Name: İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:35:00.000+00:00
Duration: 5 min 59 s
Description: Keşfedin insan intermüsküler yağ dokusundan çekirdek izolasyonu ve tek çekirdekli RNA dizileme yöntemini. Bu protokol metabolik hastalıklarda hücresel değişiklikleri analiz etmeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Colorado Üniversitesi'nden Dr. Bryan Bergman'a, MoTrIMAT çalışmasından (R01AG077956) Şekil 1C'deki IMAT biyopsisinin görüntüsünü sağladığı için teşekkür eder. Kas, Mobilite ve Yaşlanma Çalışması'na, temsili sonuçlar bölümünde verilerin gösterildiği IMAT örneğini sağladığı için minnettarız. Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA), Kas, Hareketlilik ve Yaşlanma Çalışmasını (SOMMA; R01AG059416) ve yardımcı çalışmaları SOMMA AT (R01AG066474) ve SOMMA Knee OA (R01AG070647). Çalışma altyapısı desteği kısmen Pittsburgh Üniversitesi (P30AG024827) ve Wake Forest Üniversitesi'ndeki (P30AG021332) NIA Claude D. Pepper Eski Amerikan Bağımsızlık Merkezleri ve Wake Forest Üniversitesi'ndeki Ulusal Translasyonel Bilimi Geliştirme Merkezi tarafından finanse edilen Klinik ve Translasyonel Bilim Enstitüleri tarafından finanse edildi (UL1 0TR001420).

