Name: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hastalık Progresyonunu Taklit Eden ve İlaç Aktivitelerini Tahmin Eden Ortotopik Ksenogreft Modelinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: Keşfedin, küçük hücreli dışı akciğer kanserinde çok hücreli sferoidler kullanarak ortotopik ksenogreft modeli oluşturmayı. Bu yöntem, klinik evreleri taklit ederek ilaç aktivitelerini tahmin etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Pasifik Üniversitesi'nden SAAG ve SEED hibeleri ile desteklenmiştir. Odyssey Kızılötesi Görüntüleme 205 Sistemine erişim sağladığı için Dr. William Chan'a ve SpectraMax iD3 plaka okuyucusuna erişim sağladığı için Dr. John Livesey'e teşekkür ederiz. Hayvan protokolleri hakkındaki teknik tavsiyeleri için Dr. Melanie Felmlee'ye teşekkür ederiz.

Hayvan çalışması, Pasifik Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) onayı ile gerçekleştirildi (Hayvan Protokolleri 19R10 ve 22R10). Bu çalışma için 5-6 haftalık yaşlarında, 20-25 g ağırlığında, referans verilen Kemirgen Diyeti ile yetiştirilmiş ve patojen içermeyen (SPF) koşullar altında barındırılan sekiz erkek atimik çıplak fare kullanıldı. Kafesler, yatak takımları ve içme suyu otoklavlandı ve düzenli olarak değiştirildi. Farelerde tümör aşılamasının bir şeması Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokolde kullanılan tüm malzeme ve aletlerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. A549-iRFP hücrelerinin üç boyutlu MCS'sinin kurulması
<ol><li>A549-iRFP hücrelerini (insan akciğer adenokarsinomu) 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin ve% 10 fetal sığır serumu,% 1 penisilin-streptomisin ve% 1 μg / mL puromisin içeren tam büyüme ortamı DMEM'de büyütün.</li>
	<li>A549-iRFP hücrelerini,% 0.3 kollajen ile desteklenmiş 100 μL tam büyüme ortamı kullanarak, 4.000 hücre / kuyu tohumlama yoğunluğunda 96 oyuklu ultra düşük bağlantılı, yuvarlak tabanlı küresel mikroplakaya tohumlayın.</li>
	<li>MCS oluşumunu kolaylaştırmak için mikroplakaları 300 × g'da 4 ° C'de 7 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra hücre agregasyonunu sağlamak için MCS morfolojisini mikroskop altında inceleyin.</li>
	<li>48 saat sonra, oyuk başına toplam 200 μL büyüme ortamı hacmi elde etmek için her bir oyuğa 100 μL tam büyüme ortamı ekleyin.</li>
	<li>Her kuyucuktaki 100 μL büyüme ortamını her gün taze tam büyüme ortamı ile değiştirin.</li>
</ol>2. A549-iRFP MCS'nin Karakterizasyonu
<ol><li>Bir mikroskop kullanarak MCS morfolojisini gözlemleyin ve görüntüleyin ve faz kontrast mikroskobu görüntülerine dayalı olarak MATLAB'ın referans yazılımı ile simülasyon yoluyla MCS hacmini tahmin edin.<ol><li>ImageJ yazılımında bir MCS görüntüsü açın.</li>
		<li>MCS'nin kenarını seçmek ve bunu ROI Yöneticisi'ne eklemek için Freehand seçimlerini kullanın.</li>
		<li>Düzenle | öğesine tıklayın Seçim | Maske Oluştur'u tıklayın.</li>
		<li>Düzenle | öğesine tıklayın Ters çevir.</li>
		<li>Dosya | Farklı Kaydet | Öğr.</li>
		<li>ReViSP yazılımını açın.</li>
		<li>Kaydedilen TIFF görüntüsünü açmak için Gözat'ı tıklatın.</li>
		<li>MCS simülasyonunu tamamlamak için Başlat'a tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>700 nm kanalında kızılötesi görüntüleme sistemini kullanarak iRFP floresan sinyalini ölçün ve yazılım (ör. Image Studio) kullanarak floresan sinyalini ölçün.<ol><li>Image Studio yazılımını açın.</li>
		<li>Kanallar sekmesinde 700 ve Yoğunluk = 5'i seçin.</li>
		<li>Scan Controls (Tarama Kontrolleri) sekmesinde 84 μm, Medium, 0,0 mm ve Flip Image (Görüntüyü Çevir) öğesini seçin. Diğer her şeyi varsayılan olarak tutun.</li>
		<li>Taramayı başlatmak için Başlat'a tıklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Satıcı protokolüne göre 3D hücre canlılığı testini kullanarak hücre canlılığını değerlendirin ve ölçün.</li>
	<li>Satıcı protokolüne göre BCA Testini kullanarak hücresel proteini değerlendirin ve nicelleştirin.</li>
</ol>3. Tümör aşılaması için MCS seçimi
NOT: MCS, sferoid mikroplakalara ekildikten ve düzenli büyüme ortamı değişimi ile 2-3 hafta boyunca büyütüldükten sonra, tümör aşılaması için aşağıdaki uygun özelliklere sahip MCS'yi seçin.
<ol><li>MCS morfolojisini mikroskop altında gözlemleyin ve genel olarak pürüzsüz kenarlı, ancak 5-10 pürüzlü tomurcuklanma ( Şekil 2F'deki oklar) ve 700-800 μm aralığında bir çapa sahip yuvarlak bir şekle sahip MCS'yi seçin.</li>
	<li>iRFP floresansını ölçün (bkz. adım 2.2'ye bakın) ve floresan sinyalleri ortalamanın bir standart sapması içinde olan MCS'yi seçin.</li>
</ol>4. İntrapulmoner MCS aşılaması
NOT: Hayvanlara dokunmadan önce cerrahi istasyonu ve aletleri temizlemek için p izopropil alkol spreyi kullanın.
<ol><li>Her fareyi 80 mg / kg ketamin ve 12 mg / kg ksilazin IP enjeksiyonu ile uyuşturun; Tam anestezi sağlamak için fare ayaklarını forseps ile sıkıştırın.</li>
	<li>Ağrıyı azaltmak için deri altına 10 μL buprenorfin hidroklorür (0.3 mg / mL) enjekte edin.</li>
	<li>Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.</li>
	<li>Fareyi sırt duruşuna getirin ve uzuvları bantlarla germe pozisyonunda sabitleyin.</li>
	<li>Arka cildi iyot ve alkollü çubuk çubuklarıyla sterilize edin.</li>
	<li>Sol arka taraftan cerrahi makas kullanarak 0,5-1 cm'lik bir kesi kesin (Şekil 1B). Göğüs duvarı ve akciğer hareketi görünene kadar kas ve yağ dokularını ayırmak için dikkatlice forseps kullanın.</li>
	<li>Seçilen bir MCS'yi bir mikroplakadan bir pipet kullanarak buz gibi soğuk PBS içeren bir cam Petri kabına aktarın.</li>
	<li>100 μL'lik bir cam şırıngaya 20 G'lik bir iğne takın, buz üzerinde önceden soğutun ve 20 μL önceden soğutulmuş PBS ve Matrigel karışımından (1:1 v/v) çekin.</li>
	<li>MCS'yi iğnenin metal kısmında tutarak, minimum hacimde PBS-Matrigel karışımında Petri kabından bir MCS'yi hızlı bir şekilde aspire etmek için şırıngayı kullanın. NOT: MCS'nin iğneden kaymasını önlemek için şırıngayı ve pistonu sıkıca tutun.</li>
	<li>İğneyi iki kaburga kemiği arasına ~ 3 mm derinliğe kadar dikey olarak nazikçe sokun ve MCS'yi içeren tüm 20 μL PBS ve Matrigel karışımını yavaşça enjekte edin. NOT: Akciğere, damar sistemine veya kalbe zarar vermemek için yerleştirme sırasında aşırı kuvvetten kaçının.</li>
	<li>İğneyi dikkatlice çıkarın ve yaraya üçlü antibiyotik merhem sürün.</li>
	<li>Kesiyonu 2 hafta sonra çıkarılacak olan cerrahi klipslerle kapatın. NOT: Dikiş çizgileri floresan görüntülemeyi engelleyebileceğinden insizyonu dikmeyin. Çıplak fareler ameliyattan sonra doğal olarak iyileşebilir.</li>
	<li>Hayvanı kızılötesi bir ısı yastığına yerleştirin ve vücut ısısını korumak için laboratuvar mendilleriyle örtün. Hayvanı uyanana ve düzgün hareket edene kadar en az 30-60 dakika izleyin.</li>
	<li>Ağrıyı azaltmak için ilk 48 saat boyunca günde 3 kez deri altına 10 μL buprenorfin hidroklorür (0.3 mg / mL) enjekte edin.</li>
</ol>5. Ameliyat sonrası izleme
<ol><li>Vücut ağırlığını her 3-4 günde bir ölçün.</li>
	<li>Tümör ksenogreftinden gelen iRFP floresan sinyalini her 3-4 günde bir, 700 nm kanalında küçük bir hayvan görüntüleme sisteminde dört duruşta ölçün: sol, sağ, dorsal ve ventral, fareler anestezi altında tutulurken izofluran inhalasyonu ile (akış hızı: 1.5-2 L / dak oksijen% 1.5 izofluran içerir) 2-3 dakika boyunca.</li>
	<li>Ksenogreft kanserinin net floresan yoğunluğunu in vivo yazılım (örneğin, Image Studio) kullanarak ölçün.<ol><li>Farelerin göğüs bölgesi için örnekleme penceresi olarak sabit bir dikdörtgen (A1, 200 x 125 piksel) kullanın.</li>
		<li>Dikdörtgen (A1) içindeki farelerin şeklini izlemek ve A1 alanındaki floresan yoğunluğunu (F1) ölçmek için serbest el işlevini kullanın.</li>
		<li>Uyluk bölgesindeki farelerin arka plan floresansını (F2) ölçmek için daha küçük başka bir dikdörtgen (A2, 25 x 40 piksel) kullanın.</li>
		<li>Her farede ksenogreft kanserinin net floresan yoğunluğunu hesaplamak için denklem (1) kullanın: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

