılarına minnettardır. DNDi'nin bağışçılarının tam listesi https://dndi.org/about/donors/ adresinde bulunabilir.

Bu protokolde açıklanan tüm prosedürler, Universidade de São Paulo'daki Instituto de Ciências Biomédicas Hayvan Etik Komitesi tarafından önceden belirlenenyönergelere 14 göre sunulmuş, onaylanmış ve yürütülmüştür: protokol CEUA ICB/USP no 5787250522.
1. Çözümler
NOT: 10 mL/kg'lık önceden uygulanan hacmi göz önünde bulundurun (20 g ağırlığında bir fare için 20 μL)15,16. Örneğin, 150 mg / kg hayvan dozuna ulaşmak için 15 mg / mL'lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın.
<ol><li>Hidroksipropilmetilselüloz süspansiyonlu araç (HPMC-SV) NOT: Gerekli reaktifler %0,5 (a/h) Hidroksipropilmetilselüloz (HPMC), %0,4 (h/h) Tween 80 ve %0,5 (h/h) Benzil alkoldür.<ol><li>200 mL araç çözeltisi için 1 g HPMC'yi tartın ve 64 mL sıcak ultra saf suda çözün. 2 dakika karıştırın.</li>
		<li>120 mL buz gibi ultra saf su ekleyin ve 1 saat karıştırın. 1 mL benzil alkol ekleyin.</li>
		<li>Ardından, ters pipetleme tekniğini kullanarak 0,8 mL Tween 80 ekleyin ve çözelti şeffaf hale gelene kadar karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Çözeltiyi 200 mL'lik son hacim için ayarlayın. HPMC-SV'yi buzdolabında (4 °C) en fazla 3 ay saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>benznidazol<ol><li>Gerekli bileşik çözelti miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın: Bileşik çözelti hacmi = (her gündeki doz sayısı x gün sayısı x tedavi edilecek fare sayısı x her farede uygulanan hacim) +% 30 ekstra.</li>
		<li>İstenilen dozu göz önünde bulundurarak gerekli miktarda benznidazol (BZ) tartın. İyileştirici tedavi için, 10 gün boyunca günde bir kez 100 mg / kg'lık bir oral doz, CD kronik modelinde100% 100 iyileşme sağlar 17.</li>
		<li>İstenen nihai hacim göz önüne alındığında,% 5 (h / h) DMSO konsantrasyonuna ulaşmak için uygun miktarı hesaplayın ve BZ'yi saf DMSO'da tamamen çözün.</li>
		<li> </li><li></ol></li><li><ol><li><li></ol></li><li><ol><li><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li><li><li></li><li></li><li></ol><ol><li></li><li> </li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></li><li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig01v3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig01largev2.jpg" target="_blank"></a><ol><li> </li><li> </li><li></li><li></li><li></li><li><li> </li><li> </li><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li></li><li><li><li><li><ol><li> </li><li></li><li></li></ol></li><li></li><li></li><li></li><li><li><li> </li></ol><ol><li><ol><li> </li><li><li></li><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li> </li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></ol></li><li><ol><li><li><li></li><li> </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig02v3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig02largev2.jpg" target="_blank"></a><ol><li></li><li><li><li><li> </li></ol>

Chagas Hastalığı İlaç Değerlendirmesinin In Vivo Biyolüminesan Modeli için Protokol

