Name: Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığında Yağ Birikiminin İn Vitro Modellenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Keşfedin, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığını in vitro modellemek için oleik asit ile tedavi edilmiş HepG2 hücrelerinin kullanımını. Yağ birikimi mekanizmalarını ve lipid içeriği değerlendirme yöntemlerini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, İç Moğolistan Özerk Bölgesi Bilim ve Teknoloji Bölümü bilim ve teknoloji programının 2018 Destekli Projesi kapsamında "Koumiss'in Moğol tıbbının bölgesel hastalıkları üzerindeki iyileştirici etkisinin temel konuları üzerine çalışma" tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, aletler ve reaktiflerle ilgili ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakın.
1. Hücre kültürü
<ol><li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium'unu (DMEM) (% 10 fetal sığır serumu [FBS], 100 birim / mL penisilin ve 100 μg / mL streptomisin içeren) içeren kültür şişelerinde kültür HepG2 hücrelerinin kültürü. Kültür şişelerini %5'lik bir CO2 inkübatörde 37 ° C'de tutun.</li>
</ol>2. Oleik asidin hücre sayma kiti-8 ile ölçülen hücre canlılığı üzerindeki etkisi
<ol><li>200 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için belirli bir OA hacmini dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Solüsyonu ileride kullanmak üzere -20 °C'de saklayın.</li>
	<li>Oyuk başına 6 × 10 3 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu bir plakada tohumHepG2 hücreleri. Her oyuğa 100 μL DMEM ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 inkübatörde 24 saat inkübe edin ve kültürleyin. HepG2 hücrelerini iki gruba ayırın:<ol><li>Kontrol grubu: hücre kültürü ortamı ekleyin.</li>
		<li>OA grubu: 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM'lik nihai konsantrasyonları elde etmek için hücre kültürü ortamına OA ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>İlk inkübasyondan 24 saat sonra, süpernatanı her bir oyuktan atın ve kuyucuk başına 100 μL ekleyerek belirtilen gruplamaya göre OA ekleyin. Kontrol grubu için, her oyuğa 100 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Hücreleri 24 saat daha inkübe etmeye devam edin. NOT: Her grubun altı çoğaltma kuyusu olduğundan emin olun. Buharlaşmayı önlemek için, 96 oyuklu plakadaki oyukların dış halkasına 100 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin.</li>
	<li>24 saatlik inkübasyondan sonra, her bir oyuğa 10 μL hücre sayma kiti-8 (CCK-8) ekleyin, hafifçe karıştırın ve karanlıkta 2 saat inkübe edin. 96 oyuklu plakayı inkübatörden çıkarın, mikroplaka okuyucuya yerleştirin ve absorbans değerini 450 nm'de (A450) ölçün. GI50 değerleri OD'ye göre sayıldı.</li>
</ol>3. Hücre içi lipid damlacık oluşumunu gözlemlemek için Yağ Kırmızısı O boyama
<ol><li>HepG2 hücrelerini, oyuk başına 5 × 105 hücre yoğunluğunda 6 oyuklu hücre kültürü plakalarında tohumlayın ve plakaları 24 saat boyunca sabit sıcaklıkta bir inkübatörde kültürleyin. Açıklanan adımların görsel bir temsili için Şekil 1'e bakın.</li>
	<li>24 saatlik hücre kültüründen sonra, her bir oyuğa OA içeren 2 mL hücre kültürü ortamı ekleyin ve 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM'lik nihai konsantrasyonlar elde edin. Ek bir 24 saat sonra, hücre kültürü ortamını her bir oyuktan çıkarın ve PBS ile iki kez yıkayın. Her oyuğa 1 mL ORO fiksatif ekleyin ve 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Boyama çözeltisi A'yı boyama çözeltisi B ile 3:2 oranında karıştırarak ORO boyama çözeltisini hazırlayın. Karışımı oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, ardından 0,45 μm'lik bir filtreden bir kez süzün. Filtrelenmiş çözeltiyi kullanıma kadar ışıktan korunan bir santrifüj tüpünde saklayın.</li>
	<li>Sabitleyiciyi atın ve damıtılmış suyla iki kez yıkayın. Her oyuğa 1 mL% 60 izopropanol ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. İzopropanol çözeltisinin% 60'ını atın ve 20 dakika inkübe etmeden önce her bir kuyucuğa 1 mL taze hazırlanmış ORO leke çözeltisi ekleyin. ORO boyama solüsyonunu atın, her oyuğa 1 mL% 60 izopropanol ekleyin ve 30 saniye inkübe edin. Fazla boyayı çıkarmak için 5 kez suyla yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri damıtılmış suyla örtün ve mikroskop altında gözlemleyin. Görüntüler toplandıktan sonra, plakadaki sıvıyı atın ve kurumasını bekleyin. Daha sonra, her bir oyuğa 2 mL izopropanol ekleyin ve plakayı bir orbital çalkalayıcı üzerinde 10 dakika çalkalayın. Sıvıyı, her grupta 16 kuyucuk bulunan ve kuyucuk başına 100 μL ekleyen 96 oyuklu yeni bir plakaya aktarın. 510 nm'de (A510) bir mikroplaka okuyucu kullanarak her bir oyuğun optik yoğunluğunu (OD) ölçerek lipit içeriğini hesaplayın.</li>
</ol>4. Farklı oleik asit konsantrasyonlarının HepG2 hücre süpernatanında toplam trigliserit üzerindeki etkileri
<ol><li>Kiti oda sıcaklığında 20 dakika dengeleyin ve deney için gerekli plakaları hazırlayın.</li>
	<li>Hücre süpernatanını toplayın ve 1,570 × g'da 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Standart kuyuları ayarlayın ve numune kuyularını test edin. Standart kuyucuklara 50 μL standart ([S0 → S5] konsantrasyonu ve ardından: 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 mmol / L) ekleyin. Boş ve standart kuyucuklara ek olarak, numune kuyucuklarına 10 μL farklı numune ekleyin, ardından her bir kuyucuğa 40 μL numune seyreltici ekleyin. Her oyuğa 100 μL tespit antikoru-yaban turpu peroksidaz ekleyin, bir plaka zarı ile kapatın ve sabit sıcaklıktaki bir fırında 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.</li>
	<li>Süpernatanı atın, tozsuz kağıt üzerinde kurulayın ve her birini 1x yıkama solüsyonuyla yıkayın. 1 dakika oda sıcaklığında bekletin. Yıkama işlemini 5 kez tekrarlayın.</li>
	<li>Her oyuğa 50 μL substrat A ve 50 μL substrat B ekleyin. Nazikçe karıştırın ve 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Her kuyucuğa 50 μL sonlandırma çözeltisi ekleyin ve her kuyucuğun OD değerini 15 dakika içinde 450 nm'de (A450) ölçün.</li>
	<li>Doğrusal regresyon gerçekleştirmek için x ekseni boyunca standardın konsantrasyonunu ve y ekseni boyunca karşılık gelen absorbans (OD) değerini çizin ve her bir numunenin konsantrasyon değerini hesaplamak için eğri denklemini türetin.</li>
</ol>5. İstatistiksel analiz
<ol><li>Nicel verilerdeki önemli farklılıkları belirleyin.</li>
	<li>Ortalama ± standart sapmayı (SD) hesaplayın ve verileri grafiksel olarak gösterin. P < 0.05'i istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edin.</li>
</ol>