Ortotopik KHDAK Modellemek için Çok Hücreli Sferoidlerin İntrapulmoner Inokülasyonu

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
<li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).</li>
<li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li>
<li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li>
<li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li>
<li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).</li>
<li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer%3A+Biology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li>
<li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li>
</ol>

Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

A549-iRFP MCS'nin yapısı, basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir laboratuvar prosedürüdür ve birden fazla hücre hattı için MCS oluşumuna çevrilebilir. Santrifüj ve kollajen yardımıyla üretilen MCS, 3-4 gün içinde daha bütünsel ve katı tümör benzeri bir yapı sergiler. Bu yöntem, tipik olarak 2-3 hafta veya küçük tomurcuklanmalar ortaya çıkmaya başlayana kadar daha uzun süreler boyunca ayrılmaz yapılarını koruyan sağlam sferoidlerin oluşumunu sağlar. Santrifüjleme ve kollajen kullanarak, MCS oluşumunu standartlaştırdık ve deneysel modelimizde tutarlılıklarını ve güvenilirliklerini sağladık. Bu yaklaşım, sonuçlarımızın tekrarlanabilirliğini artırır ve tümör büyüme kinetiğindeki değişkenliği en aza indirir, böylece tümör biyolojisi ve terapötik müdahaleleri incelemek için daha sağlam bir platform sağlar.
Geleneksel 2D tek katmanlı hücre kültürlerinin aksine, 3D MCS, bu çalışmada en az 6 hafta olmak üzere çok daha uzun bir zaman diliminde büyüyebilir. Kanser büyümesini ve ilerlemesini izlemek için dinamik, uzun vadeli kantitatif bir ölçüm oldukça faydalıdır. Mevcut birçok 3D MCS testi, ölçümler sırasında tahrip edicidir, bu nedenle uzun vadeli değerlendirmeler için kullanışlılıklarını sınırlar. iRFP floresan sinyallerinin ölçülmesinin tahribatsız doğası, 3D MCS'de kanser hücresi büyümesinin sürekli ve uzun vadeli izlenmesine olanak tanır. Bu özellik, antikanser ajanlara kronik maruziyetin etkilerini değerlendirmek ve kanser hücrelerinin zaman içindeki dinamik evrimini yakalamak için özellikle değerlidir. A549-iRFP 3D MCS tarafından yayılan iRFP floresan sinyalleri, sferoid hacmi, hücre canlılığı ve hücresel protein seviyeleri dahil olmak üzere sferoid büyümesinin geleneksel kantitatif ölçümleriyle güçlü bir korelasyon sergiledi. Bu, MCS'de kanser hücresi büyümesini değerlendirmek için bir vekil olarak floresan sinyallerin güvenilirliğini vurgulamaktadır. iRFP floresan sinyallerinin uzun dalga boyu, antikanser ilaçların klinik öncesi gelişimi için kritik olan küçük hayvanlarda kanser büyümesinin ve ilerlemesinin ölçülmesine izin verir.
Bu ortotopik KHDAK modelinin tutarlılığını sağlamak için, MCS'nin intrapulmoner aşılama için dikkatli bir şekilde seçilmesi gerekir. Varyasyonu en aza indirmek için MCS'nin benzer boyutu ve floresan yoğunluğu gereklidir; Daha büyük MCS'nin aşılanması, tümör ilerlemesinde daha büyük varyasyonlara neden olma eğilimindedir. Ek olarak, MCS yüzeyinin pürüzlülüğünü kontrol etmek, varyasyonun azaltılmasında kritik bir rol oynar. Bazı MCS'ler büyüdükçe pürüzsüz kenarlarını korurken, diğerleri büyüdükçe daha pürüzlü kenarlar sergiledi. Elimizde, kenarlarında 5-10 tomurcuklanma ile hücre kültüründe 2-3 hafta sonra büyüyen integral, katı tümör benzeri MCS, farelerde daha düzgün tümör büyümesi sağlarken, pürüzlü kenarları olmayanlar veya gevşemiş yapılara sahip olanlar ve çok fazla tomurcuklanma olanlar, aşılamadan sonra daha çeşitli tümör büyümesi paternleri verdi. 
MCS transferi işlemi sırasında, 20 G iğnenin büyük bir özenle kullanılması önemlidir. Potansiyel hasarı sınırlamak için MCS, eğim veya iğnenin metal kısmı içinde tutulmalıdır. İğne boyutu seçimi, aşılama sırasında MCS'nin canlılığını sağlamak ve fare akciğerlerine olası hasarı en aza indirmek arasında denge kurmak için kasıtlı olarak yapılmıştır. Daha büyük iğne boyutları potansiyel olarak fare dokularına zarar verebilir. MCS iğne içinde sıkışırsa veya aşılamayı takip eden ilk günlerde çok sayıda floresan nokta gözlenirse, aşılanan MCS'nin aşılama sırasında hasar gördüğünü gösterebilir. Bu özellikleri gösteren fareler daha ileri çalışmalardan çıkarıldı ve başarısız aşılama olarak sınıflandırıldı.
Çok hücreli sferoidler (MCS), anatomik hususlara bağlı olarak sağ akciğer yerine sol akciğere aşılandı. Sol akciğer, yan yana yerleştirilmiş üç lobu olan sağ akciğere kıyasla daha tutarlı ve erişilebilir bir hedef alan sağlayan, üst üste yığılmış iki loba sahiptir. Böylece, sol akciğer, belirli bir alanda, yani sol üst lobda son derece güvenilir aşılamaya izin verir ve bu da tümör oluşumu ve ilerlemesindeki varyasyonları azaltmaya yardımcı olur. 