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Biyolüminesans görüntüleme, görünür ve kızılötesi bir elektromanyetik radyasyon spektrumu kullanarak bir rapor geninin tespit edilmesini sağlayan çığır açan bir yöntemdir. Bu nedenle, numunenizi35 izlemek için radyoaktif işaretli işaretleyicilere gerek yoktur. BLI, kemirgen modelleri ve diğer küçük türler için uygundur. Klinik öncesi çalışmalar için çok faydalıdır çünkü daha güvenlidir ve birkaç görüntü turuna izin vererek minimum hayvan rahatsızlığına neden olur. Ayrıca, biyolüminesans, floresan ve pozitron emisyon tomografisi gibi diğer tekniklerin birleştirilme olasılığı nedeniyle in vivo görüntüleme çok esnektir36.
Optik görüntüleme, absorpsiyon ve saçılma gibi optik fiziksel özellikler tarafından yönetilir. Tüm dokular, farklı dalga boylarındaki ışığı farklı şekilde emer ve saçar37. Kritik bir adım, kimyasal reaksiyon tarafından üretilen ışığın yayılan dalga boyunu hesaba katmadan bir raportör gen seçmektir. Raportör gen ekspresyon seviyesi biyolüminesan deneylerde in vitro olarak yüksek olabilirken, in vivo ortama ilerlerken aynı ekspresyon seviyeleri elde edilemeyebilir. Bu protokolde, in vivo çalışmalar için en uygun olanlardan biri olan 617 nm'de ışık yayan tripanosomatidler9 için kırmızıya kaymış Photinus pyralis luciferase (PpyRE9H)38 kodonu optimize edilmiş versiyon kullandık39. 600 nm'den daha uzun dalga boyları, özellikle hemoglobin ve melanin olmak üzere vücut endojen kromoforları tarafından daha az emilir ve saçılır. Böylece, kırmızı ışıklar birkaç santimetre dokudan iletilebilir ve fotonların iç organların içinden bile CCD kameraya ulaşmasını sağlar39,40.
Görüntüleme ayarlarındaki endişe alanlarından biri, işlevlerinin ve etkilerinin kapsamlı bir şekilde anlaşılmamasıdır. Bir ön işleme tekniği olan gruplama, bitişik dedektörler tarafından elde edilen bilgileri daha büyük bir pikselde birleştirir. Bu işlem, sinyal-gürültü oranını artırarak arka plan gürültüsünü azaltır ve hassasiyeti artırır. Bununla birlikte, uzamsal çözünürlük doğruluğunu azaltarak pikselli bir görüntüyeneden olur 41,42. Bu değiş tokuş, görüntüleme stratejinizde önemli bir husustur.
Chagas hastalığı34 için Hedef Ürün Profili ve Hedef Aday Profiline dayanarak, kavram kanıtlama çalışması, T. cruzi'yi tespit etme ve yeni bir ilaç adayının steril bir tedavi sağlayıp sağlayamayacağını belirlemeye yardımcı olma duyarlılığına odaklanmıştır (birkaç immünosupresyon turundan sonra nüks eksikliği ile temsil edilir). Bu nedenle, görüntüyü aşırı doygunlaştırmadan en yüksek gruplama faktörünü kullanarak BLI'yi yürütürüz. Görüntü aşırı doygunluğa ulaştığında, daha düşük bir gruplama faktörü kullanılarak yeni bir alım gerçekleştirilir. Analiz sırasında, farklı gruplama gerektiren görüntülere matematiksel bir düzeltme uygulanır. Bu şekilde, nihai veriler aynı gruplama kullanılarak sunulmalıdır. Tablo 1 , aynı görüntüde ve ROI'lerde farklı gruplama faktörleri uygulandığında elde edilen farklı değerleri göstermektedir.
Tablo 1: Gruplama ayarlarının BLI niceliği üzerindeki etkisi. Akut model (d13) ve kronik model (d118) görüntüsünde üç ROI'nin ölçülmesi, farklı gruplama faktörlerinde analiz edildi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/DaSilvaetal_Table1_Reviewed.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Klinikte Chagas hastalığının mevcut senaryosu nedeniyle, ilaç keşif çabaları parazitleri tamamen ortadan kaldırmayı amaçlamaktadır (parazitolojik tedavi)27,34. Bu nedenle, in vivo preklinik protokol, BLI teknik duyarlılığının sınırlamalarının üstesinden gelen yaklaşımları içerir. Yaklaşımlardan biri, parazit yükünü kontrol eden bağışıklık tepkisini azaltmak için fareleri siklofosfamid ile tedavi etmektir. Başka bir strateji, doku derinliğini azaltmak ve kameraya giden ışık yolunu engelleyen kas, deri ve kürk katmanlarını çıkarmaktır. Ex vivo prosedür sayesinde, Posa ile tedavi edilen farenin ex vivo sonucu Şekil 5C'de gösterildiği gibi, in vivo BLI eşiğinin altında parazit odaklarını ortaya çıkaran küçük biyolüminesan noktalar tespit edilebilir.
Modelin kendisini ve enfeksiyon dinamiklerini değerlendirmek için bir pilot deney tasarlamak, antiparaziter ilaç etkinliği değerlendirmesi için doğru bir deney oluşturmak için çok önemlidir. Bu nedenle, araştırmacı uygun BLI ayarlarını ve enfeksiyon zaman seyrini önceden tanımlayabilecektir. Keşif amaçlı bir deneyde, edinim ayarlarını tanımlamaya yardımcı olabilecek bir araç 'Otomatik Pozlama'dır. Bu araçla araştırmacı, mümkün olan en iyi görüntüyü elde etmek için üç ayarın (Pozlama süresi, Gruplama ve F/Stop) önceliğini belirler. Özellikle, araştırmacı, görüntülerin CCD kameranın dinamik aralığı içinde, aşırı doygunluk veya düşük pozlama olmadan, ölçeğin ve otomatik pozlama özelliğinin minimum ve maksimum sınırları aracılığıyla kontrol edilebilen, elde edilmesini sağlamalıdır (Menü Düzenleme > Tercihler > Sekme Alma > Sekme Otomatik Pozlama). Bu protokolde, kamera açıklığı maksimum değere (F/Stop: 1) ayarlandı ve akut ve kronik modeller için farklı pozlama süreleri ve gruplama faktörleri tanımlandı. Bu ayarlar, aynı anda farklı görüntü turları gerçekleştirmek için zaman öngörülebilirliği sağlar. Raportör yönteminin bir enzimatik reaksiyona dayandığı göz önüne alındığında, hem substratın fareye biyolojik dağılımı hem de lusiferaz kinetiği, biyolüminesan sinyalini ve dolayısıyla enfeksiyon miktarını etkiler (Şekil 1B). Sonuç olarak, enzimatik kinetik momentlerinde görüntü elde etmek, açıklanamayan veya düzeltilemeyen veri değişkenliğini ortaya çıkarır ve toplam akı (fotonlar/saniye) veya parlaklık (fotonlar/saniye/cm2/steradyan) hesaplamasını etkiler. Ayrıca, T. cruzi enfeksiyonu farelerde dinamik uzamsal konumlandırma gösterir (farklı alanlar ve dokular, derinlik ve parazit yükü). Bu nedenle, elde edilecek sayımların bir değerini belirlemek, başka bir daha güçlü sinyalin kaynağı tanımlanan otomatik maruz kalma kriterlerini karşılıyorsa, daha zayıf sinyal kaynaklarını (dokunun daha derin bir noktasında düşük sayıda parazit) gözden kaçırabilir.