Bu protokol için kullanılan örnek, Batı IRB-Copernicus Grubu (WCG) Kurumsal İnceleme Kurulu tarafından onaylanan ve Helsinki Bildirgesi'ne uygun olarak yürütülen Kas, Hareketlilik ve Yaşlanma Çalışması'nın (SOMMA)15 bir parçasıydı. Katılımcılar, çalışmaya katılımları için yazılı bilgilendirilmiş onam verdiler.
NOT : Bu protokol, nanowell bazlı bir platformda 100 mg insan abdominal deri altı yağ dokusu kullanılarak önceki bir protokolden uyarlanmıştır16. Mevcut protokol, damlacık tabanlı bir platform kullanılarak 50 mg insan IMAT ve kütüphane hazırlığı için optimize edilmiştir. İnsan dışı IMAT veya diğer yağ depolarından çekirdek izolasyonları için bu protokolün daha fazla optimizasyonu gerekebilir.
1. Tamponların ve reaktiflerin hazırlanması (Tablo 1 ve Tablo 2)
NOT: Deney günü tamponları taze olarak hazırlayın ve tekrar kullanmayın.
<ol><li>Bir santrifüjü 4 °C'ye kadar önceden soğutun.</li>
	<li>Homojenizasyon tamponu ve çekirdek izolasyon ortamı hazırlayın.<ol><li>İki kova buz alın ve 2 x 15 mL konik tüpleri önceden soğutun.</li>
		<li>Homojenizasyon tamponu (HB) için tüm reaktifleri 15 mL'lik bir konik tüpte Tablo 1'de listelenen sırayla karıştırın. Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.</li>
		<li>Çekirdek izolasyon ortamı (NIM) için tüm reaktifleri Tablo 2'deki sıralı listede 15 mL'lik bir konik tüpte karıştırın. Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.</li>
		<li>900 μL Nukalaz içermeyen suya 100 μL Triton X-100 ekleyerek Triton-X hazırlayın. Uygun karışımı sağlamak için girdap. Oda sıcaklığında (RT) saklayın.</li>
	</ol></li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Reaktif</td>
			<td colspan="2">Hacim (μL)</td>
			<td rowspan="2">Nihai konsantrasyon (mM)</td>
		</tr><tr><td>1 katı</td>
			<td>2 katı</td>
		</tr><tr><td>1 M MgCl2</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>1 m Tris tamponu, pH 8.0</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>2 milyon KCl</td>
			<td>25</td>
			<td>50</td>
			<td>25</td>
		</tr><tr><td>1,5 m sükroz (-4oC)</td>
			<td>334</td>
			<td>668</td>
			<td>250</td>
		</tr><tr><td>1 milyon DTT</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
			<td>0,001 (~1 μM)</td>
		</tr><tr><td>100x proteaz inhibitörü</td>
			<td>20</td>
			<td>40</td>
			<td>1 katı</td>
		</tr><tr><td>Süperasin 20 U/μL</td>
			<td>40</td>
			<td>80</td>
			<td>0,4 U/μL</td>
		</tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td>
			<td>1549</td>
			<td>3098</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Toplam Hacim</td>
			<td>2000</td>
			<td>4000</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Homojenizasyon tamponu (HB). Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2">Reaktif</td>
			<td colspan="2">Hacim (μL)</td>
			<td rowspan="2">Nihai konsantrasyon (mM)</td>
		</tr><tr><td>1 katı</td>
			<td>2 katı</td>
		</tr><tr><td>EDTA</td>
			<td>0.4</td>
			<td>0.8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr><tr><td>Ribolock RNAse inhibitörü (40U/μL)</td>
			<td>40</td>
			<td>80</td>
			<td>0,8 U/μL</td>
		</tr><tr><td>%1 BSA-PBS (-/-)</td>
			<td>1959.6</td>
			<td>3919.2</td>
			<td>-</td>
		</tr><tr><td>Toplam Hacim</td>
			<td>2000</td>
			<td>4000</td>
			<td>-</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Çekirdek izolasyon ortamı (NIM). Buz üzerinde tutun. Girdap yaparak karıştırın.
2. Donmuş dokunun pulverizasyonu ( Şekil 2A)
<ol><li>Homojenizasyon için iş istasyonunu kurun.<ol><li>Kutuyu sıvı nitrojen (LN2) ile doldurun. DİKKAT: LN2 ile çalışırken daima gözlük ve kriyo eldiven kullanın.</li>
		<li>Otomatik douncer için 2 adet havan, 1 adet havan tokmağı, 1 adet mikro kepçe spatula, 1 adet cam don ve 1 adet paslanmaz çelik havan tokmağı edinin.</li>
		<li>Otomatik douncer'ı ayarlayın.</li>
		<li>Bir kabı buzla doldurun ve cam dounce'u önceden soğutun.</li>
	</ol></li>
	<li>Aletleri soğutmak için 2 havan topunu (havan tokmağı ve spatula içeren) LN2 ile doldurun. LN2'nin buharlaşmasına izin verin ve tekrarlayın.</li>
	<li>Aletler soğurken cam doza 1 mL HB ekleyin.</li>
	<li>Her iki harcı da son bir kez LN2 ile doldurun ve 50 mg IMAT numunesini havanlardan birine dökün.</li>
	<li>Havaneli kullanarak IMAT'ı küçük parçalara ayırmak için doku parçasına hafifçe bastırarak toz haline getirin. Tüm parçaların toz haline getirildiğinden emin olun.</li>
	<li>LN2 , dokuyu toz haline getirirken yavaşça buharlaşacaktır. Doku düzgün bir şekilde toz haline getirildiğinde ve hala LN2'lik bir harcın 1/4 - 1/2'si kaldığında, toz haline getirilmiş dokuyu dudaktan toplamak için harcı harcın dudağına doğru eğin. LN2'nin tamamen buharlaşmasına izin verin.</li>
	<li>Son LN2 buharlaştıktan hemen sonra, toz haline getirilmiş dokuyu 1 mL HB içeren cam dounce içine alın.</li>
</ol>3. Toz haline getirilmiş dokunun homojenizasyonu
<ol><li>Otomatik douuncer kullanarak toz haline getirilmiş dokuyu homojenize edin. Cam dounce'ı paslanmaz çelik havaneli üzerinde ileri yönde 10 vuruş, ardından ters yönde 10 vuruş boyunca yukarı ve aşağı getirin.</li>
	<li>Homojenizasyondan sonra çözeltinin bulanık olduğundan ve görünür doku parçası içermediğinden emin olun. Kas dokusu ile kontaminasyon nedeniyle genellikle açık pembe bir renk beklenir.</li>
	<li>Homojenatı buz üzerinde önceden soğutulmuş 1,7 mL düşük bağlayıcı bir tüpe aktarın.</li>
	<li>Tüm malzemenin aktarıldığından emin olmak için dounce'u durulamak için 400 μL HB kullanın ve tüpe ekleyin. NOT: Aynı anda iki numune işlenebilir. Bunu yapmak için, HB ve NIM miktarını iki katına çıkarın. Bir doku örneğini toz haline getirin ve homojenize edin ve hemen ardından izolasyon ve temizleme adımlarını paralel olarak gerçekleştirebilmek için ikinci doku örneğini toz haline getirin ve homojenize edin.</li>
</ol>4. Çekirdek izolasyonu ve temizlenmesi (Şekil 2B)
<ol><li>%0,1'lik bir konsantrasyon için homojenata 14 μL Triton-X () ekleyin.</li>
	<li>Tüpü buz üzerinde ve karanlıkta 10-15 dakika tutun ve her 3 dakikada bir girdap yapın.</li>
	<li>50 mL'lik bir konik tüpte her biri için 100 μL RT DPBS ile bir adet 100 μm ve bir adet 40 μm hücre süzgecini (numune başına) önceden ıslatın.</li>
	<li>Homojenatı 100 μm hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>1.7 mL'lik tüpü 400 μL HB ile durulayın ve 100 μm'lik hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Ardından, çözeltiyi 40 μm hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Her tüpte ~900 μL'ye karşılık gelen iki önceden soğutulmuş 1.7 mL düşük bağlı tüpe eşit miktarda çözelti aktarın.</li>
	<li>Tüpleri 4 ° C'de 2700 x g'de 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra görülebilen küçük bir pelet olmalıdır.</li>
	<li>Üst lipit tabakasını ve kalan süpernatanı çıkarın ve atın, ilk tüpten ~ 50 μL çözelti bırakın.</li>
	<li>İkinci tüp için tekrarlayın.</li>
	<li>20 kat yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek ilk tüpteki peleti iyice yeniden süspanse edin ve yeni bir 1,7 mL düşük bağlamalı tüpe aktarın. Baloncuk oluşturmaktan kaçının.</li>
	<li>İkinci tüp için bu prosedürü tekrarlayın ve yeniden süspanse edilmiş çözeltiyi aynı tüpe aktarın.</li>
	<li>500 μL NIM ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.</li>