Göğüs iRFP floresansının yanı sıra, tümör taşıyan farelerin vücut ağırlığı, tümör yükünün önemli bir doğrulayıcı göstergesi olarak hizmet eder. Ksenogreft kanseri MCS aşılamasından sonra ilerledikçe, fareler ilk olarak uyanıkken yeme, içme ve aktiviteler de dahil olmak üzere normal davranışlar sergilediler, yaklaşık 40. güne kadar, güçlü göğüs iRFP floresansı ile gösterildiği gibi ağır tümör yükü, vücut ağırlığında gözle görülür bir düşüşe ve normal davranışın kaybına neden oldu. İnsancıl yönergeleri izleyerek, hayvanlara vücut ağırlığında% 15-20 kayıpla ötenazi yapıldı. Kilo kaybının zamanlaması partiler arasında değişmekle birlikte, normal hayvan davranışının kaybıyla eşleşir ve bu nedenle hayvan sağlığının güvenilir bir göstergesi olarak da kullanılabilir.
NSCLC'nin ortotopik modelindeki kanser ilerlemesi öncelikle MCS aşılamasından sonra tutarlı ve stabil tümör büyümesi gösteren sol ve ventral yan floresan görüntüleme ile izlendi. Ventral taraftan floresan, muhtemelen (1) enjeksiyon derinliği ve (2) ileri kanser evrelerinde hem ortotopik hem de deri altı tümörlerin varlığı nedeniyle sol tarafa göre daha yavaş bir artış gösterdi. Spesifik olarak, MCS kaburga kemiklerinden toraksa aşılandı, bu da onu sol akciğerin dorsal yüzeyine bıraktı, böylece MCS'nin görüntülenmesi için sol akciğerin ventral yüzeyine büyümesi için bir gecikme süresi gerekiyordu. Tümör büyüdükçe, bazen göğüs duvarının iç yüzeyine yayıldı, böylece sol taraftaki görüntüleme için daha yüksek sinyaller vermek üzere floresan tarayıcıya yaklaştırdı. Bu nedenle, ventral taraftaki floresan görüntüleme, tümörü akciğerde daha doğru bir şekilde sundu, ancak tümörü tespit etmek genellikle daha uzun sürdü. İn vivo floresan görüntülemenin sonunda, hayvanlar sakrifiye edildi ve açık göğüs diseksiyonu ve ex vivo görüntülemeye tabi tutuldu, bu sadece MCS aşılamasından ortotopik tümörün oluşumunu doğrulamakla kalmadı, aynı zamanda insanlarda NSCLC'nin dört klinik aşamasını özetleyen çoklu anatomik özellikler gösterdi. 
Pilot etkinlik çalışmasında, akciğerlerin ex vivo görüntülemesi ile tümör taşıyan farelerin in vivo görüntülemesi arasındaki güçlü korelasyon, dinamik in vivo floresan görüntüleme metodolojisinin güvenilirliğini doğrulamaktadır. NSCLC'nin ortotopik modeli, hem terapötik etkinliğin önemli bir göstergesi olarak daha yavaş tümör büyümesi hem de ilaç toksisitesinin önemli bir göstergesi olarak vücut ağırlığı kaybı ile antikanser tedavilerine güvenilir bir şekilde yanıt verdi. Bu tür yanıtlar, modelin antikanser ilaç adaylarının klinik öncesi değerlendirmesi ve geliştirilmesi için değerli bir araç olduğunu göstermiştir. Akciğer kanserinin ayırt edici bir özelliği olan metastaz, modelde sadık bir şekilde özetlendi ve daha da önemlisi, antikanser ilacı sisplatin tarafından güvenilir bir şekilde engellendi. Bu pilot çalışmada sadece iki sisplatin enjeksiyonu ile daha yavaş tümör büyümesi gözlendi, bu da sisplatinin daha önemli bir antikanser etkisinin, dört haftalık dozların klinik olarak daha anlamlı bir rejiminden kaynaklanacağını düşündürdü. 
Bu raporun NSCLC'nin ortotopik modeli, akciğer kanserinin bir dizi yaygın hayvan modeline göre birkaç önemli avantaj taşımaktadır. Akciğer kanserinin deri altı ksenogreft modelleriyle karşılaştırıldığında, bu model tümörlerin etrafında daha ilgili bir doku mikroçevresi sunar; Genetik olarak tasarlanmış fare modeliyle karşılaştırıldığında, bu model daha uygun deneysel prosedürler ve daha tekrarlanabilir tümör ilerlemesi ve hayvan sağkalımı sunar. Bu model ile diğer akciğer kanseri modelleri arasında kapsamlı bir karşılaştırma önceki yayınımızda mevcuttur18. Diğer ksenogreft hayvan modellerine benzer şekilde, bu modelin bir sınırlaması, insan kanserlerinin önemli bir bileşeni olan tam bir bağışıklık sisteminin olmamasıdır. Ek olarak, bu modeldeki aşılanmış MCS bazen göğüs duvarının iç yüzeyinde primer ksenogreft tümörünü geliştirir. Bu nedenle, bu tür bir gelişmeyi kolayca tespit etmek ve en aza indirmek için deneysel prosedürler, bu modeli geliştirmek için gelecekteki çalışmalara dahil edilmelidir. Ayrıca, KHDAK'de tümör biyolojisi ve tedavi yanıtlarının daha kapsamlı bir şekilde anlaşılmasını sağlamak için her iki cinsiyeti de içeren çalışmalar yapılacaktır. Sonuç olarak, bu raporun murin ortotopik akciğer kanseri ksenogreft modeli, akciğer kanseri progresyonunu özetlemek ve antikanser tedavilerini değerlendirmek için öncü ve sağlam bir araç olarak durmaktadır. Bu model, KHDAK patolojisi hakkındaki anlayışımızı ilerletmek ve karşılık gelen terapötik müdahaleleri geliştirmek için muazzam bir potansiyele sahiptir.