Living Image yazılımının zor bir özelliği, elde edilen görüntüyü otomatik bir renk ölçeğinde görüntülemektir. Seçilen ölçek değerlerine göre otomatik olarak yepyeni bir edinilmiş görüntüyü gösterecek şekilde ölçeği önceden ayarlama seçeneği yoktur (bkz. protokol adımı 6.2). Bu durum, araştırmacıyı görüntüleri tek tek manuel olarak seçilen maksimum ve minimum değerlere değiştirmeye zorlar. Sonuç olarak, deneyimsiz ve iyi eğitimli olmayan kullanıcılar, edinme oturumu sırasında uygun okumaya sahip olamazlar ve o noktada verileri yanıltabilir veya önemli bilgileri kaybedebilirler. Bunun için pilot deney faydalıdır.
Kavram kanıtı deney tasarımı ile ilgili en yaygın sorulardan biri, tedavi süresinin ve dozunun nasıl seçileceğidir. Yeni kimyasal varlıklar için, bu parametreler genellikle, ilaç metabolizması ve farmakokinetiği (DMPK) tarafından oluşturulan veriler ve etkinlik için in vivo testlerden önce yürütülen tolere edilebilirlik çalışmaları ile kombinasyon halinde, in vitro bileşik potens ve seçicilik ile tanımlanır. Özetle, hücrelerin içindeki paraziti seçici olarak öldürebilen bileşikleri belirledikten sonra, ilk ADME deneyleri (absorpsiyon, dağılım, metabolizma ve atılım), diğer parametrelerin yanı sıra bileşiklerin suda çözünürlüğünü, hücre geçirgenliğini ve metabolik stabilitesini tahmin etmek için in vitro olarak gerçekleştirilir. Bileşikler in vitro özelliklerin iyi bir dengesini gösteriyorsa (genellikle hedef aday profillerinde tanımlanır), bu adaylar sağlıklı farelerde in vivo farmakokinetik (PK) çalışmalara ilerletilir, bu da kandaki (ve muhtemelen dokularda) bileşik maruziyetini ana hatlarıyla belirtir ve farklı doz seviyelerinde tolere edilebilirlik hakkında genel bir fikir verir17, 34,43. İdeal olarak, çoğu bulaşıcı hastalıkta PK değerlendirmesinin amacı, EC50/EC90 konsantrasyonlarının44 üzerindeki serbest plazma konsantrasyonlarına (plazma protein bağlanması için düzeltilmiş) ulaşmanın fizibilitesini belirlemektir - parazitlerin sırasıyla %50 veya %90'ını öldüren veya en azından büyümesini engelleyen etkili konsantrasyon - yeterince uzun bir süre boyunca. Belirli bir doz seviyesinde yeterli maruziyet elde edilirse, bu rejim Chagas BLI modeli kullanılarak yapılan etkinlik çalışmaları sırasında kullanılabilir. İlaç yeniden konumlandırma çalışmaları için in vitro ve in vivo PK verileri mevcut olmalıdır. İlacın yeniden profillenmesi için iyi bir başlangıç, test edilecek güvenli ve toksik olmayan tedavi rejimlerini tahmin etmek için allometrik ölçeklendirme46 kullanılarak farelere dönüştürülebilen tanınmış veriler sağlayan PubChem45 gibi kimyasal veri tabanlarıdır. Ancak, bu her zaman böyle değildir. PK çalışmaları, akademik bilimde hala göz ardı edilen bir alandır ve çok az ilaç şirketi PK sonuçlarını yayınlamaktadır. İlaç keşfi bilim topluluğu, in vivo PK değerlendirmesinin yanı sıra ilaç etkinliği deneyleri (farmakodinamik) dahil edilmesini önermektedir47. Bu nedenle, klinik öncesi görüntüleme, eş zamanlı olarak bileşik ölçümlerle uyumludur ve bu ilişkili yaklaşım, veri sağlamlığını artırır.
Ek olarak, farelerin kullanımı, ağırlığı ve sağlık koşulları tüm deney boyunca izlenir. Kamburlaşma, titreme, denge kaybı, hareket etme isteksizliği, beslenmeye veya içmeye isteksizlik, secde veya grupta veya bireysel fare koşullarında mevcut olan diğer anormallikler gibi toksisite belirtileri ve yan etkiler klinik öncesi çalışmalarda kaydedilmeli ve rapor edilmelidir. Optik görüntülemenin amaçlarından biri de hayvanların refahını sağlamaktır. Bu nedenle, 'Yüz buruşturma ölçeği48'de açıklanan ağrı belirtileri olan farelerde insancıl uç noktalar uygulanmalıdır. Ayrıca, fareler BLI alımı sırasında ve daha sık olarak ilaç dozu ve CTX tedavisi sırasında haftalık olarak tartıldı. Hayvan refahı düzenlemelerine göre, vücut ağırlığının %20'sinden fazlasını kaybeden fareler derhal insancıl bir şekilde ötenazi yapılmalıdır.
T. cruzi biyolüminesan modeli, Chagas hastalığı için yeni tedavilerin keşfedilmesi ve geliştirilmesi için son teknoloji deneysel modeldir. T. cruzi enfeksiyonu ve Chagas hastalığı49'un temel özelliklerini çoğaltan, paraziteminin gerçek zamanlı izlenmesine ve bilinen etki modlarıyla ilişkili çeşitli etkinlik profillerine sahip bileşiklerin farklılaşmasına izin veren bir model. BLI, enfekte olmuş dokuları tanımlamada atılganlığı artıran bir tekniktir. Enfekte dokuların hassas seçiminin, T. cruzi araştırmasında50,51 halihazırda uygulanmış olan tüm klasik yöntemler de dahil olmak üzere çok çeşitli yaklaşımlarda kullanılmasını sağlar. Ek olarak, araştırmacıların en son teknolojileri keşfetmelerine ve yenilerini geliştirmelerine olanak tanır33. Ek olarak, BLI, aynı anda 3R ilkelerine10,35 göre hayvan refahının iyileştirilmesini ve daha rasyonel kullanımını sağlar.
İhmal edilen tropikal hastalıklara odaklanan birçok araştırma grubu, in vivo görüntüleme cihazlarının bulunmadığı ülkelerde yer almaktadır. Mevcut senaryonun üstesinden gelmek için, Global BioImaging ve ilgili konsorsiyumları gibi yeni uluslararası ağlar, görüntüleme çekirdek tesislerine açık erişim sağlamak ve personel ile görüntüleme bilimcilerinin eğitimini iyileştirmek için eylemleri teşvik etmektedir 52,53. Bu girişimler, bunun gibi kullanıcı dostu protokollerle birlikte, tüm araştırmacılar için üst düzey teknolojileri demokratikleştiren koşulları karşılayabilir. Bu yöntemin klinik öncesi ilaç keşfinde uygulanması, Chagas hastalığı için ilaç keşfini kolaylaştıran sağlam bir etkinlik okuması ve klinik sonucun prediktif değerini sunmuştur.