Metabolik Hastalık Analizi için Oleik Asit Kaynaklı HepG2 Hücreleri 

<ol><li>Alisi, A., Feldstein, A. E., Villani, A., Raponi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pediatric+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+a+multidisciplinary+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Pediatric nonalcoholic fatty liver disease: a multidisciplinary approach.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 9 (3), 152-161 (2012).</li>
<li>Anania, C., Perla, F. M., Olivero, F., Pacifico, L., Chiesa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediterranean+diet+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Mediterranean diet and nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 24 (19), 2083-2094 (2018).</li>
<li>Bessone, F., Razori, M. V., Roma, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathways+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+development+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Molecular pathways of nonalcoholic fatty liver disease development and progression.</a> Cell Mol Life Sci. 76 (1), 99-128 (2019).</li>
<li>Katsiki, N., Mikhailidis, D. P., Mantzoros, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+dyslipidemia%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and dyslipidemia: An update.</a> Metabolism. 65 (8), 1109-1123 (2016).</li>
<li>European Association for the Study of the Liver (EASL); European Association for the Study of Diabetes (EASD); European Association for the Study of Obesity (EASO). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EASL-EASD-EASO+Clinical+Practice+Guidelines+for+the+Management+of+Non-Alcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Obes+Facts%22%5BJournal%5D)">EASL-EASD-EASO Clinical Practice Guidelines for the Management of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease.</a> Obes Facts. 9 (2), 65-90 (2016).</li>
<li>Chalasani, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+and+management+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+Practice+guidance+from+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The diagnosis and management of nonalcoholic fatty liver disease: Practice guidance from the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 67 (1), 328-357 (2018).</li>
<li>Díaz, L. A., Arab, J. P., Louvet, A., Bataller, R., Arrese, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intersection+between+alcohol-related+liver+disease+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The intersection between alcohol-related liver disease and nonalcoholic fatty liver disease.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 20 (12), 764-783 (2023).</li>
<li>Cotter, T. G., Rinella, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease+2020%3A+The+state+of+the+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease 2020: The state of the disease.</a> Gastroenterology. 158 (7), 1851-1864 (2020).</li>
<li>Lonardo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+mechanisms+for+and+treatment+of+NAFLD+or+NASH+occurring+after+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Metabolic mechanisms for and treatment of NAFLD or NASH occurring after liver transplantation.</a> Nat Rev Endocrinol. 18 (10), 638-650 (2022).</li>
<li>Papatheodoridi, M., Cholongitas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease+%28NAFLD%29%3A+Current+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Pharm+Des%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD): Current concepts.</a> Curr Pharm Des. 24 (38), 4574-4586 (2018).</li>
<li>Van Herck, M. A., Vonghia, L., Francque, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease-a+starter%27s+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Animal models of nonalcoholic fatty liver disease-a starter's guide.</a> Nutrients. 9 (10), 1072(2017).</li>
<li>Wieckowska, A., Feldstein, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+invasive+versus+noninvasive%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease: invasive versus noninvasive.</a> Semin Liver Dis. 28 (4), 386-395 (2008).</li>
<li>Stein, L. L., Dong, M. H., Loomba, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+sensitizers+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease+and+steatohepatitis%3A+Current+status%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Ther%22%5BJournal%5D)">Insulin sensitizers in nonalcoholic fatty liver disease and steatohepatitis: Current status.</a> Adv Ther. 26 (10), 893-907 (2009).</li>
<li>Milić, S., Lulić, D., Štimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Neuschwander-Tetri, B. A., Caldwell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+steatohepatitis%3A+summary+of+an+AASLD+Single+Topic+Conference%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic steatohepatitis: summary of an AASLD Single Topic Conference.</a> Hepatology. 37 (5), 1202-1219 (2003).</li>
<li>Du, J., Zhao, L., Kang, Q., He, Y., Bi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+method+for+Oil+Red+O+staining+with+the+salicylic+acid+ethanol+solution%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">An optimized method for Oil Red O staining with the salicylic acid ethanol solution.</a> Adipocyte. 12 (1), 2179334(2023).</li>
<li>Mehlem, A., Hagberg, C. E., Muhl, L., Eriksson, U., Falkevall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+neutral+lipids+by+Oil+Red+O+for+analyzing+the+metabolic+status+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Imaging of neutral lipids by Oil Red O for analyzing the metabolic status in health and disease.</a> Nat Protoc. 8 (6), 1149-1154 (2013).</li>
<li>Estes, C., Razavi, H., Loomba, R., Younossi, Z., Sanyal, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+the+epidemic+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease+demonstrates+an+exponential+increase+in+burden+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Modeling the epidemic of nonalcoholic fatty liver disease demonstrates an exponential increase in burden of disease.</a> Hepatology. 67 (1), 123-133 (2018).</li>
<li>Watkins, P. A., Ellis, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxisomal+acyl-CoA+synthetases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Peroxisomal acyl-CoA synthetases.</a> Biochim Biophys Acta. 1822 (9), 1411-1420 (2012).</li>
<li>Heeren, J., Scheja, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic-associated+fatty+liver+disease+and+lipoprotein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic-associated fatty liver disease and lipoprotein metabolism.</a> Mol Metab. 50, 101238(2021).</li>
<li>Kim, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+isoquercitrin+on+free+fatty+acid-induced+lipid+accumulation+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Effect of isoquercitrin on free fatty acid-induced lipid accumulation in HepG2 cells.</a> Molecules. 28 (3), 1476(2023).</li>