Tüm onkolojik bozukluklar arasında, akciğer kanseri sadece en yüksek yaşam kaybına neden olmakla kalmaz, aynı zamanda ABD'de her yıl ikinci en yüksek yeni hasta sayısını talep etmektedir1. Bu yıkıcı malignite, modern sağlık hizmetlerinde büyük bir engel olarak durmakta ve karmaşık biyolojisinin ve daha etkili terapötik modalitelerinin daha derin bir şekilde anlaşılmasını gerektirmektedir2. Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), akciğer kanserinin %85'ini oluşturur ve solid tümörlere dönüşme eğilimindedir3. Akciğer kanserindeki en önemli zorluklardan biri, kanserin ilerlemesini ve terapötik müdahalelere verilen yanıtları derinden etkileyen dinamik ve heterojen tümör mikro çevresidir 4,5,6. NSCLC'nin farklı aşamalarında kanser hücreleri ve mikro çevreleri arasındaki etkileşimin daha derin bir şekilde anlaşılması, NSCLC ilerlemesinin histolojik özelliklerini özetleyen rafine patolojik modeller gerektirir.
Bu bağlamda, ortotopik hayvan modelleri, NSCLC araştırmaları için umut verici bir yol olarak ortaya çıkmaktadır. Yaygın olarak kullanılan deri altı ksenogreft modellerinin7 aksine, ortotopik modellerde doğrudan orijin organa aşılanan kanser hücreleri bulunur. Akciğer kanseri için bu, kanser hücrelerinin doğrudan akciğer dokusuna implante edilmesi anlamına gelir 8,9. Sonuç olarak, akciğer kanserinin ortotopik modelleri, komşu dokular, damarlar ve bağışıklık bileşenleri dahil olmak üzere doğal tümör mikro çevresini daha iyi taklit eder ve böylece fizyolojik ve klinik alaka düzeylerini geliştirir.
Üç boyutlu çok hücreli sferoidler (MCS), tümör ortamının özelliklerini özetlemek için umut verici bir başka yaklaşımı temsil eder. Çoğu kanser, çeşitli hücre-hücre etkileşimleri, hücre dışı matris ve oksijen ve besinlerdeki gradyanlar dahil olmak üzere karmaşık tümör mikro çevreleri ile karakterize edilir10,11. Geleneksel 2D hücre kültürleri, bu tümöre özgü özellikleri özetlemek için uzamsal ve yapısal karmaşıklıktan yoksundur12. Buna karşılık, uygun büyüklükteki MCS, hipoksik ve nekrotik bir çekirdeğe sahip heterojen bir yapıya sahiptir, bu da sadece intratümöral mikroçevreyi değil, aynı zamanda antikanser tedavisinde ilaç direncinin önemli bir mekanizması olan ilaç penetrasyonuna karşı fizyolojik bariyeri de özetler 13,14,15.
Hem ortotopik hayvan modellerinden hem de MCS kültür tekniklerinden yararlanan MCS, meme kanseri ve prostat kanserinin ortotopik modellerini başarılı bir şekilde oluşturmak için bağışıklığı baskılanmış farelere aşılanmıştır16,17. Burada, akciğer kanserinin bir murin ortotopik ksenogreft modelini oluşturmak ve karakterize etmek için ayrıntılı metodolojiyi sunuyoruz. Bu yöntem, floresan insan akciğer kanseri hücrelerinden (A549-iRFP) türetilen 3D MCS'nin intrapulmoner aşılamasını kullanır18. Bu model, NSCLC'nin dört klinik aşamasına yakından paralel olan aşamalar boyunca akciğer kanserinin in vivo ilerlemesini gözlemlemek için olağanüstü bir fırsat sunmaktadır. Ayrıca, bu modelin ksenogreft kanseri, klinik olarak belirlenmiş antiakciğer kanseri ilacı sisplatine yanıt verdi.