Chagas hastalığı Latin Amerika'da endemiktir ve dünya çapında yaklaşık yedi milyon insanı etkilemektedir1. Her yıl 50.000'den fazla ölüm ve yaklaşık 7 milyar dolarlık ekonomik kayıp, bu hastalığın engelleyici doğasından kaynaklanmaktadır2. Chagas hastalığına, vektörel iletimin kurulduğu Amerika'da memelileri (vahşi ve evcil) ve triatomin vektörlerini (Hemiptera, Reduviidae)3 enfekte edebilen heteroksenik bir hemoflagellat parazit olan protozoan Trypanosoma cruzi neden olur. Diğer önemli enfeksiyon yolları arasında kan transfüzyonu, organ nakli, oral (enfekte bir triatomin ile kontamine olmuş gıdaların yutulmasıyla)4 ve konjenital bulaşma yer alır. Vektörel olmayan bulaşma yolları, Chagas hastalığının endemik olmayan bölgelere yayılmasına katkıda bulunmuştur 3,5.
Chagas hastalığı iki klinik aşamada kendini gösterir. Akut faz çoğu durumda asemptomatiktir. Semptomatik enfeksiyonlar genellikle ateş, yorgunluk, kas ağrısı, lenfadenopati, splenomegali ve hepatomegali gibi spesifik olmayan belirtilerle ilişkilidir. Akut faz ayrıca sıklıkla patent parazitemisi ve parazitlerin sistemik dolaşımı ile ilişkilidir. Teşhis edilen vakaların %10 kadarında, özellikle oral enfeksiyon olanlarda ölüm meydana gelebilir6. Kronik faz genellikle herhangi bir semptomun uzun süre yokluğu ile karakterizedir. Zamanla, onlarca yıl önce enfekte olan hastaların yaklaşık üçte biri, genellikle fibroz ve miyokard iltihabının eşlik ettiği kardiyak bulgular ve/veya çoğunlukla megaözofagus ve/veya megakolon sendromlarının gelişimi ile ilişkili gastrointestinal bozukluklar sergiler 3,5,6.
Chagas hastalığının etiyolojik tedavisi sadece iki ilaçtan oluşur: benznidazol ve nifurtimox. Bu antiparaziter ajanlar 50 yılı aşkın bir süredir mevcuttur ve önemli toksisiteye ve sınırlı etkinliğesahiptir 5,7,8. Sonuç olarak, Chagas hastalığı hastaları için yeni, güvenli ve daha etkili tedaviler geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır.
Daha sofistike ve doğru teknikler, Chagas hastalığı için yeni tedaviler arayışında ilerlemelere izin veren eski soruların cevaplarını elde etmeyi mümkün kılmaktadır. Bu anlamda, bilim camiası, enfeksiyonun seyri ve ilaç etkinliğinin değerlendirilmesi üzerine in vivo çalışmalar için genetiği değiştirilmiş parazitlerden büyük ölçüde yararlanmaktadır 9,10,11,12. Biyolüminesans görüntüleme (BLI) sistemine dayalı uzunlamasına bir test, tedavi rejimi sırasında ve sonrasında etkinlik değerlendirmesine izin vererek, tripanosidal aktiviteye sahip bileşiklerin tanımlanmasına yol açar10,13. BLI yöntemi, genetik olarak değiştirilmiş T. cruzi CL Brener Luc::Neon soyu11 tarafından üretilen ışığın nicelleştirilmesi yoluyla hem dolaşımda hem de doku ve organlarda parazit yükünün doğrudan ölçümünü sağlar ve bu da kırmızıya kaymış ateşböceği lusiferaz12'yi yapısal olarak ifade eder.
Bununla birlikte, Chagas hastalığı BLI hayvan modelinin ve ilaç etkinliği çalışmalarının kurulmasından yaklaşık 10 yıl sonra, sadece birkaç araştırma grubu bu tekniğe hakimdir. Bu gerçek, yalnızca uygun görüntüleme ekipmanına erişimin azalmasından değil, aynı zamanda eğitim eksikliğinden ve yapılandırılmış, ayrıntılı protokollerin mevcudiyetinden de kaynaklanmaktadır. Bu yöntem, parazit DNA tespiti için mikroskopi, seroloji veya qPCR ile organ/doku enfeksiyonu değerlendirmesi ile paraziteminin değerlendirilmesine dayanan diğer yaklaşımlara göre çeşitli avantajlar sunar, çünkü farelerin refahını iyileştirir ve daha sağlam ve entegre in vivo veri üretme olasılığı ile hayvan kullanımının azaltılmasına izin verir. Ayrıca, bu yöntem, ilaç tedavisinden sonra iç organlardaki parazit odaklarının hazır tespitini sağladığı için tartışmasız daha hassastır10,12. Bu nedenle, bu protokol, Parazitoloji ve diğer enfeksiyon hastalıkları ile ilgili araştırma gruplarına, teknik prosedürleri detaylandırarak laboratuvarlarında bu metodolojiyi kurmaları için rehberlik etmeyi amaçlamaktadır. Burada, İhmal Edilen Hastalıklar için İlaçlar girişimi (DNDi) tarafından koordine edilen ilaç keşif çabalarının bir parçası olarak, Latin Amerika'da türünün ilk örneği olan Chagas hastalığı BLI modelinin Brezilya'da uygulanmasıyla elde edilen deneyimi paylaşıyoruz.