	<li>Tüpü 1000 x g'da bir terazi ile 4 °C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.</li>
	<li>~50 μL bırakarak süpernatanı çıkarın ve pelet yeniden askıya alınana kadar hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. İsteğe bağlı olarak, tüpün yan tarafında bir miktar lipit kalıntısı kalırsa, yeniden askıya alınan peleti yeni bir temiz tüpe aktarın.</li>
	<li>200 μL NIM ekleyin ve pipetleme ile karıştırın.</li>
</ol>5. Çekirdek boyama ve sayım (Şekil 2C ve Şekil 3)
NOT : Sayımı kolaylaştırmak için, parlak alanı ve DAPI kanallarını ayarlamak sayımı büyük ölçüde etkileyebileceğinden, otomatik bir hücre sayacında bir 'çekirdek sayma' protokolü ayarlayın. Kanalları, enkaz değil yalnızca çekirdekler yakalanacak şekilde ayarlayın. Parlak alan kanalının yalnızca DAPI lekesi olan 'nesneleri' işaretlediğinden emin olun.
<ol><li>1 damla canlı hücre boyama solüsyonu ekleyin ve karanlıkta, buz üzerinde 15 dakika bekletin.</li>
	<li>Çözeltiyi 30 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.</li>
	<li>Çekirdek çözeltisini pipetleme ile karıştırın ve 10 μL çözeltiyi bir hücre sayma odası slaytına ekleyin.</li>
	<li>Otomatik bir hücre sayacı kullanarak çekirdekleri sayın. NOT: Optimal konsantrasyon, 1.0 x 106/mL'ye karşılık gelen 1000 çekirdek/μL'dir.<ol><li>Çekirdek yığınlarının bulunmadığından emin olun, çünkü bu, tek çekirdek damlacıkları oluşturmak için çipi tıkayabilir (Şekil 3).</li>
		<li>Çekirdek konsantrasyonu yeterince yüksek değilse, bir pelet elde etmek için çözeltiyi 1000 ° C'de 10 dakika boyunca 4 x g'da döndürün, süpernatantı çıkarın ve daha küçük bir hacimde yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Çözeltideki kalıntı derecesi yüksekse, çekirdek çözeltisini daha büyük bir NIM hacminde (yani 1 mL) yeniden süspanse edin ve tekrar 30 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün. Daha sonra 4 ° C'de 10 dakika boyunca 1000 x g'da döndürün ve çekirdek konsantrasyonuna göre uygun hacimde yeniden süspanse edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Çekirdek konsantrasyonunu elde ettikten sonra, doğrudan kütüphane hazırlığındaki ilk adıma geçin.</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig03.jpg"> Şekil 3: İzole edilmiş çekirdeklerin boyanması. NucBlue/DAPI ile boyanmış çekirdeklerin hücre sayacından alınan görüntü (soldaki resim) ve karşılık gelen parlak alan görüntüsü (sağdaki resim). Parlak alan görüntüsünde az miktarda döküntü varlığı belirgindir. Burada kullanılan otomatik hücre sayacının ölçek çubukları ekleme seçeneği yoktur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
6. Kütüphane hazırlama ve sıralama parametreleri
<ol><li>Sağlayıcının web sayfasında17 bulunan damlacık tabanlı tek çekirdek yaklaşımını kullanarak kitaplık hazırlığı için kapsamlı bir protokole bakın.<ol><li>10.000'lik hedeflenen bir çekirdek geri kazanımını hedefleyin. Bununla birlikte, yüksek düzeyde döküntü veya kırılgan çekirdeğe sahip numuneler için, daha az sayıda çekirdeğin geri kazanılması beklenecektir.</li>
		<li>Numuneleri 4°C'de 2.3. adımdan sonra 72 saate kadar saklayın. Kütüphane hazırlama protokolünde paralel olarak daha fazla örneğin işlenmesini birleştirmek için. Bunu, art arda iki günde 2.3 adımına kadar iki örneği işleyerek yapın ve üçüncü günde, 4 örneği 3. adımdan itibaren kütüphane hazırlama protokolünde birlikte işleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Sıralama parametreleri: Çekirdek başına 50.000 çift uçlu okumayı hedefleyen bir sıralama platformundaki dizi. NOT: Bu protokolde sunulan veriler, çekirdek başına 50.000 çift uçlu okuma hedeflenerek NovaSeq 6000 platformunda sıralanmıştır.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig02.jpg"> Şekil 2: Protokol iş akışı. Protokolün (A) 2. ve 3. adımlarında, (B) 4. adımında ve (C) 5. adımında iş akışının şematik gösterimi. Figür BioRender.com ile oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
7. Veri işleme ve analizi
NOT : Bu protokolde, elde edilen sıralama verilerini işlemek için kullanılan önerilen yazılımlardan ve R paketlerinden bazıları, ilk ön işlemeden sonraki adımlara odaklanılarak kısaca tanıtılmaktadır (Tablo 3). Bu çalışma, Şekil 4'te genel kalite kontrol (QC) metrikleri ve örnek bir tekdüze manifold yaklaşımı ve projeksiyonu (UMAP) sağlar. Bununla birlikte, biyoinformatik analizin derinlemesine bir açıklaması bu protokolün kapsamı dışındadır. Bu nedenle okuyucular, Heumos ve ark.18 tarafından tek hücre analizi için en iyi uygulamalar hakkındaki son incelemeye başvurabilirler.
<ol><li>Sıralama verilerinin ön işlenmesi<ol><li>Tek çekirdek okumalarını insan referans genomu GRCh38 ile eşleştirin.</li>
		<li>Sayıma intron okumalarını dahil edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Seurat R paketi19'u kullanarak verilerin QC'sini ve filtrelemesini gerçekleştirin.<ol><li>Algılanan log(10) gen sayısını, algılanan log(10) okuma sayısına bölerek bir hücre karmaşıklık puanı hesaplayın.</li>
		<li>Çekirdek başına tespit edilen gen sayısı, mitokondriyal okuma yüzdesi ve hücre karmaşıklığı puanı dahil olmak üzere bir histogram veya keman grafiği kullanarak en önemli QC ölçümlerini çizin.</li>
		<li>Çekirdek başına 200'den az veya 10.000'den fazla gen, 'dan fazla mitokondriyal okuma ve 0.8'in altında bir karmaşıklık puanı olan çekirdekleri filtreleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Verileri normalleştirin ve boyutsallığı azaltın.<ol><li>2000 değişken özelliği kullanarak verileri normalleştirmek için Seurat'ın SCTransform işlevini kullanın.</li>
		<li>Seurat R paketinden aşağıdaki işlevleri kullanarak verileri kümeleyin: RunPCA, FindNeighbors, FindClusters ve RunUMAP.</li>
		<li>Verilerin kümelenmesini görselleştirmek için bir UMAP çizin.</li>
	</ol></li>
	<li>DoubletFinder R paketi20'yi kullanarak tahmin edilen çiftleri filtreleyin ve verileri yeniden kümeleyin.</li>
	<li>Dokuda bulunması beklenen hücre tiplerinin bilinen gen belirteçlerini kullanarak (denetimli yaklaşım) veya kümeler arasında diferansiyel olarak ifade edilen ilk 5 gene dayalı olarak (denetimsiz yaklaşım) kümeleri açıklayın.</li>
	<li>Ortam RNA kontaminasyonunun derecesini belirlemek ve ortam RNA'sı için gen ekspresyon matrisini ayarlamak için decontX21'ikullanın.<ol><li>Ham gen matrisini arka plan olarak ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Verilerin gelecekteki keşfi için Seurat nesnesini kaydedin. NOT: Kalite kontrol ve kümeleme analizi için kod Ek Dosya 1'de mevcuttur.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Veri iş akışında kullanılan yazılım/R paketleri</td>
			<td>Alternatif yazılımlar/paketler</td>
			<td>İşleme adımı</td>
		</tr><tr><td>Hücre Korucusu</td>
			<td>STARsolo, kallisto</td>
			<td>Kırpma, hizalama, eşleme</td>
		</tr><tr><td>Seurat</td>
			<td>SingleCellExperiment, Cellranger</td>
			<td>Kalite kontrol, analiz ve veri keşfi</td>
		</tr><tr><td>Çift Bulucu</td>
			<td>scds, scdblFinder, Scrublet</td>
			<td>Çift algılama</td>
		</tr><tr><td>DecontX</td>
			<td>ÇorbaX, Hücre Bükücü</td>
			<td>Ortam RNA ayarı</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Veri iş akışı için yazılım/araçlar.

