Name: Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-25T13:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Öğrenin, Mycobacterium abscessus'a karşı çift raporlayıcı suş ve robotik otomasyon kullanarak yüksek verimli ilaç taraması protokolü geliştirmeyi. Bu yöntem, dirençli enfeksiyonlar için yeni tedavi adaylarının hızla belirlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Mycobacterium abscessus için Çift Raportör Kullanarak Yüksek Verimli Tarama Testi

<ol><li>Victoria, L., Gupta, A., Gomez, J. L., Robledo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+complex%3A+A+review+of+recent+developments+in+an+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus complex: A review of recent developments in an emerging pathogen.</a> Front Cell Infect Microbiol. 11, 659997(2021).</li>
<li>Luthra, S., Rominski, A., Sander, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antibiotic-target-modifying+and+antibiotic-modifying+enzymes+in+Mycobacterium+abscessus+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The role of antibiotic-target-modifying and antibiotic-modifying enzymes in Mycobacterium abscessus drug resistance.</a> Front Microbiol. 9, 2179(2018).</li>
<li>Nathavitharana, R. R., Strnad, L., Lederer, P. A., Shah, M., Hurtado, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+questions+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pulmonary+M.+abscessus+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Forum+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Top questions in the diagnosis and treatment of pulmonary M. abscessus disease.</a> Open Forum Infect Dis. 6 (7), ofz221(2019).</li>
<li>Cristancho-Rojas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology+of+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Infect%22%5BJournal%5D)">Epidemiology of Mycobacterium abscessus.</a> Clin Microbiol Infect. 30 (6), 712-717 (2024).</li>
<li>Hua, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+repositioning%3A+Progress+and+challenges+in+drug+discovery+for+various+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Drug repositioning: Progress and challenges in drug discovery for various diseases.</a> Eur J Med Chem. 234, 114239(2022).</li>
<li>Doan, T. L., Pollastri, M., Walters, M. A., Georg, G. I. The future of drug repositioning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDoan%2C+TL+%22Annual+reports+in+medicinal+chemistry%22">Annual reports in medicinal chemistry</a>. Macor, J. E. , Academic Press. 385-401 (2011).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+antibacterial+drug+screening+methods%3A+Current+prospects+for+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evolution of antibacterial drug screening methods: Current prospects for mycobacteria.</a> Microorganisms. 9 (12), 2562(2021).</li>
<li>Attene-Ramos, M. S., Austin, C. P., Xia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Encycl+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High throughput screening.</a> Encycl Toxicol. 3, 916-917 (2014).</li>
<li>Gupta, R., Netherton, M., Byrd, T. F., Rohde, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reporter-based+assays+for+high-throughput+drug+screening+against+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Reporter-based assays for high-throughput drug screening against Mycobacterium abscessus.</a> Front Microbiol. 8, 2204(2017).</li>
<li>Bento Clara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+double-reporter+strains+of+Mycobacterium+abscessus+for+drug+discovery%3A+A+study+in+mScarlet%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel double-reporter strains of Mycobacterium abscessus for drug discovery: A study in mScarlet.</a> Microbiol Spectr. , e0036224(2024).</li>
<li>Kolbe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+optimization+of+chromosomally-integrated+fluorescent+Mycobacterium+tuberculosis+reporter+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Development and optimization of chromosomally-integrated fluorescent Mycobacterium tuberculosis reporter constructs.</a> Front Microbiol. 11, 591866(2020).</li>
<li>Lopez-Roa, P., Esteban, J., Munoz-Egea, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Updated+review+on+the+mechanisms+of+pathogenicity+in+Mycobacterium+abscessus%2C+a+rapidly+growing+emerging+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Updated review on the mechanisms of pathogenicity in Mycobacterium abscessus, a rapidly growing emerging pathogen.</a> Microorganisms. 11 (1), 90(2022).</li>
<li>Bray, M. A., Carpenter, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBray%2C+MA+%22Advanced+assay+development+guidelines+for+image-based+high+content+screening+and+analysis+in+Assay+guidance+manual%22">Advanced assay development guidelines for image-based high content screening and analysis in Assay guidance manual</a>. Markossian, S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences, Bethesda (MD). (2004).</li>
<li>Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for dilution antimicrobial susceptibility tests for bacteria that grow aerobically; approved standard. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22CLSI+document+M07-A10%22">CLSI document M07-A10</a>. , 10th ed, Wayne, PA. (2015).</li>
<li>Silva, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactoferricin+peptides+increase+macrophages%27+capacity+to+kill+Mycobacterium+avium%5BTitle%5D)+AND+%22mSphere%22%5BJournal%5D)">Lactoferricin peptides increase macrophages' capacity to kill Mycobacterium avium.</a> mSphere. 2 (4), e00301-e00317 (2017).</li>
<li>Bento, C. M., Gomes, M. S., Silva, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+beyond+typical+treatments+for+atypical+mycobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Antibiotics+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Looking beyond typical treatments for atypical mycobacteria.</a> Antibiotics (Basel). 9 (1), 18(2020).</li>