<table><tbody><tr><td>BD LSRFortessa ve ticaret; X-20 Hücre Analiz Cihazı</td><td>BD Biosciences Tartı Terazisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(hayvan tesisi)</td><td>Çeşitli tedarikçilerden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>IVIS Spectrum In Vivo Görüntüleme Sistemi</td><td>Revvity (eski PerkinElmer)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJ Yazılımı v10.7.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectrum v4.7.1</td><td>Revvity (eski PerkinElmer)</td><td></td> <td>için Canlı Görüntü Yazılımı'Aura Imaging' adlı Lisanssız Analiz Yazılımı, Spectral Instruments Imaging (Bruker şirketi) (https://spectralinvivo.com/software/)</td></tr><tr><td>Microsoft Office yazılımı</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism v8.4.0</td><td>GraphPad Software Inc.</td> tarafından sağlanan en temel özellikler için kullanılabilir.<td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM Düşük Glikoz</td><td>Vitrocell</td><td>D0025</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin% 0.5 EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>LIT orta</td><td>In ev</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Higromisin B (50 mg / mL)</td> <td>Gibco</td><td>10687010</td><td></td></tr><tr><td>Grace & prime; s Böcek Orta</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>G9771</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>IVISBrite d-lusiferin potasyum tuzu</td><td>Revvity (eski PerkinElmer)</td><td>122799</td><td>Ayrıca kullanılabilir: VivoGlo Luciferin, in vivo sınıf (Promega / P1043); D-Luciferin, Monopotasyum Tuzu (Thermo Scientific/88293) veya PierceD-Luciferin, Monosodyum* Tuzu (Thermo Scientific/88291); D-Luciferin, Potasyum Tuzu (GoldBio / LUCK veya eLUCK); D-Luciferin, Sodyum* Tuzu (GoldBio / LUCNA veya eLUCNA) * Sodyum veya potasyum tuzu farklılıkları, çözünürlüğe minimum şans verir, ancak in vivo performansı etkilemez.</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>21600-044</td><td></td></tr><tr><td>Siklofosfamid (CTX)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>C0768-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr> <tr><td>(Hidroksipropil) metil selüloz (HPMC)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>09963-25G</td><td></td></tr><tr><td>Benzil alkol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>402834</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P1754-1L</td><td></td></tr><tr><td>Benznidazol</td><td>ELEA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Posakonazol (Noxafil ticari formülasyonu)</td><td>Schering-Phough</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Giemsa</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>gavaj iğnesi (paslanmaz çelik düz) - 22GA</td><td>Aton</td><td>&nbsp; CA2003</td><td></td></tr><tr><td>1 mL Şırınga ve 31G iğne</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>1 mL Şırınga ve çıkarılabilir 26G iğne</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>1 mL Şırınga ve çıkarılabilir 24G X & frac34; iğne</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>Steril Şırınga Filtresi 0.2 ve mikro; m</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>A4 Mat Siyah kağıt 120gr veya daha kalın</td><td>Kağıt Rengi/ Canson (Birkaç tedarikçiden temin edilebilir)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alüminyum folyo</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td>temin edilebilir</tr><tr><td>Neubauer odası</td><td>Birkaç tedarikçiden</td><td></td><td></td> temin edilebilir</tr></tbody></table>