Gen Ekspresyon Profillerinin İncelenmesi için IMAT'ten Tek Hücre Çekirdeği İzolasyonu 

<ol><li>Goodpaster, B. H., Bergman, B. C., Brennan, A. M., Sparks, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+adipose+tissue+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intermuscular adipose tissue in metabolic disease.</a> Nat Rev Endocrinol. 19 (5), 285-298 (2023).</li>
<li>Sparks, L. M., Goodpaster, B. H., Bergman, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolic+significance+of+intermuscular+adipose+tissue%3A+Is+IMAT+a+friend+or+a+foe+to+metabolic+health%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">The metabolic significance of intermuscular adipose tissue: Is IMAT a friend or a foe to metabolic health.</a> Diabetes. 70 (11), 2457-2467 (2021).</li>
<li>Gallagher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+in+muscle%3A+A+novel+depot+similar+in+size+to+visceral+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue in muscle: A novel depot similar in size to visceral adipose tissue.</a> Am J Clin Nutr. 81 (4), 903-910 (2005).</li>
<li>Manini, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+physical+activity+increases+intermuscular+adipose+tissue+in+healthy+young+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Reduced physical activity increases intermuscular adipose tissue in healthy young adults.</a> Am J Clin Nutr. 85 (2), 377-384 (2007).</li>
<li>Addison, O., Marcus, R. L., LaStayo, P. C., Ryan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+fat%3A+A+review+of+the+consequences+and+causes%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Intermuscular fat: A review of the consequences and causes.</a> Int J Endocrinol. 2014, 309570(2014).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Arch Intern Med. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> Am J Clin Nutr. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Sachs, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermuscular+adipose+tissue+directly+modulates+skeletal+muscle+insulin+sensitivity+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Intermuscular adipose tissue directly modulates skeletal muscle insulin sensitivity in humans.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 316 (5), E866-E879 (2019).</li>
<li>Ford, H., Liu, Q., Fu, X., Strieder-Barboza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((White+adipose+tissue+heterogeneity+in+the+single-cell+era%3A+From+mice+and+humans+to+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">White adipose tissue heterogeneity in the single-cell era: From mice and humans to cattle.</a> Biology (Basel). 12 (10), 1289(2023).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+bulk+RNA+sequencing+reveal+cellular+and+transcriptional+mechanisms+underlying+lipid+dynamics+in+high+marbled+pork%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Sci+Food%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and bulk RNA sequencing reveal cellular and transcriptional mechanisms underlying lipid dynamics in high marbled pork.</a> NPJ Sci Food. 7 (1), 23(2023).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+diverse+cell+populations+in+skeletal+muscles+and+biomarkers+for+intramuscular+fat+of+chicken+by+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of diverse cell populations in skeletal muscles and biomarkers for intramuscular fat of chicken by single-cell RNA sequencing.</a> BMC Genomics. 21 (1), 752(2020).</li>
<li>Lyu, P., Qi, Y., Tu, Z. J., Jiang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+heterogeneity+of+cultured+bovine+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals heterogeneity of cultured bovine satellite cells.</a> Front Genet. 12, 742077(2021).</li>
<li>Fitzgerald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MME%2B+fibro-adipogenic+progenitors+are+the+dominant+adipogenic+population+during+fatty+infiltration+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">MME+ fibro-adipogenic progenitors are the dominant adipogenic population during fatty infiltration in human skeletal muscle.</a> Commun Biol. 6 (1), 111(2023).</li>
<li>Cummings, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+study+of+muscle%2C+mobility+and+aging+%28SOMMA%29%3A+A+unique+cohort+study+about+the+cellular+biology+of+aging+and+age-related+loss+of+mobility%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">The study of muscle, mobility and aging (SOMMA): A unique cohort study about the cellular biology of aging and age-related loss of mobility.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 78 (11), 2083-2093 (2023).</li>
<li>Whytock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+nuclei+from+frozen+human+subcutaneous+adipose+tissue+for+full-length+single-nuclei+transcriptional+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of nuclei from frozen human subcutaneous adipose tissue for full-length single-nuclei transcriptional profiling.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102054(2023).</li>
<li>10x Genomics. Chromium Single Cell 3' Reagent Kits User Guide (v3.1 Chemistry Dual Index), Document Number CG000315 RevE. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf">https://cdn.10xgenomics.com/image/upload/v1668017706/support-documents/CG000315_ChromiumNextGEMSingleCell3-_GeneExpression_v3.1_DualIndex__RevE.pdf</a> (2022).</li>
<li>Heumos, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+single-cell+analysis+across+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Best practices for single-cell analysis across modalities.</a> Nat Rev Genet. 24 (1), 550-572 (2023).</li>
<li>Hao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictionary+learning+for+integrative%2C+multimodal+and+scalable+single-cell+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Dictionary learning for integrative, multimodal and scalable single-cell analysis.</a> Nat Biotechnol. 42 (2), 293-304 (2023).</li>
<li>McGinnis, C. S., Murrow, L. M., Gartner, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DoubletFinder%3A+Doublet+detection+in+single-cell+RNA+sequencing+data+using+artificial+nearest+neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">DoubletFinder: Doublet detection in single-cell RNA sequencing data using artificial nearest neighbors.</a> Cell Syst. 8 (4), 329-337 (2019).</li>
<li>Yang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decontamination+of+ambient+RNA+in+single-cell+RNA-seq+with+DecontX%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Decontamination of ambient RNA in single-cell RNA-seq with DecontX.</a> Genome Biol. 21 (2), 57(2020).</li>
<li>Common considerations for quality control filters for single cell RNA-seq data. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data">https://www.10xgenomics.com/analysis-guides/common-considerations-for-quality-control-filters-for-single-cell-rna-seq-data</a> (2022).</li>
<li>Luecken, M. D., Theis, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+best+practices+in+single-cell+RNA-seq+analysis%3A+a+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Syst+Biol%22%5BJournal%5D)">Current best practices in single-cell RNA-seq analysis: a tutorial.</a> Mol Syst Biol. 15 (6), e8746(2019).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Whytock, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+full-length+transcriptome+of+human+subcutaneous+adipose+tissue+reveals+unique+and+heterogeneous+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Single cell full-length transcriptome of human subcutaneous adipose tissue reveals unique and heterogeneous cell populations.</a> iScience. 25 (8), 104772(2022).</li>
<li>Probst, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+full-length+transcript+single+cell+mRNA+sequencing+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking full-length transcript single cell mRNA sequencing protocols.</a> BMC Genomics. 23 (1), 860(2022).</li>
<li>CG000148 Rev A Technical Note - Resolving cell types as a function of read depth and cell number. Technical note. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf">https://assets.ctfassets.net/an68im79xiti/6gDArDPBTOg4IIkYEO2Sis/803be2286bb a5ca67f353e6baf68d276/CG000148_10x_Technical _Note_Resolving_Cell_Types_as_Function_of_ Read_Depth_Cell_Number_RevA.pdf</a> (2018).</li>
<li>Gupta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+transcript+enrichment+and+detection+bias+in+single-nucleus+RNA-seq+for+mapping+of+distinct+human+adipocyte+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of transcript enrichment and detection bias in single-nucleus RNA-seq for mapping of distinct human adipocyte lineages.</a> Genome Res. 32 (2), 242-257 (2022).</li>
<li>Bakken, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-nucleus+and+single-cell+transcriptomes+compared+in+matched+cortical+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types.</a> PLoS One. 13 (12), e0209648(2018).</li>
<li>Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+of+single-nucleus+over+single-cell+RNA+sequencing+of+adult+kidney%3A+Rare+cell+types+and+novel+cell+states+revealed+in+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: Rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis.</a> J Am Soc Nephrol. 30 (1), 23-32 (2019).</li>
<li>Kim, N., Kang, H., Jo, A., Yoo, S. -A., Lee, H. -O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+single-nucleus+RNA+sequencing+in+different+cell+types+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Perspectives on single-nucleus RNA sequencing in different cell types and tissues.</a> J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).</li>
<li>Avila Cobos, F., Alquicira-Hernandez, J., Powell, J. E., Mestdagh, P., De Preter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+of+cell+type+deconvolution+pipelines+for+transcriptomics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Benchmarking of cell type deconvolution pipelines for transcriptomics data.</a> Nat Commun. 11 (1), 5650(2020).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