<table><tbody><tr><td>100 ve mikro; L Cam Şırınga</td><td>Hamilton</td><td>Parçası/REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>20 G İğne</td><td>Termo Fisher Scientific Inc.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu Ultra Düşük Bağlantılı Küresel Mikroplaka&nbsp;</td><td>Corning</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>Imanis Yaşam Bilimleri&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M Olgun Kemirgen Diyeti&nbsp;</td><td>Araştırma Diyetleri, Inc.</td><td></td><td></td>D10012M</tr><tr><td>Atimik Çıplak Fare</td><td>Charles River Laboratories, Inc.</td><td>Suş Kodu: 490; homozigot</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfin Hidroklorür</td><td>Patterson Veteriner</td><td>NDC Numarası: 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Hücre Canlılık Testi</td><td>Promega</td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>Kollajen</td><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Açık kaynak aracı (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Sürüm 5.2</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Patterson Veteriner</td><td>NDC Numarası: 17033-0091-25</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td>Patterson Veteriner</td><td>NDC Numarası: 50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop ve nbsp;</td><td>Keyence</td><td>Model numarası: BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Kızılötesi Görüntüleme 205 Sistemi&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Model numarası: 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy küçük hayvan görüntüleme sistemi&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>Model numarası: 9430</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin ve nbsp;</td><td>Corning</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td>AAJ67236XF</tr><tr><td>MATLAB'dan ReViSP yazılımı&nbsp;</td><td>Sourceforge'da açık kaynak aracı (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td> <td>Yok</td><td></td></tr><tr><td>Cerrahi Klipler - AutoClip Sistemi</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr><td>Ksilazin</td><td>Patterson Veteriner</td><td>NDC Numarası: 61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

küçük hücreli dışı akciğer kanserinde hastalık progresyonunu taklit eden ve İlaç aktivitelerini tahmin eden ortotopik ksenogreft modelinin oluşturulması

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK), karmaşık ve heterojen bir tümör mikroçevresi ile oldukça ölümcül bir hastalıktır. Şu anda, kanser hücresi süspansiyonlarının deri altı inokülasyonuna dayanan yaygın hayvan modelleri, NSCLC'deki tümör mikroçevresini özetlememektedir. Burada, üç boyutlu çok hücreli sferoidlerin (MCS) intrapulmoner inokülasyonunu kullanan bir murin ortotopik akciğer kanseri ksenogreft modelini tanımladık. Spesifik olarak, floresan insan NSCLC hücreleri (A549-iRFP), MCS oluşturmak için 3 hafta boyunca kollajen ile düşük bağlantılı 96 oyuklu mikroplakalarda kültürlendi, bunlar daha sonra ortotopik akciğer kanseri modelini oluşturmak için atimik çıplak farelerin sol akciğerine interkostal olarak aşılandı.
Orijinal A549 hücre hattı ile karşılaştırıldığında, A549-iRFP hücre hattının MCS'si, antikanser ilaçlarına benzer şekilde yanıt verdi. A549-iRFP hücrelerinin uzun dalga boylu floresan sinyali, sferoid hacmi, hücre canlılığı ve hücresel protein seviyesi dahil olmak üzere kanser hücresi büyümesinin ortak belirteçleri ile güçlü bir şekilde korelasyon gösterdi ve böylece floresan görüntüleme ile in vivo kanser büyümesinin dinamik olarak izlenmesine izin verdi. Farelere aşılandıktan sonra, A549-iRFP MCS ksenogrefti, primer tümörün genişlemesi, komşu sekonder tümörlerin ortaya çıkması ve kanser hücrelerinin kontralateral sağ akciğer ve uzak organlara metastazı dahil olmak üzere NSCLC'nin klinik aşamalarına çok benzeyen fazlar boyunca güvenilir bir şekilde ilerledi. Ayrıca model, antiakciğer kanseri ilacı olan sisplatine beklenen toksisite ve daha yavaş kanser ilerlemesi ile yanıt verdi. Bu nedenle, NSCLC'nin bu murin ortotopik ksenogreft modeli, hastalığın ilerlemesini özetlemek ve potansiyel antikanser ilaçların geliştirilmesini kolaylaştırmak için bir platform görevi görecektir.