İlaç etkinliği Çalışmaları için bir chagas hastalığı fare modelinin in vivo biyolüminesans görüntülemesinin gizeminin Çözülmesi

Demystifying In Vivo Bioluminescence Imaging of a Chagas Disease Mouse Model for Drug Efficacy Studies

Chagas hastalığı, leishmaniasis ve insan Afrika tripanozomiyazisi gibi insan protozoan hastalıklarının halk sağlığı üzerindeki etkisini kontrol etmek ve azaltmak için yeni ilaçların ve aşıların geliştirilmesini hızlandırmak gereklidir. Bununla birlikte, bu süreç, oldukça karmaşık parazit biyolojisi ve hastalık patogenezi gibi zorluklarla doludur ve ihmal edilen tropikal hastalıklar için tipik olarak, araştırma ve geliştirme için nispeten sınırlı fonlar. Bu nedenle, in vitro ve in vivo kaynakların rasyonel kullanımını sağlarken enfeksiyon ve hastalığın temel özelliklerini yeterince yeniden üretebilen modeller, bu koşullar için araştırmaları ilerletmek için gereklidir. Bir örnek, lusiferaz eksprese eden Trypanosoma cruzi parazitleri tarafından üretilen uzun dalga boylu ışığın oldukça hassas bir şekilde tespit edilmesini sağlayan Chagas hastalığı için in vivo biyolüminesans görüntüleme (BLI) fare modelidir. Bu tekniğin in vivo çalışmalarda ilaç etkinliği için standart yaklaşım haline gelmesine rağmen, araştırma grupları, uygun BLI ekipmanı hazır olsa bile, ekipman kullanımı ve kalite kontrol prosedürlerinin uygulanması konusunda uygun pratik eğitim eksikliği nedeniyle bunu uygulamakta hala zorlanabilir. Bu senaryo göz önüne alındığında, bu protokol, Chagas hastalığı veya diğer bulaşıcı hastalık fare modelleri için BLI ile çok az deneyimi olan veya hiç deneyimi olmayan araştırma gruplarında protokollerin uygulanmasını kolaylaştıran ayrıntılarla, deneylerin planlanmasından veri toplama ve analizine kadar rehberlik etmeyi amaçlamaktadır.