<li>Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lycopus+lucidus+Turcz.+ex+Benth.+attenuates+free+fatty+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells+and+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+high-fat+diet-induced+obese+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Phytomedicine%22%5BJournal%5D)">Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice.</a> Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hesperetin+ameliorates+hepatic+oxidative+stress+and+inflammation+via+the+PI3K%2FAKT-Nrf2-ARE+pathway+in+oleic+acid-induced+HepG2+cells+and+a+rat+model+of+high-fat+diet-induced+NAFLD%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Funct%22%5BJournal%5D)">Hesperetin ameliorates hepatic oxidative stress and inflammation via the PI3K/AKT-Nrf2-ARE pathway in oleic acid-induced HepG2 cells and a rat model of high-fat diet-induced NAFLD.</a> Food Funct. 12 (9), 3898-3918 (2021).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protopanaxadiol+ameliorates+NAFLD+by+regulating+hepatocyte+lipid+metabolism+through+AMPK%2FSIRT1+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Protopanaxadiol ameliorates NAFLD by regulating hepatocyte lipid metabolism through AMPK/SIRT1 signaling pathway.</a> Biomed Pharmacother. 160, 114319(2023).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zeaxanthin+prevents+ferroptosis+by+promoting+mitochondrial+function+and+inhibiting+the+p53+pathway+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Biol+Lipids%22%5BJournal%5D)">Zeaxanthin prevents ferroptosis by promoting mitochondrial function and inhibiting the p53 pathway in free fatty acid-induced HepG2 cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Biol Lipids. 1868 (4), 159287(2023).</li>
<li>Mun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+extract+of+Curcuma+longa+L.+ameliorates+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Water extract of Curcuma longa L. ameliorates non-alcoholic fatty liver disease.</a> Nutrients. 11 (10), 2536(2019).</li>
<li>Park, M., Yoo, J. H., Lee, Y. S., Lee, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lonicera+caerulea+extract+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+free+fatty+acid-induced+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Lonicera caerulea extract attenuates non-alcoholic fatty liver disease in free fatty acid-induced HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Nutrients. 11 (3), 494(2019).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-naphthoflavone+attenuates+non-alcoholic+fatty+liver+disease+in+oleic+acid-treated+HepG2+hepatocytes+and+in+high+fat+diet-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Alpha-naphthoflavone attenuates non-alcoholic fatty liver disease in oleic acid-treated HepG2 hepatocytes and in high fat diet-fed mice.</a> Biomed Pharmacother. 118, 109287(2019).</li>
<li>Alkhatatbeh, M. J., Lincz, L. F., Thorne, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+simvastatin+concentrations+reduce+oleic+acid-induced+steatosis+in+HepG%282%29+cells%3A+An+in+vitro+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Ther+Med%22%5BJournal%5D)">Low simvastatin concentrations reduce oleic acid-induced steatosis in HepG(2) cells: An in vitro model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> Exp Ther Med. 11 (2), 1487-1492 (2016).</li>
<li>Cui, W., Chen, S. L., Hu, K. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+and+mechanisms+of+oleic+acid-induced+steatosis+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Transl+Res%22%5BJournal%5D)">Quantification and mechanisms of oleic acid-induced steatosis in HepG2 cells.</a> Am J Transl Res. 2 (1), 95-104 (2010).</li>
<li>Guo, X., Yin, X., Liu, Z., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+%28NAFLD%29+pathogenesis+and+natural+products+for+prevention+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) pathogenesis and natural products for prevention and treatment.</a> Int J Mol Sci. 23 (24), 15489(2022).</li>
<li>Rafiei, H., Omidian, K., Bandy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dietary+polyphenols+protect+against+oleic+acid-induced+steatosis+in+an+in+vitro+model+of+NAFLD+by+modulating+lipid+metabolism+and+improving+mitochondrial+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Dietary polyphenols protect against oleic acid-induced steatosis in an in vitro model of NAFLD by modulating lipid metabolism and improving mitochondrial function.</a> Nutrients. 11 (3), 541(2019).</li>
<li>Tie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaempferol+and+kaempferide+attenuate+oleic+acid-Induced+lipid+accumulation+and+oxidative+stress+in+HepG2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Kaempferol and kaempferide attenuate oleic acid-Induced lipid accumulation and oxidative stress in HepG2 cells.</a> Int J Mol Sci. 22 (16), 8847(2021).</li>
<li>Fang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diosgenin+ameliorates+palmitic+acid-induced+lipid+accumulation+via+AMPK%2FACC%2FCPT-1A+and+SREBP-1c%2FFAS+signaling+pathways+in+LO2+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Complement+Altern+Med%22%5BJournal%5D)">Diosgenin ameliorates palmitic acid-induced lipid accumulation via AMPK/ACC/CPT-1A and SREBP-1c/FAS signaling pathways in LO2 cells.</a> BMC Complement Altern Med. 19 (1), 255(2019).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLKL-dependent+signaling+regulates+autophagic+flux+in+a+murine+model+of+non-alcohol-associated+fatty+liver+and+steatohepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">MLKL-dependent signaling regulates autophagic flux in a murine model of non-alcohol-associated fatty liver and steatohepatitis.</a> J Hepatol. 73 (3), 616-627 (2020).</li>
<li>Scavo, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+oleic%2Fpalmitic+acid+imbalance+in+exosomes+isolated+from+NAFLD+patients+induces+necroptosis+of+liver+cells+via+the+elongase-6%2FRIP-1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The oleic/palmitic acid imbalance in exosomes isolated from NAFLD patients induces necroptosis of liver cells via the elongase-6/RIP-1 pathway.</a> Cell Death Dis. 14 (9), 635(2023).</li>
<li>Chavez-Tapia, N. C., Rosso, N., Tiribelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+intracellular+lipid+accumulation+in+a+new+model+of+non-alcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Effect of intracellular lipid accumulation in a new model of non-alcoholic fatty liver disease.</a> BMC Gastroenterol. 12, 20(2012).</li>
<li>Ricchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effect+of+oleic+and+palmitic+acid+on+lipid+accumulation+and+apoptosis+in+cultured+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes.</a> J Gastroenterol Hepatol. 24 (5), 830-840 (2009).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmemektedir.