A549-iRFP MCS'nin Karakterizasyonu A549-iRFP MCS, kollajen ve santrifüj yardımı ile sferoid mikroplakalarda başarılı bir şekilde kültürlendi. MCS 1 hafta sonra yaklaşık 500 μm çapa ulaştığında, hem A549 hem de A549-iRFP MCS, 3 gün boyunca çeşitli antikanser ilaçlarına ve formülasyonlarına maruz bırakıldı ve daha sonra 4 gün daha ilaçsız büyüme ortamında tutuldu. A549-iRFP MCS, ana A549 hücrelerininkini yakından yansıtan bir yanıt modeli sergiledi. A549 ve A549-iRFP MCS, akciğer kanserine karşı birinci basamak antikanser ilaçlardan biri olan sisplatine benzer doz-yanıt eğrileri ve IC50 değerleri gösterdi (Şekil 2A). A549 ve A549-iRFP MCS'nin canlılığı, diğer antikanser ilaçları veya formülasyonları tarafından benzer derecelerde inhibe edilmiştir (Şekil 2B).
A549-iRFP MCS, iRFP floresansı, hücre canlılığı ve hücresel protein seviyeleri ile 6 haftaya kadar bir süre boyunca izlendi. MCS'nin hacmi, faz-kontrast mikroskop görüntülerine dayalı yazılım simülasyonu ile tahmin edildi ve simüle edilen morfoloji, mikroskop ve floresan sinyali ile görüntülenenlere benzer şekiller sergiledi (Şekil 2C). A549-iRFP MCS'nin hücre canlılığı, 3D hücre canlılığı deneyi ile ölçüldü ve test, çapı 350 ila 950 μm arasında değişen çeşitli boyutlarda MCS ile doğrulandı. MCS içeren büyüme ortamı ile tahlil reaktifi arasında ve 5 dakika ile 10 dakikalık farklı çalkalama süreleri arasında çeşitli hacim oranlarında önemli bir fark gözlenmemiştir. (Ek Şekil S1). Dört biyobelirteçin tümü zamanla artmış, daha sonraki zaman noktalarında daha büyük varyasyonlar olmuştur (Şekil 2D). iRFP floresansı, MCS'nin diğer üç geleneksel kantitatif ölçümü ile güçlü korelasyonlar sergiledi: hacim (Pearson r = 0.9307, p &lt; 0.0001), hücre canlılığı (Pearson r = 0.7666, p &lt; 0.0001) ve hücresel protein (Pearson r = 0.7317, p &lt; 0.0001) (Şekil 2E).
Farelerde tümör ilerlemesi 2-3 hafta büyüdükten sonra, tümör aşılaması için morfoloji, MCS çapı, uygun pürüzlü kenarlar ve floresan sinyal (ayrıntılı parametreler için protokol bölüm 3'e bakınız) dahil olmak üzere uygun özelliklere sahip A549-iRFP MCS seçildi. Tümör aşılama ameliyatından sonra, tümör taşıyan farelerin vücut ağırlığı her 3 günde bir ölçüldü ve ameliyattan hemen önceki 0. gündeki ağırlığa kıyasla değişim oranı olarak sunuldu. Fare vücut ağırlığı ameliyattan sonra biraz azaldı ve 1 hafta içinde hızla iyileşti. Tedavi olmadan, vücut ağırlığı ~ 40. güne kadar kademeli olarak artmış, ancak sonraki hafta büyük ölçüde azalmıştır (~% 15), bu da ötenaziye yol açmıştır (üç kat anestezik aşırı doz: 80 mg / kg ketamin ve 12 mg / kg ksilazin IP enjeksiyonu yoluyla IP) IACUC yönergelerine göre farelerin (Şekil 3A). Tümör taşıyan fareler her 3 günde bir dört duruşta görüntülendi: sol, dorsal, sağ ve ventral taraflar. Bunlar arasında, denklem (1)'e göre net floresan yoğunluğunun ölçülmesi için sol (tümörün aşılandığı yer) ve ventral (akciğerlerin her iki tarafının da gözlenebildiği yer) anahtar duruşlar olarak seçildi (Şekil 3B,C). Her iki duruştan elde edilen net floresan yoğunluğu, ventral taraftan gelen floresan sol tarafa göre biraz daha yavaş büyüyerek benzer bir tümör ilerlemesi eğilimi gösterdi.
Bu ortotopik modeldeki MCS ksenogrefti, NSCLC'nin dört klinik aşamasını yansıtan farklı fazlar boyunca ilerlemiştir (Şekil 3D)18,19,20. MCS aşılamasından sonraki 8. gün civarında, sol akciğerde konsantre floresan ortaya çıktı ve bu da klinik ortamlarda Evre 1 NSCLC ile uyumlu lokalize bir tümörün kurulduğunu gösterdi. Yaklaşık 11. günde, floresan belirgin şekilde yoğunlaştı ve / veya sol akciğerdeki birden fazla bölgeye dağıldı, bu da Evre 2 NSCLC'ye benzeyen tümör (ler) in varlığını gösterir. Daha sonra, yaklaşık 18. günde, ventral taraftan artan floresan sinyalleri gözlendi, bu da ksenogreftin Aşama 3 benzeri ilerlemesini düşündürdü. Ayrıca, anatomik muayene ve ex vivo görüntüleme, Evre 3 NSCLC'nin önemli bir özelliği olan kalbin yüzeyinde tümör büyümesini ortaya çıkardı. MCS aşılamasından yaklaşık 27. günde, akciğerin her iki tarafında perfüze floresan ortaya çıktı ve açık göğüs anatomisi, kalp, trakea ve ana kan damarlarında perfüze tümör büyümesini ortaya çıkardı, bu da Evre 4 NSCLC'ye benzer kanser metastazı göstergesidir.
Tümör taşıyan farelerin sisplatine yanıtı Bu ortotopik akciğer kanseri murin modeli üzerinde bir pilot etkinlik çalışması yapılmıştır. Tümör aşılamasından on gün sonra, tümör taşıyan farelerin kuyruk damarı yoluyla haftada bir enjeksiyon, toplam iki enjeksiyon olmak üzere 5 mg / kg sisplatin veya normal salin enjekte edildi. Tümör taşıyan farelerde ventral yan görüntüler Şekil 4A'da sunulmuştur. Vücut ağırlığı ve tümör floresansı her 3-4 günde bir izlendi. Normal salin grubu ile karşılaştırıldığında, sisplatin grubundaki fareler her sisplatin enjeksiyonundan sonra önemli vücut ağırlığı kaybetti, ancak sisplatin tedavisinden sonraki haftalarda iyileşti (Şekil 4B). Sisplatin grubundaki net floresan yoğunluğu, salin grubundakinden daha