Yapısal olarak lusiferazı eksprese eden transgenik parazitlere dayanan yeterli bir fare modeli kullanarak, konakçıya minimum zarara neden olan anahtar insan T. cruzi enfeksiyon özelliklerini yeniden üretmek mümkündür, bu da parazitlerin konakçının tüm vücut BLI'si ile uzunlamasına (ömür boyu) bir şekilde gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır, birkaç aya kadar12.
Şekil 3 , BALB/c farelerinde enfeksiyondan sonraki 1. günden 150 dpi'ye kadar CL Brener Luc::Neon enfeksiyonu zaman seyrini gösteren bir pilot deneyi göstermektedir. İlk 20 dpi'de, parazitemi zirvesine özgü biyolüminesans ile çıkarılan parazit yükü artar, bunu farelerin bağışıklık kontrolüne bağlı olarak parazit yükünde keskin bir azalma izler. Bu nedenle, enfeksiyonun akut fazı ilk 50 dpi olarak kabul edilir. Kronik faz, enfeksiyon 100-150 dpi arasında sabit bir biyolüminesan hızına ulaştığında tanımlanır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig03v2.jpg"> Şekil 3: Modeli anlama. Trypanosoma cruzi CL Brener Luc'un kinetiği::BALB/c farelerinde neon enfeksiyonu (n = 11). Üst panel: intraperitoneal enjeksiyon ile 1 x 10³ kan dolaşımı tripomastigotları ile enfeksiyon sonrası 150 gün (dpi) boyunca farklı zaman noktalarından ventral ve dorsal biyolüminesan görüntüler. Parlaklıkta (p/s/cm, 2/sr) biyolüminesan sinyalin ısı haritası ölçeği (Günlük10'da). Renk kodu: Mor = 5 x 103; kırmızı = 1 x 107. Alt panel: tüm vücut farelerinin Toplam Akısı (p/s) cinsinden biyolüminesan sinyal ölçümü. Veriler ortalamalar (çizgiler) ve standart sapmalar (gölgeli bölgeler) olarak ifade edilir. Bu fare modelinde enfeksiyonun akut ve kronik fazları için tanımlanan dönemler turuncu renkle vurgulanmıştır. Enfekte olmayan farelerin (n = 3) lüminesans ortalama değerleri eşik (açık gri çizgi) olarak gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Enfeksiyonun ana fazları bir fare modelinde iyi bir şekilde yeniden üretildiği için terapötik sonuçlar da tahmin edilebilir. Bu nedenle, BLI artık bileşik etkinlik potansiyeli ve geliştirme hattındaki ilerleme hakkında karar vermeyi destekleyen kavram kanıtı çalışmaları yoluyla çeviri bilimine uygulanmaktadır10,27. Akut fare modelinde, enfeksiyon parazitemi zirvesine ulaştığında (yaklaşık 14-21 dpi) oral tedaviye başlanmalıdır, bu da kan dolaşımında yüksek sayıda tripomastigot (yaklaşık 1 x 105 tripomastigot/mL - veriler gösterilmemiştir) ve sistemik enfeksiyon ile karakterize edilir. Kronik fazda, fare tedavisi, parazit yükünün nispeten çok daha düşük olduğu 100 dpi'de başlar ve stabil alt patent parazitemisi vardır.
Antiparaziter ajanların değerlendirilmesinde yukarıda tarif edilen protokolün uygulanmasını göstermek için, Chagas hastalığının tedavisinde kullanılan standart ilaç olan benznidazol (BZ) ve Chagas hastalığı için klinik çalışmalarda başarısız olan ve ayrıca T. cruzi'ye karşı antiparaziter ajan olarak etkisiz olduğu gösterilen bir sterol 14α-demetilaz (CYP51) inhibitörü olan posakonazolün (Posa) tedavi etkinliğini karşılaştırdık , bu protokolde açıklanan BLI modeli de dahil olmak üzere 13,18,28,29,30.
Akut fare modeli için, grup başına 6 fareden oluşan kohortlar, günde bir kez 20 mg / kg'da Posa veya 100 mg / kg'da BZ ile 20 gün boyunca gavaj31 ile oral olarak tedavi edildi. Fareler ayrıca kısa tedavilerin etkisini değerlendirmek için günde bir kez 100 mg / kg'da 5 gün boyunca BZ ile tedavi edildi. Bileşik eliminasyondan sonra (tedavi sona erdikten 10 gün sonra), BLI negatif fareler immünosuprese edildi, bu da parazitolojik bir tedavi sağlanamadığında enfeksiyonun nüksetmesini teşvik eden bir durumdur (Şekil 4A<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig04v3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig04largev2.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66740/66740fig05v3.jpg"> <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66740/66740eq01.jpg" style="margin: auto;"><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/66740fig05largev2.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Figure%201.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66740/daSilvaetal_Supplemental_Table1.zip" target="_blank"></a>

Burada sağlanan protokol, veri toplama, analiz ve yorumlamaya odaklanarak, Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans modelinde ilaç etkinliği çalışmaları gerçekleştirmek için ayrıntılı adımları açıklamaktadır. Teknik sorunları en aza indirmek için sorun giderme ve kalite kontrol prosedürleri de sağlanmaktadır.

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

To control and decrease the public health impact of human protozoan diseases such as Chagas disease, leishmaniasis, and human African trypanosomiasis, ...

demystifying-vivo-bioluminescence-imaging-chagas-disease-mouse-model

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Canlı bir Host Transgenik Leishmania Parazitlerinin in vivo Imaging

Bir roman olarak lusiferaz ve in vivo görüntüleme sistemleri (IVIS) olarak kullanılması klinik gelişmeler ortaya çıkmadan hastalığın bitiş noktaları tespit etmek anlamına gelir. IVIS bizim gelecekteki çalışma için daha doğru bir hastalık modeli sağlayan, gerçek zamanlı olarak birden fazla gün içinde encephalitic virüs istilasına görselleştirmek için izin verdi. Bu da bize daha hızlı şu anda kullanılan hayvan modellerinde daha antiviral ve aşıların potansiyel koruyucu özellikleri tanımlamak için...