MASLD, alkol ve diğer yerleşik karaciğere zarar veren ajanların dışındaki faktörlere bağlı olarak hepatositlerde aşırı hücre içi yağ birikimi ile karakterize klinikopatolojik bir sendromdur18. MASLD, özellikle insülin direnci ve genetik yatkınlık ile ilişkili olan edinilmiş metabolik stres karaciğer hasarı ile karmaşık bir şekilde bağlantılıdır. MASLD için ilaçları etkili bir şekilde incelemek ve taramak için uygun bir deneysel model seçmek çok önemlidir. Bir hücre modeli oluşturmak, patolojik mekanizmaların daha derin bir şekilde anlaşılmasını ve yeni ilaç etkilerinin değerlendirilmesini kolaylaştıran MASLD araştırmalarında özellikle hayati önem taşır.
Bu protokol, OA ile indüklenen HepG2 hücreleri aracılığıyla oluşturulan bir in vitro MASLD modelini tanımlar. ORO boyama ve lipid içerik analizi, bu modeli oluşturmak için kritik yöntemler olarak hizmet eder. Ek olarak, hücre süpernatantlarında hücre canlılığının ve toplam TG içeriğinin değerlendirilmesi, uygun OA konsantrasyonunun değerlendirilmesi için esastır. MASLD için tanı kriteri, karaciğer hücrelerindedepolanan% 5'in üzerinde TG'nin varlığını içerir 19,20. MASLD hücre modelleri öncelikle, çeşitli yerel ve uluslararası çalışmalarda yağlı karaciğer dejenerasyon modellerinin oluşturulmasında başarılı kullanımları ile bilinen HepG2 hücreleri 21,22,23,24,25,26,27,28'e dayanır. Hepatoma hücrelerinden köken almalarına rağmen, HepG2 hücreleri hepatositlerle birçok fenotipik özelliği paylaşır ve kolayca yetiştirilir ve çoğaltılır29,30. CCK-8 kiti, ORO boyama, lipid içeriği ve toplam TG ölçümleri gibi testler, çalışma deneklerinde hücre canlılığını, yağ birikimini ve lipid içeriğini değerlendirmek için basit, objektif ve makul yaklaşımlar sunar. Bu bağlamda, OA, enerji alımı tüketimi aştığında fazla enerjinin lipitler şeklinde depolandığı MASLD31'in patogenezi ile uyumludur.
Araştırmacılar, MASLD modelini çoğaltmak için OA 23,28,31,32,33, palmitik asit 34,35 ve oleik/palmitik asit26,36 kombinasyonlarını kullandılar. Hem palmitik asit hem de OA, karaciğer yağ dejenerasyonuna ve TG birikimine katkıda bulunur. İnsan vücudunda en bol bulunan doymuş yağ asidi olan palmitik asit, hepatositlerde lipid birikimine, hücre içi reaktif oksijen radikallerinin artmasına ve hücre ölümüne veya nekrozuna yol açan önemli lipotoksisite sergiler37. Tersine, OA daha belirgin hücre içi TG birikimine (Şekil 6) ve daha az hücresel modülasyonayol açar 38. Bu nedenle, araştırmacılar genellikle in vitro MASLD modelleri oluşturmak için OA kaynaklı HepG2 hücrelerini kullanırlar. Protokol adımı 2.2.2'de açıklandığı gibi, OA çözeltisini eklerken ısıtmak çok önemlidir. Bu çalışmada, ORO boyama ve lipid içerik analizi, HepG2 hücrelerinin lipid birikimine dayandırılmış, karmaşık mekanizmalara sahip in vitro MASLD modellerinin araştırılmasını etkin bir şekilde desteklemiş ve araştırma için gereken zaman ve maliyeti azaltmıştır.
ORO, bir damlacık şeklinde TG'ye kolayca bağlanır ve lipit konsantrasyonuna bağlı olarak renk yoğunluğu ile yağın göstergesi olan turuncu ila kırmızı lekelenme üretir. Bununla birlikte, ORO boyama çözeltisi kararsızdır ve çökelmeye eğilimlidir, bu da onu önceden hazırlık için uygun hale getirmez. Bu nedenle, ORO boyama çözeltisi, hazırlık ve inkübasyon sırasında ışığa maruz kalmayı önlemek için önlemler alınarak protokol adımı 3.2'den sonra hazırlandı (protokol adımları 3.2, 3.3). Protokol adımı 3.5'te, görüntülerin birden fazla zaman noktasında (saat 3, 6, 9 ve 12 yönlerinde) seçilmesi, sonuçların doğruluğunu artırmak için gerekli olan deneyin önemli bir modifikasyonunu temsil eder. Yüksek OA konsantrasyonları hücre sağkalımını etkilese de, bu nedenle bu yöntemin bir sınırlamasını temsil etse de, uygun bir OA konsantrasyonunun hücre canlılığını sağladığı gösterilmiştir.
Bu çalışma, MASLD modelini oluşturmak ve doğrulamak için bir CCK-8 kiti, ORO boyama, lipid içerik analizi ve toplam TG ölçümü kullanarak kapsamlı bir yaklaşım kullanmıştır. CCK-8 kiti, ilaçların hücre canlılığı üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanıldı ve çok önemli bir doğrulama adımı olarak hizmet etti. Gelecekte, bu model, MASLD patogenezini anlamayı ve potansiyel terapötik hedefleri belirlemeyi amaçlayan ilaç taraması ve mekanizma araştırmaları için umut vaat etmektedir. Doğrulamanın güvenilirliğinin kalitesini daha da sağlamak için, modelde yer alan hedef proteinlerin ekspresyon seviyeleri, western blotlama ve kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu analizleri kullanılarak analiz edilecektir.

Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı (MASLD), basit steatoz, alkolsüz steatohepatit (NASH), siroz ve hepatosellüler karsinom 1,2,3,4,5,6 dahil olmak üzere bir dizi durumu kapsar ve bunların tümü alkol tüketimi dışındaki faktörlere atfedilir 7. MASLD, metabolik karaciğer hasarının neden olduğu en yaygın karaciğer hastalığıdır ve küresel nüfusun yaklaşık dörtte birini etkiler 8,9,10,11,12. MASLD'nin patogenezi henüz tam olarak aydınlatılamamış olsa da, çeşitli teoriler MASLD'nin gelişimini açıklamaya çalışmaktadır. Hakim olan bir kavram, klasik "iki vuruş" teorisinden "çoklu vuruş" modeline doğru bir sapma olduğunu göstermektedir1. Bu hipotezlerin merkezinde, MASLD patogenezinde çok önemli olduğuna inanılan insülin direncinin rolü yer almaktadır13. Araştırmalar, hepatositlerdeki insülin direncinin, serbest yağ asitleri seviyelerinin artmasına yol açtığını ve ardından karaciğerde depolanan trigliseritleri oluşturduğunu göstermektedir14,15.
Araştırmacılar, MASLD'de yağ birikimini simüle etmek için hem in vivo hem de in vitro modelleri kullandılar; Yine de patomekanizmasını tam olarak kopyalamak zor olmaya devam ediyor. Bu sınırlamaya rağmen, bu modeller MASLD için potansiyel terapötik hedeflerin incelenmesinde etkili olmuştur. Bununla birlikte, kararlı bir MASLD modelinin geliştirilmesi çok önemlidir. Hayvan modelleri etkili olsa da, zaman alıcı ve pahalıdır, bu nedenle in vitro hücresel modellere artan ilgiyi vurgulamaktadır. Bu modeller, diyete bağlı MASLD'yi yeniden oluşturmak için genellikle oleik asit (OA) ve palmitik asit gibi tekli veya çoklu serbest yağ asitleri kullanır. Bunlar arasında, insan hepatoblastom hücre hattı HepG2, MASLD'nin in vitro hücresel modellerini oluşturmak için sıklıkla kullanılır.
OA indüksiyonu, HepG2 hücrelerini, köklü bir geçmişe sahip bir yöntem olan MASLD'ye benzer yağ birikimini çoğaltmak için uyarır. Bu çalışmanın amacı, 0.25 mM OA ile tedavi edilen HepG2 hücrelerinin canlılığını, Yağ Kırmızı O (ORO) boyamasını, lipid içeriğini ve trigliserid (TG) düzeyini göstermektir. Bu deneyin amacı, MAFLD modelleme çalışmalarının geliştirilmesi için daha fazla kanıt sağlamaktı.