IMAT ile çalışmanın doğasında var olan birçok zorluk vardır. Sınırlı erişilebilirliğine ek olarak, numune materyalinin verimi genellikle çok azdır ve iskelet kasının "kontaminasyonundan" kaçınmak neredeyse imkansızdır. En kaliteli numuneyi elde etmek için, biyopsi iğnesi yerleştirilirken (deri altı yağ dokusunun toplanmadığından emin olmak için) kas fasyasına nüfuz edilmeli ve numuneyi alındıktan hemen sonra mikroskop altında diseksiyon yaparak mümkün olduğunca fazla kas dokusu çıkarılmalı, ardından histoloji, hızlı dondurma vb. için müteakip işlemler yapılmalıdır. Bu, iskelet kasından prospektif olarak toplanan ve diseke edilen IMAT örneklerini kullanmanın ilk yöntemidir. Karşılaştırmalı olarak, IMAT'teki önceki snRNA-seq verileri, tek başına IMAT değil, bilinen yağ infiltrasyonu ile iskelet kası biyopsilerinin bir karışımının çekirdek izolasyonları yoluyla gerçekleştirilmiştir.
IMAT, deri altı yağ dokularına kıyasla doğası gereği daha yoğundur, bu da çekirdek izolasyonu sırasında dokunun uygun şekilde toz haline getirilmesini, çekirdeklerin doku yapısından serbest bırakılması için gerekli kılar. Yanlış toz haline getirme, sınırlı miktarda doku ile elverişsiz olan daha düşük bir çekirdek verimine yol açabilir. Ayrıca, hazırlanan çekirdek çözeltisindeki doğru çekirdek sayısının hesaplanması, GEM üretimi için çipe yeterli (ancak çok fazla olmayan) çekirdeğin yüklenmesini sağlamak için kritik bir adımdır. Çok fazla çekirdek veya büyük çekirdek kümelerinin veya döküntülerin varlığı, nihai cDNA konsantrasyonunu ve nihayetinde dizileme çıktısını etkileyen bir tıkanmaya neden olabilir. Tek çekirdek preparatındaki çekirdek kümelenmesini ve kalıntılarını atlatmak zordur ve numunenin kalitesinden etkilenir. Çekirdek kümelenmesi ve/veya döküntü varlığı, 30 μm hücre süzgeci ile ekstra bir filtreleme adımı eklenerek azaltılabilir.
RNA bozulması riskini azaltmak için numuneleri hızlı bir şekilde işlemek önemlidir. Çekirdek izolasyonunun tüm olası aşamaları sırasında çözeltilerin buz üzerinde tutulması veya soğutulması ve yeterli miktarda RNAse inhibitörünün eklenmesi bozulmayı en aza indirebilir. Her numune için işlem süresinin önemi nedeniyle, bir seferde en fazla iki numune çalıştırmanızı önerdik. Ayrıca, çekirdekleri çok kırılgan hale getirmemek için çekirdek çözeltisi dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Kırılgan çekirdekler, GEM oluşumu üzerine patlamaya karşı hassastır, bu da numunede büyük miktarlarda ortam RNA'sına neden olabilir. Bu protokolde, çekirdek bütünlüğünü korumak için bir şırınga (STAR protokolü16'da açıklanmıştır) kullanılarak filtreleme adımı hariç tutulmuştur.
Kütüphane hazırlama yönteminin seçimi araştırma sorusuna bağlıdır. Hem damlacık bazlı hem de nano kuyu bazlı tek çekirdek yaklaşımıyla çalıştık. Nano kuyu tabanlı yaklaşım, 1200-1600 çekirdeğin ve çekirdek başına yaklaşık 3000-6000 tespit edilen genin profilini çıkarır16. Ayrıca, bu yaklaşım, yapısal varyasyonun, sözde genlerin ve ek varyantlarının araştırılmasına izin veren tam uzunlukta transkriptomikleri destekler27. Buna karşılık, damlacık tabanlı yaklaşım kullanılarak 10.000'den fazla çekirdeğin profili çıkarılabilir, ancak çekirdek başına tespit edilen daha az sayıda gen pahasına (2-3 kat daha düşük). Bu protokol için, damlacık tabanlı platformlardan birini kullanmayı seçtik, çünkü profili çıkarılan daha fazla sayıda çekirdek bize düşük bolluğa sahip nadir hücre tiplerini tespit etmek için daha büyük bir kapasite sağlıyor28.
SnRNA-seq'in ana sınırlaması, ekspresyon analizini nükleer transkriptlerle sınırlayan sitozolik içerik kaybıdır. Çekirdek, tüm hücre 29'unkinden 10-100 kat daha az mRNA içerir, bu da bir dokudaki tüm hücre tiplerini ortaya çıkarmak için endişe verici olabilir. Bununla birlikte, Gupta ve ark. tarafından yakın zamanda yapılan bir çalışma, nükleer transkriptomiklerin - tam hücre transkriptomiklerinekıyasla 29 - kültürlenmiş preadipositlerde ve olgun adipositlerde biyolojik olarak ilgili genlerin benzer hücre popülasyonlarını ve ekspresyon profillerini tespit ettiğini buldu. Diğer hücre tiplerinde de benzer sonuçlar bulunmuştur30,31.
Tek çekirdek izolasyonunun, scRNA-seq ile uyumlu olmayan kırılgan hücrelerin tek hücre (sc) çözünürlüklü gen ekspresyon modellerini sağlamada avantajları vardır. Ayrıca, donmuş biyobanka örnekleri kullanılabilir ve çekirdek izolasyonu, hücrelerde bir stres tepkisine neden olabilen ve transkriptomu etkileyen dokunun enzimatik sindirimini gerektirmez32. SnRNA-seq kullanarak, adipositlerin lipid yüklü olması ve damlacık bazlı yaklaşımla uyumsuz olması nedeniyle scRNA-seq ile mümkün olmayacak olan IMAT'ta bulunan adipositlerin ve diğer hücre tiplerinin transkripsiyonel profilini çıkarabildik.
IMAT'ın snRNA-Seq'inin önemli bir uygulaması, değişen metabolik durumlarda IMAT'ın hücre kompozisyonunu ve transkripsiyonel farklılıklarını deşifre etmektir. Ayrıca, snRNA-seq veri setleri, hücre kompozisyon farklılıklarını daha büyük ölçekte değerlendirmek için IMAT üzerinde toplu RNA-seq'i açmak için kullanılabilir33. Ek olarak, snRNA-seq verilerinin sahte zamanlı analizi, olgun adipositlerin hücresel kökenlerinin hala tartışıldığı IMAT gibi dokularda özellikle ilgi çekici olan hücre olgunlaşmasının yörüngelerini belirlemeye hizmet edebilir.

İntermüsküler yağ dokusu (IMAT), kas lifleri arasında ve çevresinde bulunan ektopik bir yağ deposudur1. Goodpaster ve arkadaşlarının yakın zamanda yaptıkları bir derlemede ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, IMAT yüksek çözünürlüklü bilgisayarlı tomografi (BT) ve manyetik rezonans görüntüleme (MRG) kullanılarak tespit edilebilir (Şekil 1A,B) ve tüm vücut boyunca kas liflerinin çevresinde ve içinde bulunur1. IMAT miktarı bireyler arasında büyük farklılıklar gösterir ve VKİ, yaş, cinsiyet, ırk ve yerleşiklikten etkilenir 2,3,4. Ayrıca, kas dejenerasyonu ile ilişkili patolojik durumlardaIMAT birikimi yaygın olarak görülür5 ve çok sayıda çalışma obezite, tip 2 diyabet, metabolik sendrom ve insülin direnci olan bireylerde IMAT kütlesinin arttığını belgelemiştir 6,7,8,9. Bununla birlikte, IMAT'ın hücresel ve biyolojik özellikleri henüz çözülmeye başlanmıştır. Ulaşılabilirliğin sınırlı olması ve IMAT konumlarının ve içeriğinin tüm vücuda yayılması, bu eşsiz yağ deposundan numune toplanmasını zorlaştırmıştır2. Ayrıca, numuneler toplandıktan sonra iskelet kası (SM) ile kolayca 'kontamine olur', bu da farklı dokulardan gelen biyolojik katkı arasındaki ayrımın deşifre edilmesini zorlaştırır (Şekil 1C). Bu amaçla, son on yılda büyük ilgi gören tek çekirdekli RNA dizilimi (snRNA-seq), IMAT ve SM'den türetilmiş gen ekspresyon modellerinin tek hücre çözünürlüğü ile ayrılmasına izin vermek için ideal bir metodoloji olarak hizmet eder. Ayrıca, çekirdek izolasyonu, hücrelerin bütünlüğünden ödün vermeden tek hücreli süspansiyona ayrışması imkansız olan büyük lipid yüklü adipositler nedeniyle yağ dokusu için özellikle yararlıdır. Son olarak, bu teknoloji, IMAT'a özgü adipositlerin yeni belirteçlerini keşfetme ve farklı progenitör hücre popülasyonlarının bileşimini ve varlığını ortaya çıkarmanın yanı sıra patolojik ve normal koşullarda hücre bileşiminin varyasyonunu inceleme potansiyeline sahiptir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig01.jpg"> Şekil 1: IMAT görüntüleri. (A) orta yaşlı, zayıf bir kadın ve (B) obezitesi olan orta yaşlı bir erkekten IMAT'ın temsili manyetik rezonans (MRG) görüntüsü. Kırmızı: deri altı yağ dokusu, sarı: kas arası yağ dokusu, yeşil: iskelet kası, mavi: kemik. Resim, AdventHealth Translational Research Institute'tan Heather Cornnell'in izniyle. (C) IMAT ile taze doku örneği (kesikli siyah çizgi ile çevrelenmiş). Resim, AdventHealth Çeviri Araştırma Enstitüsü'nden Meghan Hopf ve Colorado Üniversitesi'nden Bryan Bergman'ın izniyle. Bu şekil Goodpaster ve ark.1'in izniyle değiştirilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hayvancılık endüstrisinden, tek hücreli (sc) ve snRNA-seq10 kullanarak domuz, tavuk ve sığırlarda etin (özellikle IMAT) ebrusunu araştıran bir dizi çalışma yayınlanmıştır. Bu çalışmalar, IMAT 11,12,13'ün potansiyel progenitör hücrelerinin çeşitli adiposit alt popülasyonlarını ve belirteçlerini tanımlamıştır; ancak bu hücresel bileşimlerin insan IMAT'ına dönüşüp dönüşmediği bilinmemektedir. Bildiğimiz kadarıyla, sadece bir çalışma, snRNA-seq14 kullanılarak kalça osteoartriti olan erkek hastalardan elde edilen yağ infiltrasyonu ile insan kasının hücresel heterojenliğini incelemiştir. Araştırmacılar, büyük myonuclei14 popülasyonu içinde küçük bir adiposit popülasyonu ve birkaç fibro-adipogen progenitör (FAP) alt popülasyonu bildirdiler. Çalışmamız, snRNA-seq kullanarak hücresel kompozisyon için insan kasından manuel olarak diseke edilen IMAT'ı doğrudan sorgulamak için bir yöntem geliştiren ilk çalışmadır.
Daha da önemlisi, mevcut doku miktarı ve spesifik dokunun fiziksel özellikleri optimal işleme adımlarını belirleyeceğinden, snRNA-seq protokollerinin incelenen spesifik doku için özelleştirilmesi gerekir. IMAT için doku verimi tipik olarak küçüktür ve ultrason eşliğinde biyopsiler yapılırken bile genellikle 50 mg'ı geçmez. Bu nedenle, bu kıt dokunun uygun şekilde işlenmesi esastır. Bu protokolün, insan IMAT üzerine çalışan araştırmacılar için değerli bir kaynak olacağına inanıyoruz.

