Semoreuin ve lipopolisakkarit intraperitoneal enjeksiyonunun bir kombinasyonu ile şiddetli akut pankreatitin bir fare modelinin hazırlanması

Şiddetli akut pankreatitin tedavisi, hayvan modelleri, özellikle C57BL / 6J seçilmiş arka plana sahip fareler kullanılarak yüksek ölüm oranları nedeniyle zordur. Terapötik hedefleri belirlemek ve yeni tedaviler geliştirmek için SAP'yi patolojik olarak araştırıyoruz ve bir SAP araştırmasında polimice yöntemi sağlıyoruz.

Bu araştırma, HMGB1 genlerinin pankreatit hasarının yüksek ekspresyonunu ortaya çıkardı ve bu da şiddetli akut pankreatitin enflamatuar taşı ile ilişkisini düşündürdü. Protokolümüz, safra kesesi kasılmasını indüklemek ve farelerde oruç tutmayı bozmak için Caerulein'i içerir, bu da sindirim sıvısı sekresyonunu bloke ederek pankreas dokusu hasarına yol açar. LPS enjeksiyonu ile birlikte, farelerde organ yetmezliği ile birlikte ciddi pankreatite neden olduk. Bu yaklaşım non-invazivdir ve kısa döngüler ve yüksek tekrarlanabilirlik ile uygulanması kolaydır.

[Gösterici] Başlamak için, deney faresinin ağırlığını ölçün ve kaydedin. Caerulein'in intraperitoneal enjeksiyonu için, fareyi göbeği yukarı bakacak ve başı kuyruktan daha aşağıda olacak şekilde tutun ve tutun. Şırıngayı sağ elinizde tutun ve iğneyi karın beyaz çizgisinin sol tarafındaki deri altı derisine sokun. İğneyi yaklaşık üç ila beş milimetre ileri doğru hareket ettirin ve 45 derecelik bir açıyla karın boşluğuna yerleştirin. İğneyi sabit tutun ve Caerulein'i yavaşça enjekte edin. İğneyi dışarı çekin, ardından ilacı karın boşluğuna tamamen yaymak için enjeksiyon bölgesine steril bir pamuklu çubukla hafifçe masaj yapın ve bastırın. Enjeksiyondan 12 saat sonra, fareyi deneyciden uzağa bakacak şekilde deney kutusundaki ızgaranın ortasına yerleştirin. Video izleme yazılımını açın ve izlemeyi aynı anda dört görüş alanı için ayarlayın. Gerçek zamanlı izleme ekranında kutu içinde hareket edebilen deney nesnesinin uzunluğunu ve genişliğini işaretleyin. Fare etkinliğini 15 dakika boyunca kaydedin. Beş döngü boyunca pankreas yaralanması fareleri modelinde ölçülen makroskopik değişiklikler, Pankreas Yaralanması Grubu 5'teki farelerin üç dakika içinde düşük bir hareket mesafesi seviyesini koruduğunu, üç dakika içindeki hareketsizlik oranının ise sonraki her döngüde arttığını gösterdi. Pankreas Yaralanması Grup 5, diğer deney gruplarına göre en küçük toplam hareket mesafesini gösterdi ve fark istatistiksel olarak anlamlıydı. Kontrol ve Pankreas Yaralanması Grup 1 hariç, tüm gruplar negatif D değeri kilo artışı gösterdi ve Pankreas Yaralanması Grubu 5 en büyük değişikliği gösterdi. Sağkalım oranı analizi, Kontrolden önemli bir fark göstermeyen diğer grupların aksine, Pankreas Yaralanması Grubu 5'te beşinci güne kadar% 80'lik bir mortalite oranı gösterdi. 36 saatlik intraperitoneal Caerulein enjeksiyonundan sonra, fareyi ötenazi yapın ve bir köpük plaka üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin. Abdominal medyan bir kesi yapın ve pankreası ortaya çıkarmak için ince bağırsak tüpünü sağa çevirin. Duodenum ve pilor kanalını ayırın. İnce bağırsağı pankreasın altına yerleştirin, ardından bağırsak kanalı boyunca pankreas dokusunu tamamen serbest bırakın. Dişsiz forseps kullanarak dalağı kelepçeleyin ve yavaşça yukarı doğru çekin. Posterior pankreas ligament dokusunu pankreasın başına kadar keskin bir şekilde inceleyin. Ardından safra kanalını ve kan damarlarını ayırın. Pankreas dokusunu karın boşluğundan çıkarın ve yüzeydeki nemi emici kağıtla kurulayın. Pankreas dokusunun ağırlığını ölçün ve kaydedin. Parafin kesitlerini hazırladıktan sonra, pankreas dokularını her biri beş dakika boyunca ksilen içinde iki kez mumdan arındırın. Her bölüme 100 mikrolitre proteinaz K uygulayın ve 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin. Dokuya gerekli miktarda% 3 hidrojen peroksit ekleyin ve tamamen sızması için 20 dakika inkübe edin. Numunenin tüm alanını 50 mikrolitre dengeleme tamponu ile kaplayın ve 10 dakika inkübe edin. Daha sonra her doku örneğine 56 mikrolitre TDT inkübasyon tamponu ekleyin ve bir saat inkübe edin. 100 mikrolitre Streptavidin-HRP reaksiyon çözeltisinde 30 dakika inkübe etmeden önce doku bölümlerini PBS ile dört kez beş dakika yıkayın. DAB boyama için, her doku bölümüne 50 mikrolitre DAB ekleyin. Saf su ile durulamadan önce bölümleri üç ila beş dakika hematoksilen boyama çözeltisine batırın. Numuneleri her biri beş dakika boyunca dört tur taze susuz etanol ile kurutun. Beyaz ışık mikroskobu altında histolojik bir inceleme yapın. Farelerin pankreas dokuları üzerindeki TUNEL boyama, Pankreas Yaralanması Grup 5'te hücresel nekrozda bir artış olduğunu ve diğer gruplara kıyasla önemli ölçüde daha yüksek gri skala değerleri ve pozitif nekroz oranları olduğunu ortaya koydu. Protein immünoblotlama, hücresel nekrozun bir belirteci olan Kaspaz-3 ekspresyonunu değerlendirdi ve Pankreas Hasarı Grup 5 dokularında önemli bir artış gösterdi. Nexin 5 uyumlu CPI ile etiketlenmiş pankreas asiner hücre süspansiyonlarının akış sitometrisi, Pankreas Yaralanması Grup 5'te diğerlerine kıyasla istatistiksel olarak anlamlı şekilde önemli ölçüde daha yüksek bir hücre ölüm oranına işaret etti.