<table><tbody><tr><td>0.22 ve mikro; m filtre</td><td>Millex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%0.25 Tripsin-EDTA (1x) Tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>0.45 & m filtre</td><td>Millex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL Crojenik Şişeler</td><td>CORNING</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>25 cm2 Hücre Kültürü Şişesi</td><td>CORNING</td><td>430639</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>CORNING</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu hücre kültürü plakası</td><td>CORNING</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>Kan Sayım Plakası</td><td>Şanghay Jing Jing Biyokimyasal Reaktif & Enstrüman A.Ş.</td><td></td><td></td>02270113</tr><tr><td>Hücre Sayma Kiti-8 tahlilleri</td><td>Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>CA1210-1000T</td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>NUAIRE</td><td>NU-5710E</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; DMSO Dimetil sülfoksit&nbsp;</td><td>Pekin Solarbio Bilim & Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>D8371</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta</td><td>Gibco</td><td>8122691</td><td></td></tr><tr><td>Enzim Etiketleme Ekipmanı</td><td>Tecan</td><td>Spark</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, Nitelikli</td><td>Gibco</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>HepG2 hücre hattı</td><td>Pekin Kuzey Çin Chuanglian Biyoteknoloji Araştırma Enstitüsü (BNCC)</td><td>221031</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Trigliseridi (TG) ELISA talimat</td><td>Nanjing Jiacheng Biyomühendislik Enstitüsü</td><td>20170301</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Kültürü için Ters Mikroskop</td><td>Leica</td><td>DMi1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Tianjin Zhiyuan Kimyasal Reaktif A.Ş.</td><td></td><td></td>2021030141</tr><tr><td>Yağı Kırmızı Leke Kiti, Kültürlenmiş Hücreler İçin</td><td>Pekin Solarbio Bilim ve Technology Co., Ltd.&nbsp;</td><td>G1262</td><td></td></tr><tr><td>Oleik asit&nbsp;</td><td>Sangon Biyoteknoloji (Şangay) Co., Ltd.</td><td></td><td></td>A502071</tr><tr><td>Penisilin Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>SPSS 24.0</td><td></td><td>İstatistik yazılımı</td><td></td></tr></tbody></table>

metabolik disfonksiyonla İlişkili steatotik karaciğer hastalığında yağ birikiminin İn vitro modellenmesi

In Vitro Modeling of Fat Deposition in Metabolic Dysfunction-Associated Steatotic Liver Disease

Metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığının (MASLD) prevalansı, ekonomik ve yaşam tarzı modellerindeki değişiklikler nedeniyle artmış ve önemli sağlık sorunlarına yol açmıştır. Önceki raporlar, MASLD için hayvan ve hücresel modellerin kurulmasını incelemiş ve aralarındaki farkları vurgulamıştır. Bu çalışmada, MASLD'de yağ birikimi indüklenerek hücresel bir model oluşturulmuştur. HepG2 hücreleri, MASLD'yi taklit etmek için çeşitli konsantrasyonlarda (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) doymamış yağ asidi oleik asit ile uyarıldı. Modelin etkinliği, hücre sayma kiti-8 testleri, Yağ Kırmızısı O boyaması ve lipid içerik analizi kullanılarak değerlendirildi. Bu çalışma, MASLD hücreleri için kullanımı basit bir hücresel model oluşturmayı amaçlamıştır. Hücre sayma kiti-8 testlerinden elde edilen sonuçlar, HepG2 hücrelerinin hayatta kalmasının, 1.875 mM'lik bir GI50 ile oleik asit konsantrasyonuna bağlı olduğunu gösterdi. 0.5 mM ve 1 mM gruplarındaki hücre canlılığı, kontrol grubundakilerden anlamlı derecede düşüktü (P < 0.05). Ayrıca, Yağ Kırmızısı O boyama ve lipit içerik analizi, HepG2 hücrelerinde değişen oleik asit konsantrasyonlarında (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) yağ birikimini inceledi. 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM gruplarının lipid içeriği kontrol grubundan anlamlı derecede yüksekti (P < 0.05). Ek olarak, OA gruplarındaki trigliserit düzeyleri kontrol grubundakilere göre anlamlı olarak yüksekti (P < 0.05).

Oleik asidin hücre canlılığı üzerindeki etkisi HepG2 hücreleri, değişen OA konsantrasyonlarına (0 mM, 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) maruz bırakıldı, bu da 0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM ve 1 mM'de hücre sağkalım oranlarında bir azalmaya neden oldu. 0 mM ile karşılaştırıldığında 0.5 mM (P &lt; 0.05) ve 1 mM (P &lt; 0.05) olarak istatistiksel anlamlılık gözlendi. CCK-8 kiti tarafından değerlendirildiği gibi, OA'nın hücre canlılığı üzerindeki etkisinin sonuçları Şekil 2'de gösterilmektedir. OA ile muamele edilen HepG2 hücreleri için GI50 değeri 1.875 mM olarak hesaplandı.
Hücre içi lipid damlacık oluşumunu gözlemlemek için Yağ Kırmızısı O boyama ORO boyama, lipid görselleştirme için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir16,17. Sonuç olarak, 24 saat boyunca OA ile inkübe edilen HepG2 hücrelerinde lipid damlacık oluşumu, ORO boyamasını takiben mikroskop altında gözlendi. Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterildiği gibi, OA ile tedavi edilen hücrelerdeki kırmızı lekelenmenin yoğunluğu, tedavi edilmeyen hücrelere göre daha yüksekti. OA tedavisinden sonra HepG2 hücrelerinin plazmasında kırmızı lipid damlacıkları mevcuttu ve artan OA konsantrasyonları ile lipid damlacıkları ve lipitlerin miktarları artıyordu.
Farklı oleik asit konsantrasyonlarının HepG2 hücre süpernatanında toplam trigliserit üzerindeki etkileri Şekil 6'da gösterildiği gibi deneysel bulgular, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, değişen konsantrasyonlarda OA (0.125 mM, 0.25 mM, 0.5 mM, 1 mM) ile HepG2 hücrelerinin tedavisinin, OA grubunda hücre süpernatantının TG içeriğinde önemli bir artışa yol açtığını ortaya koymuştur (P &lt; 0.05).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig01.jpg"> Şekil 1: Yağ Kırmızısı O boyama için akış şeması. Kısaltmalar: OA = oleik asit; OD = optik yoğunluk. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig02.jpg"> Şekil 2: Oleik asidin hücre canlılığı üzerindeki etkisi, bir hücre sayma kiti-8 testi kullanılarak değerlendirilmiştir. Her çubuk SD (n = 6) ± ortalamayı temsil eder. *P &lt; 0.05. Kısaltma: OA = oleik asit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig03.jpg"> Şekil 3: Birden fazla zaman noktasının (saat 3, 6, 9 ve 12 yönlerinde) Yağ Kırmızısı O boyama görüntüleri. Lipid damlacık oluşumu, 40x büyütmede hücre kültürü için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak tespit edildi. Ölçek çubuğu = 500 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig04.jpg"> Şekil 4: Oleik asidin hücrelerdeki lipid damlacıkları üzerindeki etkisi, Yağ Kırmızısı O boyaması ile değerlendirilmiştir. Lipid damlacık oluşumu, 40x büyütmede hücre kültürü için ters çevrilmiş bir mikroskop kullanılarak tespit edildi. Ölçek çubuğu = 250 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig05.jpg"> Şekil 5: Oleik asidin hücrelerdeki lipit içeriği üzerindeki etkisi, optik yoğunluk değeri ile değerlendirilir. Bağıl kat değişiklikleri, farklı gruplarda optik yoğunluk değerlerinde sunulur. Her sütun SD ± ortalamasını temsil eder (n = 16). *P &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66810/66810fig06.jpg"> Şekil 6: HepG2 hücre süpernatanında çeşitli oleik asit konsantrasyonlarının toplam trigliserit seviyeleri üzerindeki etkileri. Bağıl kat değişiklikleri, farklı gruplarda trigliserit seviyelerinin değerinde sunulur. Her sütun SD ± ortalamasını temsil eder (n = 3). *P &lt; 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66810/66810fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu makale, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığı için bir model olarak oleik asit kaynaklı HepG2 hücrelerinin kullanımını açıklamaktadır.

Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığında Yağ Birikiminin İn Vitro Modellenmesi

The prevalence of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) has surged due to changes in economic and lifestyle patterns, leading ...

in-vitro-modeling-fat-deposition-metabolic-dysfunction-associated

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

De novo lipogenez ve β-yağ asidi oksidasyon hepatosit kilit metabolik, yağlı karaciğer hastalığı da dahil olmak üzere birçok metabolik bozukluklar, içinde tedirgin olan yollar oluşturmaktadır. Burada fare primer hepatositlerin izolasyonu göstermek ve β-yağ asidi oksidasyon ve lipogenez ölçümü açıklar.

Fare İlköğretim Hepatositlerde Yağ Asidi Oksidasyon ve lipogenez Belirlenmesi

Burada, hepatik steatozun in vivo ve in vitro modellerini oluşturmak ve steatotik fenotipleri ve ilgili fizyolojik parametreleri analiz etmek için optimize edilmiş yöntemler açıklanmaktadır.

Optimize Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; ve<em&gt; İn Vitro</em&gt; Karaciğer Steatoz

Bu çalışmada, farklılaştırılmış HepaRG hücrelerinde yağ asidi tuz sodyum oleat ile karaciğer veziküler steatozis inducing için ayrıntılı bir protokol tarif ve tutarlı Anti-Stokes dahil lipid birikiminin tespiti ve ölçülmesi için yöntemler istihdam Raman saçılma (CARS) mikroskobu, sitofluorimetrik analiz, yağ kırmızı O boyama, ve qPCR.

Farklılaşmış HepaRG hücrelerinde veziküler steatozu indükleyen ve karakterize etme

Bu protokol, steatozu ve hepatositlerin lipitlere aşırı maruz kalmasıyla ortaya çıkardığı moleküler, biyokimyasal, hücresel değişiklikleri incelemek için bir araç olması amaçlanmıştır.

Deneysel Steatoz İn VitroModeli : Lipid Aşırı Yük Şartlandırılmış Ortamda Hepatosit Hücre Kültürü

Bu protokol, palmitik asit kaynaklı in vitro modelde platikodin D'nin alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı üzerindeki koruyucu etkilerini araştırmaktadır.

Palmitik Asit Kaynaklı In Vitro Modelde Platycodin D'nin Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığı Üzerindeki Koruyucu Etkilerinin İncelenmesi

Burada, karaciğer dokusunda lipid damlacık karakterizasyonu için optimize edilmiş bir BODIPY 493/503 floresan tabanlı protokol gösterilmektedir. Ortogonal projeksiyonların ve 3D rekonstrüksiyonların kullanılmasıyla, florofor mikro-veziküler ve makroveziküler steatoz arasında başarılı bir ayrım yapılmasına izin verir ve hepatik steatoz değerlendirmesi için klasik histolojik protokollere tamamlayıcı bir yaklaşımı temsil edebilir.

Hepatik Steatoz Değerlendirmesi için Floresan Boyalı Lipit Damlacıklarının 3D Rekonstrüksiyon ile Analizi

Metabolik disfonksiyon, hepatik gen ekspresyonu değişiklikleri ve ileri fibroz evre 3'e ilerleyen fibroz dahil olmak üzere insan MASLD'ye benzeyen karaciğer histopatolojik değişiklikleri ile metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığının (MASLD) fare modeli. Bu model MASLD patofizyolojisi çalışmalarında ve yeni tedavilerin klinik öncesi çalışmalarında kullanılabilir.

Fibrozisli Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığının Fare Modeli

Ex vivo explant modeli kullanılarak, yağsız farelerden alınan visseral beyaz yağ dokusunun rostral kısmının küçük parçaları 7–10 gün boyunca kültürlenir; bu da yüksek yağlı diyet sırasında meydana gelen yağ dokusu iltihabının indüksiyonu ve incelenmesini mümkün kılar.

Yüksek Yağlı Diyet Benzeri Yağ Dokusu İltihaplanması için Deneyimli Fare Modeli

Burada sıvı nitrojen dolu Dewar tanklardan numune alımı için düşük maliyetli, dayanıklı cryotolerant cihaz sunuyoruz. Inşaat ve cihaz modüler tasarım kolaylığı kriyojenik tanklarından numune alma işlemi güvenli ve kolay hale getirir.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Keşfedin, metabolik disfonksiyonla ilişkili steatotik karaciğer hastalığını in vitro modellemek için oleik asit ile tedavi edilmiş HepG2 hücrelerinin kullanımını. Yağ birikimi mekanizmalarını ve lipid içeriği değerlendirme yöntemlerini öğrenin.

Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığında Yağ Birikiminin İn Vitro Modellenmesi

Daha fazla video keşfet