<table><tbody><tr><td>0.2 ve mikro; M Corning Şırınga Filtreleri&nbsp;</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS431229</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL DNA LoBind tüpleri</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td>düşük bağlamalı tüpler</td></tr><tr><td>%10 Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>100X proteaz inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>78437</td><td></td></tr><tr><td>10X Manyetik Ayırıcı</td><td>10X Genomik</td><td>230003</td><td></td></tr><tr><td>10X Vorteks Adaptörü</td><td>10X Genomik</td><td></td><td></td>330002</tr><tr><td>15 mL kanonik tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,54,502</td><td></td></tr><tr><td>2100 Biyoanalizör&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>G2939BA</td><td></td></tr><tr><td>50 mL konik tüpler</td><td>Sarstedt</td><td>6,25,47,254</td><td></td></tr><tr><td>CellRanger</td><td>Genomics</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Chromium iX aksesuar kiti</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000323</td><td></td></tr><tr><td>Chromium iX Denetleyici</td><td>10X Genomics</td><td>PN1000326</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip G Tek Hücre Kiti&nbsp;</td><td>10X Genomik</td><td>PN1000127</td><td></td></tr><tr><td>Krom Sonraki GEM Tek Hücreli 3 'Jel Boncuk Kiti v3.1&nbsp;</td><td>10X Genomik</td><td>PN1000129</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Tek Hücreli GEM Kiti v3.1</td><td>10X Genomik</td><td>PN1000130</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 3 Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>Otomatik hücre sayacı</td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası slaytları</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>DoubletFinder</td><td>R&nbsp;</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (kalsiyum yok, magnezyum yok)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Çift İndeks Kiti TT Set A, 96 rxns</td><td>10X Genomik</td><td>PN1000215</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne SILANE&nbsp;</td><td>10X Genomik</td><td>PN2000048</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 ve mikro; m Hücre süzgeci</td><td>Corning Life Science</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 40 & m Hücre süzgeci</td><td>Corning Life Science</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>Gliserin (gliserol),% 50 (h / h) Sulu Çözelti</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>KCL</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>AM9640G</td><td></td></tr><tr><td>Kütüphanesi Yapı Kiti v3.1</td><td>10X Genomik</td><td>PN1000196</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (30 ve mikro; m)</td> <td>Miltenyi Biotec</td><td>130-098-458</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Nexus Gradient Termal döngüleyici</td><td>Eppendorf</td><td>6331000017</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Ambion</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>Harç ve pestel</td><td>Sağlık lojistiği&nbsp;</td><td>14075</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue Canlı Hazır Problar Reaktif</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen Su (DEPC ile tedavi edilmemiştir)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9930</td><td></td></tr><tr><td>Probumin Sığır Serumu Albümin Yağ Asidi İçermeyen, Toz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>820024</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Tamponu EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Ribolock RNAse inhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EO0382</td><td></td></tr><tr><td>Seurat</td><td>R&nbsp;</td><td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>SUPERasin 20 U/&mikro; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM2695</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer C</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp; </td><td></td>5382000015</tr><tr><td>Doku homojenizatörü</td><td>Glass-Col</td><td>099C K54</td><td></td></tr><tr><td>Tris tampon pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9855G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AC327372500</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 0.5M EDTA pH 8.0</td><td>Gibco</td><td>15575020</td><td></td></tr></tbody></table>

İnsan İntermüsküler yağ dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve aşağı akış tek Çekirdekli rna dizilemesi

Isolation of Nuclei from Human Intermuscular Adipose Tissue and Downstream Single-Nuclei RNA Sequencing

İntermüsküler yağ dokusu (IMAT), kas lifleri arasında yer alan nispeten az çalışılmış bir yağ deposudur. IMAT içeriği yaş ve VKİ ile artar ve metabolik ve kas dejeneratif hastalıklarla ilişkilidir; bununla birlikte, IMAT'ın biyolojik özelliklerinin ve çevredeki kas lifleri ile etkileşiminin anlaşılması ciddi şekilde eksiktir. Son yıllarda, tek hücreli ve çekirdekli RNA dizilimi bize birkaç insan dokusunun hücre tipine özgü atlaslarını sağlamıştır. Bununla birlikte, insan IMAT'ın hücresel bileşimi, insanlarda biyopsi toplanmasından erişilebilirliğinin doğasında var olan zorluklar nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiş kalmaktadır. Toplanan sınırlı doku miktarına ek olarak, iskelet kası dokusuna ve fasyaya olan yakınlığı nedeniyle insan IMAT'ın işlenmesi karmaşıktır. Adipositlerin lipid yüklü doğası, onu tek hücre izolasyonu ile uyumsuz hale getirir. Bu nedenle, tek çekirdekli RNA dizilimi, tek hücre çözünürlüğünde yüksek boyutlu transkriptomikler elde etmek için idealdir ve IMAT'ın tam hücresel bileşimi de dahil olmak üzere bu deponun biyolojisini ortaya çıkarma potansiyeli sağlar. Burada, tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'inin çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, damlacık tabanlı bir yaklaşım kullanarak binlerce çekirdeğin profilinin çıkarılmasına izin verir, böylece nadir ve az miktarda hücre tiplerini tespit etme kapasitesi sağlar.