yavaş bir artış eğilimi göstermiştir (Şekil 4C). İn vivo floresan izlemenin sonunda, hayvanlar sakrifiye edildi ve akciğerleri diseke edildi ve floresan ile görüntülendi. Toplam doku proteini tarafından normalleştirildikten sonra, sisplatin grubundaki farelerden diseke edilen akciğerlerin floresan yoğunluğunun normal salin grubundan daha düşük olduğu doğrulandı. (Şekil 4E). Ventral floresan görüntülemede (Şekil 4A), kırmızı dikdörtgenlerdeki görüntüler, tümör floresansının hem sol hem de sağ akciğerlerde ilk kez görüntülendiğini gösterir, bu da Evre IV NSCLC'de tümör metastazının önemli bir göstergesidir. Birinci basamak akciğer kanseri ilaçlarından biri olan sisplatin, sol akciğerden sağ akciğere tümör metastazını yavaşlatmıştır (Şekil 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg"> Şekil 1: Çalışmanın akış şeması. (A) Kollajen ve santrifüjleme yardımıyla MCS oluşturmak için A549-iRFP hücrelerinin küresel mikroplakalara ekilmesi. (B) Klinik ortamlarda akciğer kanserinin dört aşamasını taklit eden ortotopik akciğer kanseri ksenogreft modelini oluşturmak için uygun özelliklere sahip A549-iRFP MCS'nin bir farenin sol akciğerine intrapulmoner aşılanması. Bir MCS içeren beyaz şırınga, tümör aşılamasını gösterirken, iki kırmızı şırınga kuyruk damarı yoluyla uygulanan ilaç tedavisini gösterir. Kısaltma: MCS = çok hücreli sferoid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg"> Şekil 2: A549-iRFP MCS'nin karakterizasyonu. (A) A549-iRPF MCS ve A549 MCS'nin 3 günlük maruziyet ve 4 günlük ilaçsız büyümeden sonra sisplatine doz-yanıt eğrileri (Ortalama ± SD, N = 3-4). (B) Antikanser tedavilerine (sisplatin, paklitaksel veya kurum içinde geliştirilen iki ilaç formülasyonu) 3 günlük maruziyetten ve 4 günlük ilaçsız büyümeden sonra A549-iRFP MCS'nin hücre canlılığı (Ortalama ± SD, N = 3-4). (C) Kontrast faz mikroskobu (C1, ölçek çubuğu = 500 μm), floresan konfokal mikroskopi (C2) ve yazılım simülasyonu (C3) ile 1-6 haftalık kültürlemeden sonra temsili A549-iRFP MCS'nin morfolojik çalışmaları. (D) A549-iRFP MCS'nin iRFP floresansı, hacmi, hücre canlılığı ve hücresel proteininin 1-6 hafta boyunca dinamik değişimi (iRFP floresansı ve hacmi için N = 10; Hücre canlılığı ve hücresel protein için N = 5). (E) A549-iRFP MCS'nin iRFP floresansının 1-6 hafta boyunca diğer üç geleneksel büyüme ölçümü (hacim, hücre canlılığı ve hücresel protein) ile korelasyonu (N = 60). (F) Tümör aşılaması için uygun özelliklere sahip bir A549-iRFP MCS örneği (ölçek çubuğu = 500 μm). Kısaltma: MCS = çok hücreli sferoid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg"> Şekil 3: NSCLC'nin ortotopik murin modelinde tümör ilerlemesi. (A) Tümör aşılamasından sonra farelerin vücut ağırlığındaki değişiklik (Ortalama ± SEM, N = 5). (B) Sol taraf görüntülemeye dayalı olarak tümör taşıyan farelerde net floresan yoğunluğunun dinamik değişimi (N = 5). (C) Ventral yan görüntülemeye dayalı olarak tümör taşıyan farelerde net floresan yoğunluğunun dinamik değişimi (N = 5). (D) NSCLC'nin dört klinik aşamasını taklit eden kanser ilerlemesi. Sol taraf görüntüleme, ventral taraf görüntüleme, anatomik gözlem (sarı oklar akciğerdeki ve kalp yüzeyindeki tümörleri gösterir) ve temsili tümör taşıyan farelerin dört aşamada ex-vivo görüntülemesi. Bu rakam Huang ve ark.18'den alınmıştır. Kısaltma: NSCLC = küçük hücreli dışı akciğer kanseri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg"> Şekil 4: Tümör taşıyan farelerin sisplatine tepkisi. (A) Salin veya sisplatin ile tedaviden sonra tümör taşıyan farelerin ventral taraflı görüntülenmesi (kırmızı dikdörtgenlerdeki görüntüler, tümör floresansının hem sol hem de sağ akciğerlerde ilk kez ne zaman görüntülenebileceğini gösterir). (B) Salin veya sisplatin tedavilerinden sonra tümör taşıyan farelerin vücut ağırlığındaki değişiklik (Ortalama ± SEM, N = 3-4). (C) Ventral yan görüntülemeye dayalı salin veya sisplatin tedavilerinden sonra tümör taşıyan farelerde net floresan yoğunluğunun dinamik değişimi (Ortalama ± SEM, N = 3-4). (D) Hem sol hem de sağ akciğerlerde tümör floresansı gösteren farelerin yüzdesi. (E) İn vivo floresan görüntülemenin sonunda feda edilen farelerden diseke edilen akciğerlerin normalleştirilmiş floresan yoğunluğu (Ortalama ± SEM, N = 3-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Çeşitli çaplarda A549-iRFP MCS üzerinde 3D hücre canlılığı testi. (A) ~350 μm; (B) ~550 μm; (C) ~750 μm; (D) ~950 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu çalışma, floresan A549-iRFP hücrelerinin çok hücreli sferoidlerinin intrapulmoner inokülasyonuna dayanan ortotopik küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) modelini sunmaktadır. Model, klinik NSCLC aşamalarını özetler ve uzun dalga boylu floresanın dinamik in vivo izlemesine göre sisplatine yanıt verir.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hastalık Progresyonunu Taklit Eden ve İlaç Aktivitelerini Tahmin Eden Ortotopik Ksenogreft Modelinin Oluşturulması