Bir Nöro-İnvazif encephalitic Virüs Vivo Görüntüleme Sistemleri (IVIS) Algılama

Kaynak: Valentine, M. E. ve diğerleri, Pseudomonas aeruginosa'da Çerçeve İçi Gen Silinme Mutantlarının Üretimi ve Basit Fare Enfeksiyon Modelinde Virulans Zayıflamasının Testi. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, canlı bir fare modelinde bakteriyel enfeksiyonu izlemek için biyolüminesans tabanlı görüntüleme yaklaşımının kullanıldığını göstermektedir. Ardışık biyolüminesans ve X-ışını görüntüleme, konak genelinde yayılan enfeksiyonun gerçek zamanlı görselleştirmesi ve anatomik lokalizasyonu mümkün...

Biyolüminesans kullanarak fare modelinde bakteriyel enfeksiyonun gerçek zamanlı görüntülemesi

Biyoparlaklık görüntüleme tümörleri ve metastazları lokalize için iyi bilinen bir araçtır, ama bu görüntülerin miktar genellikle karmaşık hesaplamaları ve özellikle araçların gerektirir. Biz hiçbir hesaplamalar gerektiren ve tümör yükü ve tedavi yanıtı fare modellerinde izlenecek sağlayan hassas satın alma koşullarına göre, kolay kullanımlı luminoscore yöntem açıklanmaktadır.

Fare Lenfoma Modellerinde İzleme Tümör ilerleme ve Tedavi Etkileri Biyoparlaklık Tabanlı Tümör Niceleme Yöntemi

Bu el yazması, geç evre enfeksiyonun izlenmesini sağlamak için Afrika tripanozomlarının biyolüminesan bir suşunun kullanımını açıklar ve in vivo canlı görüntülemenin merkezi sinir sistemi içindeki enfeksiyonları gerçek zamanlı olarak görselleştirmek için nasıl kullanılabileceğini gösterir.

Biyoparlaklık Görüntüleme Afrika Trypanosomiasis Geç Evre Enfeksiyon Algılama için

Burada, L. infantum-Luc ile intraperitoneal (IP) veya intragingival (IG) enfekte olmuş altın hamsterlerin biyolüminesan görüntüleme ve PCR ile boylamsal bir değerlendirmesini sunuyoruz. Hamsterlar enfeksiyondan 1 gün sonra (1 dpi), enfeksiyondan 1 hafta sonra (8 dpi) ve enfeksiyondan 3 hafta sonra (22 dpi) değerlendirildi ve 50. dpi ve enfeksiyondan 8 ay sonra ötenazi yapıldı.

In vivo (İn canlı) Leishmania infantum ile Enfekte Hamsterlerin Luciferaz İfade Eden Aksenik Amastigotların Dişeti Aşılaması ile Görüntülenmesi

Burada, fare Kapkaççı lökosit homing çalışmada non-invaziv bir iki foton (2P) mikroskopi yaklaşımı açıklar. Biz, bizim doku görüntüleme hazırlık teknik yönlerini tartışmak ve yürütme ve veri toplama için kurulmuş ilk tipik bir deney yoluyla okuyucu yürümek.

Lökosit Homing Göç ve non-invaziv Görüntüleme In vivo</em

Mürin kemik iliği nakli insanlarda graft-versus-host hastalığı yöneten immünolojik mekanizmalarla çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. T hücre trafiğini modellerini izlemek için...

Graft-versus-host hastalığı indüksiyonu ve<em&gt; In Vivo</emBir MHC-eşlemeli murin Model Kullanma&gt; T Hücre İzleme

Parazit Tavuk Modelinde Genetik Driven Otoimmün Chagas Kalp Hastalığı Indüklenen

Güncel tanısal antimikrobiyal duyarlılık testi besin açısından zengin, aerobik koşullarda izolatların planktonik büyüme dayanır. Burada, kistik fibrozis akciğer daha fazla temsilcisi hem aerobik hem de mikroaerofilik şartlarda Pseudomonas aeruginosa biyofilmlerin antimikrobiyal duyarlılık incelemek için alternatif yapay balgam orta istihdam.

Karşı Antibiyotik Etkinlik Test Yapay Balgam Orta Kullanımı<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Kistik Fibrozis Akciğer Daha İlgili Koşullar

Keşfedin, farelerde Trypanosoma cruzi enfeksiyonunun biyolüminesans görüntüleme ile gerçek zamanlı izlenmesini. Bu protokol, antiparaziter ilaçların etkinliğini değerlendirmek ve parazitolojik iyileşmeyi sağlayan bileşikleri belirlemek için kullanılır.

İlaç Etkinliği Çalışmaları için Bir Chagas Hastalığı Fare Modelinin In Vivo Biyolüminesans Görüntülemesinin Gizeminin Çözülmesi

Daha fazla video keşfet