Bu iş akışı, tek çekirdek çözünürlüğünde gen ekspresyon profilleri elde etmek için donmuş insan IMAT örneklerinin işlenmesine rehberlik etmek ve hücre tipi tanımlamasını mümkün kılmak üzere tasarlanmıştır. Burada, SOMMA çalışmasına katılan bir katılımcıdan alınan temsili bir IMAT örneği sunulmaktadır.
snRNA-seq verilerinin herhangi bir analizinin ilk adımı, potansiyel olarak veri setinden çıkarılması gereken düşük kaliteli çekirdekleri belirlemek için verilerin kalitesini değerlendirmektir. Daha da önemlisi, yaygın olarak değerlendirilen metrikler dokular ve hücre tipleri arasında farklılık gösterebileceğinden, elinizdeki belirli numune ve veri seti türü için filtreleme adımları ve eşikleri belirlenmelidir22,23. Şekil 4A, oluşturulan snRNA-seq verilerinin kalitesini değerlendirmek için kullanılan bazı temel metriklerin görsellerini sağlar. Çekirdek başına tespit edilen gen sayısı, dizileme derinliğine ve hücre tipine bağlıdır, ancak kaliteli çekirdekler için 200'ün üzerinde olması beklenir18,23. Bu protokol kullanılarak üretilen verilerin, toplam 4662 çekirdekten çekirdek başına ortalama 1134 gen ile beklenen aralıkta olduğu bulundu.
Mitokondriyal okumaların yüzdesi değerlendirilir, çünkü hasarlı çekirdeklerden veya çekirdeğe bağlanan ortam RNA'sından yüksek derecede mitokondriyal kontaminasyon ortaya çıkabilir, bu da düşük kaliteli çekirdekleri gösterir. Burada sunulan veri setinde, literatürde yaygın olarak kullanılan %5- eşiğinin oldukça altında olan 2.65'lik bir medyan mitokondriyal okuma yüzdesi bulunmuştur 24,25,26. Ribozomal okumaların yüzdesi hücre tipleri ve dokular arasında farklılık gösterir. Bununla birlikte, ribozomal genlerin büyük oranları verilerin kümelenmesini etkileyebileceğinden, kümelemeden önce ribozomal okuma yüzdesinin kontrol edilmesi ve potansiyel olarak yüksek düzeyde ribozomal gen içeren ribozomal genlerin veya çekirdeklerin veri kümesinden çıkarılması önerilir. Bu protokolle oluşturulan veriler, medyan %2,46 ve maksimum ,5 ile düşük düzeyde ribozomal okuma gösterdi ve bu nedenle bu metriğe göre filtreleme yapmadık. Son olarak, tespit edilen log (10) gen sayısının, tespit edilen log (10) okuma sayısına bölünmesine dayalı olarak bir hücre karmaşıklık skoru hesaplandı. İyi kaliteli çekirdeklerin 0.8'in üzerinde olması beklenir ve bu çalışmada kullanılan örnekte 0.92'lik bir medyan elde edilmiştir. Bu QC metriklerine dayanarak, veri kümesinden hangi çekirdeğin filtreleneceğine karar verilebilir. Analiz için, çekirdek başına 200'den az veya 10.000'den fazla gen, 'dan fazla mitokondriyal okuma ve 0.8'in altında bir karmaşıklık puanı olan çekirdekleri filtrelemeyi seçtik.
İlk kalite değerlendirmesi ve filtreleme adımını takiben, çekirdeklerin kümelenmesini görselleştirmek için bir UMAP oluşturulabilir. Kümeleme, SCT dönüşümü kullanılarak en değişken 2000 gene dayalı olarak gerçekleştirildi. İlk kümeleme adımları, örneğin yüksek mitokondriyal okumalara sahip çekirdekler gibi QC özelliklerinden herhangi birinin birlikte kümelenip kümelenmediğini kontrol etmek için kullanılabilir. Ayrıca, bu protokolde kullanılan DoubletFinder20 de dahil olmak üzere bazı ikili algılama yöntemleri için kümeleme bilgileri gereklidir. DoubletFinder, damlacık tabanlı platformun sağlayıcıları tarafından önerildiği gibi, beklenen çarpan oranı %4,8 olarak ayarlanmış olarak kullanıldı. Çiftin çıkarılmasından sonra, RNA'nın hücre lizizi üzerine sitoplazmadan salındığı ve emülsiyon içinde jel boncuklara (GEM'ler) dağıtıldığı ve aşağıdaki kütüphane hazırlama adımlarında amplifiye edildiği için özellikle tek çekirdek preparatlarında yaygın olan ortam RNA kontaminasyonu seviyesi tahmin edildi. Bu nedenle, ortamdaki RNA kontaminasyonunun doğasında var olan sorunu düzeltmek için çeşitli araçlar geliştirilmiştir (bakınız Tablo 3). Gen ekspresyon matrisini ayarlamak için ham arka plan matrisinin (yalnızca boş damlacıklar dahil) kullanıldığı ve gerçek gen ekspresyonu imzasını geliştirdiği R paketi decontX21'i kullandık.
Kümelenme ve az miktarda bulunan hücre tiplerini tespit etme yeteneği, çekirdek sayısına bağlıdır. Bu çalışma, QC filtreleme, çift çıkarma ve ortam RNA ayarlamasından sonra toplam 3817 çekirdekten IMAT'ta (Şekil 4B) beklenen tüm ana hücre tiplerini tespit etti. Bunlar arasında kök hücreler, fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) ve olgun adipositlerin yanı sıra perisitler, düz kas hücreleri, bağışıklık hücreleri, kas progenitör hücreleri ve iskelet kası hücresi kontaminasyonundan kaynaklanan myonukleler vardı.
Genel olarak, bu protokolün, IMAT'ın biyolojisini ve hücresel kökenlerini çözmek için önemli olan hücre tipi açıklamalarının algılanmasını sağlayan yüksek çözünürlüklü tek çekirdek verileri ürettiğini gösterdik.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66784/66784fig04.jpg"> Şekil 4: Dizileme verilerinin kalite değerlendirmesi, kümeleme ve hücre tipi açıklaması. (A) Çekirdek başına tespit edilen gen sayısı, mitokondriyal okuma yüzdesi, ribozomal okuma yüzdesi ve log (10) gen sayısının tespit edilen log (10) okuma sayısına bölünmesiyle ölçülen hücre karmaşıklığı dahil olmak üzere, numunenin ve dizileme performansının değerlendirilmesi için temel metriklerin keman grafikleri. Her metrik için medyan değerler kapalı kutularda verilmiştir. Toplam çekirdek sayısı: 4662. (B) Tek tek çekirdeklerin kümelenmesini gösteren UMAP ve filtrelemeden sonra her küme için hücre tipi işaretleyici genlerin göreceli gen ekspresyonunu gösteren karşılık gelen DotPlot. Çekirdek sayısı: 3817. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/66784fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Kalite kontrol ve kümeleme analizi için kod. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66784/Supplementary_File_1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

İntermüsküler yağ dokusunun (IMAT) biyolojisi, insan dokusunun sınırlı erişilebilirliği nedeniyle büyük ölçüde keşfedilmemiştir. Burada, bu benzersiz yağ deposunun hücresel bileşimini tanımlamak için tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş insan IMAT'ının çekirdek izolasyonu ve kütüphane hazırlığı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi

Intermuscular adipose tissue (IMAT) is a relatively understudied adipose depot located between muscle fibers. IMAT content increases with age and BMI and ...