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

construction-an-orthotopic-xenograft-model-non-small-cell-lung-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu makale, dolaşımdaki tümör hücrelerinden (CTC'ler) prostat kanseri hastasından türetilen ksenogreftler (PDX'ler) oluşturmak için kullanılan bir yöntemi detaylandırmaktadır. CTC'lerden PDX modellerinin oluşturulması, prostat kanserini incelemek için alternatif bir deneysel model sağlar; En sık teşhis edilen tümör ve erkeklerde kanserden sık görülen bir ölüm nedenidir.

Prostat Kanseri Hasta Üretimi Tümör Hücreleri Sirkülasyon gelen Xenograftlarında Modeller Türetilmiş

Küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NSCLC) hedefli tedavilere karşı duyarlılığı incelemek için biyolojik bir kollajen iskelesine dayalı üç boyutlu (3D) bir akciğer kanseri modeli sunuyoruz. Proliferasyon indeksi, apoptoz ve epitelyal-mezenkimal geçiş (EMT) durumunu belirlemek için farklı okuma teknikleri gösteriyoruz. Toplanan veriler, ilaç duyarlılığının tahmini için in silico bir modele entegre edilmiştir.

Kombine bir 3D doku mühendisliği<em&gt; İn Vitro</em&gt; /<em&gt; Siliko</emSpesifik mutasyonel Arka İlaç Etkinliği tahmin için&gt; Akciğer Tümör Modeli

Prostat kanseri, Amerika Birleşik Devletleri'nde kansere bağlı ölümlerin en sık ikinci nedenidir. Ortotopik bir kanser modeli, prostat kanserinin biyolojisini anlamak ve terapötik rejimlerin etkinliğini değerlendirmek için yararlı bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, ortotopik bir prostat kanseri fare modeli oluşturmak için gerekli ayrıntılı adımları açıklar.

İnsan Prostat Kanseri klinik öncesi Ortotopik murin modeli

deri altı klinik öncesi modelde hasta kaynaklı tümörler kullanarak yeni tedavilerin, öngörü biyomarker keşif ve ilaca dirençli yolların etkinliğini incelemek için mükemmel bir yoldur. Bu model, ilaç geliştirme sürecinde, klinik araştırma önce birçok yeni anti-kanser terapisi kaderini belirlemede önemlidir.

Bir Klinik öncesi Hasta Türetilmiş Tümör Roman Anti-Kanser Tedaviler Soruşturma Xenograftlarında Modeli Geliştirilmesi ve Bakımı

Biz önceden airways yaralanma ile Klima tarafından fare ciğerlerine akciğer kanser hücrelerinin orthotopic engraftment önemli ölçüde geliştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yaklaşım aynı zamanda akciğer microenvironment, metastatik yayılması, akciğer kanseri komorbiditeler içinde stromal etkileşimleri çalışmaya uygulanabilir ve daha verimli bir şekilde hasta oluşturmak için xenografts türetilmiş.

Bleomycin ile fareler Airways önceden Merkezi Klima Orthotopic akciğer kanseri hücre Engraftment verimliliğini artırır

Burada, biyolojik ilgili sitelerdeki kanser için güvenilir preklinik modelleri oluşturmak için bir protokol ultrason destekli enjeksiyon Nöroblastom (NB) ve Ewing sarkomu (ES) hücre yararlanmak için (hücre satırları ve hasta kaynaklı tümör hücreleri kurulu) mevcut araştırma.

Ultrason kullanımı doku Yönetmen: hücresel implantasyon biyolojik ilgili metastatik tümör Xenografts kurulması için güdümlü

Burada küçük hücreli dışı akciğer kanseri çalışma için zaman ve maliyet azaltma mankenlik minimal invaziv syngeneic orthotopic nakli manken fare akciğer adenokarsinom hücre açıklayın.

Orthotopic nakli PD-L1 ifade çalışmaya Syngeneic akciğer adenokarsinom hücre

Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.

Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri

Bu protokol, anaplastik tiroid karsinomu (ATC) ve baş boyun skuamöz hücreli karsinomunun (HNSCC) hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modelini oluşturmakta ve karakterize etmektedir, çünkü PDX modelleri translasyonel onkoloji alanında hızla standart hale gelmektedir.

Anaplastik Tiroid Karsinomu ve Baş-Boyun Skuamöz Hücreli Karsinomun Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması ve Karakterizasyonu

Ortotopik pediatrik beyin tümörü modellerinin geliştirilmesi, kanser hücrelerini hassas bir şekilde implante etmek için stereotaksik bir cihaz kullanarak titiz bir hassasiyet gerektirir. Burada sunulan metodoloji, beyin tümörü hücrelerinin hazırlanması, intrakraniyal enjeksiyonların gerçekleştirilmesi ve beyin tümörü aşılanmasını değerlendirmek için ameliyat sonrası bir izleme sisteminin uygulanmasında yer alan adımları özetlemektedir.

Stereotaksik Cihaz Kullanılarak Beyin Tümörleri İçin Ortotopik Hasta Kaynaklı Ksenogreft Modellerinin Oluşturulması

Akciğer kanseri için yeni tedaviler geliştirmenin en büyük zorluğu, bölgesel hastalık metastatik hastalığa ilerlerken tümör mikro çevresinin modellenmesini içerir. Burada, zaman içinde hastalığın in vivo olarak izlenmesine izin veren ortotopik bir sinjeneik akciğer kanseri modeli oluşturmanın basit bir yöntemini açıklıyoruz.

Akciğer Kanserinin Sinjeneik Ortotopik Fare Modelini Oluşturmak için Minimal İnvaziv Bir Yöntem

Keşfedin, küçük hücreli dışı akciğer kanserinde çok hücreli sferoidler kullanarak ortotopik ksenogreft modeli oluşturmayı. Bu yöntem, klinik evreleri taklit ederek ilaç aktivitelerini tahmin etmeye yardımcı olur.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hastalık Progresyonunu Taklit Eden ve İlaç Aktivitelerini Tahmin Eden Ortotopik Ksenogreft Modelinin Oluşturulması (Video) | JoVE Journal

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hastalık Progresyonunu Taklit Eden ve İlaç Aktivitelerini Tahmin Eden Ortotopik Ksenogreft Modelinin Oluşturulması

Daha fazla video keşfet