Araştırma grubumuz, insanlarda kas arası yağ dokusunun veya IMAT'ın hücre kompozisyonunu ve hücreye özgü transkripsiyonel profillerini anlamaya çalışıyor. IMAT aslında kas lifleri arasında ve çevresinde bulunan ektopik bir yağ deposudur. Bilgisayarlı tomografi ve MRG, IMAT hacmini ölçebilmiştir ve son zamanlarda hem yaş hem de VKİ ile arttığını ve ayrıca kas dejeneratif hastalıkları ile ilişkili olduğunu göstermiştir.Son zamanlarda yapılan in vitro sekretom çalışmaları, IMAT tarafından salgılanan proteinlerin insan iskelet kasındaki insülin duyarlılığını, inflamatuar profilleri ve ayrıca kontraktil protein ekspresyonlarını etkileme yeteneğine sahip olduğunu göstermiştir. Biyopsiler sırasında toplanan IMAT dokusunun sınırlı miktarda olması ve adipositlerin lipid yüklü yapısı, bu dokuyu doku sindirimi ve tek hücreli RNA-Seq ile uyumsuz hale getirir. Bu nedenle, daha sonra aşağı akış tek çekirdekli RNA-Seq'de kullanılabilecek küçük miktarlarda doku üzerinde çekirdek izolasyonu gerçekleştiren bir protokol geliştirmek istedik.Bu protokol, araştırmacıların farklı metabolik hastalık durumlarında ve müdahalelere yanıt olarak IMAT'ta meydana gelen bileşimsel ve hücreye özgü transkripsiyonel değişiklikleri belirlemelerini sağlayacaktır. Bu bilgilerin, IMAT'ı doğrudan veya salgılanan faktörleri hedefleyerek metabolik hastalıkları hafifletmeye yardımcı olacak yeni terapötik stratejiler geliştirmede çok önemli olacağını umuyoruz. Bu alan, IMAT'ın biyolojisi, hücresel kökenleri ve IMAT'ın hem içinde hem de dışında bulunan diğer hücrelerle iletişiminin yanı sıra diyet, egzersiz veya farmakoterapi gibi yaşam tarzı müdahalelerine verdiği moleküler tepkiler hakkında ciddi veri eksikliğine sahiptir.Bunların hepsi grubumuz için temel araştırma sorularıdır.

isolation-nuclei-from-human-intermuscular-adipose-tissue-downstream

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada, hızlı bir şekilde yüksek kaliteli çekirdekleri aşağı akım kitlesel paralel RNA sıralama için taze veya dondurulmuş dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut. İkisi de çekirdek yalıtımı için kullanılan deterjan-mekanik ve mekanik hipotonik doku bozulma ve hücre lizis seçenekleri, içerir.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Bu yayın, çekirdeklerin olgun adipositlerden izole edilmesi, floresan-aktive sıralama ile arınma ve tek hücre düzeyinde transkripsiyon için bir protokol açıklar.

Tek Hücreli Genomik Uygulamalar için Yağ Dokusu Çekirdeklerinin İzolasyon

Tek çekirdek izolasyonu ayrışma ve hücre zarının deterjan bazlı permeabilizasyonuna, optimizasyona ihtiyaç duyan ve teknik eserlere yatkın adımlara dayanır. Tek çekirdekli RNA-seq (snRNA-Seq) veya ATAC-seq için uygun olan çekirdekleri doğrudan tüm dokudan hızlı bir şekilde izole etmek için deterjan ve enzimsiz bir protokol gösteriyoruz.

Deterjan ve Enzimsiz YöntemLe Tüm Dokudan Çekirdek İzolasyon

Tümör içi heterojenlik gliomalar da dahil olmak üzere tümörlerin doğal bir özelliğidir. Tek çekirdek RNA ve ATAC dizileme çalışmaları için tek çekirdekleri taze donmuş glioma dokularından izole etmek için tamponlar ve gradyan santrifüjleme kombinasyonunu kullanan basit ve verimli bir protokol geliştirdik.

Tek Çekirdekli RNA-seq ve ATAC-seq için Taze Donmuş Beyin Tümörlerinden Çekirdek İzolasyonu

Burada, tek çekirdekli RNA-seq, ATAC-seq ve eklem multiomikleri (RNA-seq ve ATAC-seq) için flaş dondurulmuş, arşivlenmiş karaciğer dokularından çekirdekleri izole etmek için bir protokol sunuyoruz.

Tek Hücreli Multiomikler için Flaş Dondurulmuş Karaciğer Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu

Çalışma, aşağı akış tek çekirdekli RNA dizilimi için donmuş memeli dokularından yüksek kaliteli çekirdekleri izole etmek için basit, hızlı ve kısmen otomatikleştirilmiş bir protokolü açıklamaktadır.

Tek Çekirdek Dizilimi için Donmuş Memeli Dokularından Tek Çekirdeklerin İzolasyonu için Basit, Hızlı ve Kısmen Otomatik Bir Protokol

Beyin dokusunda hücresel heterojenite testlerin çoğu tek hücreli çözünürlük eksikliği nedeniyle kromatin epigenetik işaretlerin çalışma için önemli bir sınırlama teşkil etmektedir. Nöronlar genellikle glia ve diğer non-nöronal hücreler ile iç içe. Biz özü ve insan beyninin nöron çekirdekleri toplamak için bir protokol sağlar.

İnsan Postmortem Beyin Dokusu Nöronal Çekirdekler İzolasyon

2001 yılında, UCLA araştırmacılar erişkin kök hücrelerin bir nüfus izolasyon, adipoz dokudan, Yağ elde edilen kök hücreler veya TSK adlandırılan nitelendirdi. Bu makale kolajenazı kullanarak manuel, enzimatik sindirim protokolü kullanılarak lipoaspirates gelen TSK izolasyonunu özetliyor.

İnsan Lipoaspirates den Yağ-türetilen Kök Hücre Manuel İzolasyon

Miyofibroblast normal ve hastalık her iki durumda önemli fizyolojik işlemleri düzenleyen gastrointestinal sistemin etkili bir stromal hücresidir. Biz, fare ve in vitro deney için kullanılabilir insan kolon dokusu, hem birincil miyofibroblastlar izolasyonu sağlayan bir tekniği açıklar.

Fare ve İnsan Kolon Doku Primer miyofibroblastlar İzolasyonu

Ribonükleaz açısından zengin fare pankreasından yüksek bütünlükte RNA'yı izole etmek için bir prosedür rapor ediyoruz.

Fare pankreasından alınan RNA İzolasyonu: A Ribonuclease zengin Doku

Keşfedin insan intermüsküler yağ dokusundan çekirdek izolasyonu ve tek çekirdekli RNA dizileme yöntemini. Bu protokol metabolik hastalıklarda hücresel değişiklikleri analiz etmeyi sağlar.

İnsan İntermüsküler Yağ Dokusundan Çekirdeklerin İzolasyonu ve Aşağı Akış Tek Çekirdekli RNA Dizilemesi

Daha fazla video keşfet