<li>Spizek, J., Rezanka, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lincosamides%3A+Chemical+structure%2C+biosynthesis%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Lincosamides: Chemical structure, biosynthesis, mechanism of action, resistance, and applications.</a> Biochem Pharmacol. 133, 20-28 (2017).</li>
<li>Hurst-Hess, K. R., Rudra, P., Ghosh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+protection+as+a+mechanism+of+lincosamide+resistance+in+Mycobacterium+abscessus%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Ribosome protection as a mechanism of lincosamide resistance in Mycobacterium abscessus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 65 (11), e0118421(2021).</li>
<li>Kang, J. K., Kang, H. K., Hyun, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+effects+of+spiramycin+in+lps-activated+raw+264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory effects of spiramycin in lps-activated raw 264.7 macrophages.</a> Molecules. 27 (10), 3202(2022).</li>
<li>Zimmermann, P., Ziesenitz, V. C., Curtis, N., Ritz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunomodulatory+effects+of+macrolides-a+systematic+review+of+the+underlying+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunomodulatory effects of macrolides-a systematic review of the underlying mechanisms.</a> Front Immunol. 9, 302(2018).</li>
<li>Pradhan, S., Madke, B., Kabra, P., Singh, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-inflammatory+and+immunomodulatory+effects+of+antibiotics+and+their+use+in+dermatology%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Anti-inflammatory and immunomodulatory effects of antibiotics and their use in dermatology.</a> Indian J Dermatol. 61 (5), 469-481 (2016).</li>
<li>Volochnyuk, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+commercially+available+compounds+for+hts%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Evolution of commercially available compounds for hts.</a> Drug Discov Today. 24 (2), 390-402 (2019).</li>
<li>Sritharan, S., Sivalingam, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+review+on+time-tested+anticancer+drug+doxorubicin%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">A comprehensive review on time-tested anticancer drug doxorubicin.</a> Life Sci. 278, 119527(2021).</li>
<li>Arwanih, E. Y., Louisa, M., Rinaldi, I., Wanandi, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resistance+mechanism+of+acute+myeloid+leukemia+cells+against+daunorubicin+and+cytarabine%3A+A+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cureus%22%5BJournal%5D)">Resistance mechanism of acute myeloid leukemia cells against daunorubicin and cytarabine: A literature review.</a> Cureus. 14 (12), e33165(2022).</li>
<li>Khasraw, M., Bell, R., Dang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epirubicin%3A+Is+it+like+doxorubicin+in+breast+cancer%3F+A+clinical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Breast%22%5BJournal%5D)">Epirubicin: Is it like doxorubicin in breast cancer? A clinical review.</a> Breast. 21 (2), 142-149 (2012).</li>
<li>Schultz, C. W., Nevler, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrvinium+pamoate%3A+Past%2C+present%2C+and+future+as+an+anti-cancer+drug%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Pyrvinium pamoate: Past, present, and future as an anti-cancer drug.</a> Biomedicines. 10 (12), 3249(2022).</li>
<li>Bailly, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+thiopeptide+thiostrepton.+An+update+of+its+mode+of+action%2C+pharmacological+properties+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The bacterial thiopeptide thiostrepton. An update of its mode of action, pharmacological properties and applications.</a> Eur J Pharmacol. 914, 174661(2022).</li>
<li>Kwok, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton+selectively+targets+breast+cancer+cells+through+inhibition+of+forkhead+box+m1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton selectively targets breast cancer cells through inhibition of forkhead box m1 expression.</a> Mol Cancer Ther. 7 (7), 2022-2032 (2008).</li>
<li>Kim, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiostrepton%3A+A+novel+therapeutic+drug+candidate+for+Mycobacterium+abscessus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Thiostrepton: A novel therapeutic drug candidate for Mycobacterium abscessus infection.</a> Molecules. 24 (24), 4511(2019).</li>
<li>Perry, C. M., Scott, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cefdinir%3A+A+review+of+its+use+in+the+management+of+mild-to-moderate+bacterial+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Drugs%22%5BJournal%5D)">Cefdinir: A review of its use in the management of mild-to-moderate bacterial infections.</a> Drugs. 64 (13), 1433-1464 (2004).</li>
<li>Ramon-Garcia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repurposing+clinically+approved+cephalosporins+for+tuberculosis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Repurposing clinically approved cephalosporins for tuberculosis therapy.</a> Sci Rep. 6, 34293(2016).</li>
<li>Kumar, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycobacterium+abscessus+l%2Cd-transpeptidases+are+susceptible+to+inactivation+by+carbapenems+and+cephalosporins+but+not+penicillins%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Mycobacterium abscessus l,d-transpeptidases are susceptible to inactivation by carbapenems and cephalosporins but not penicillins.</a> Antimicrob Agents Chemother. 61 (10), e00866-e00917 (2017).</li>
<li>Alvirez-Freites, E. J., Carter, J. L., Cynamon, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+activities+of+gatifloxacin+against+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo activities of gatifloxacin against Mycobacterium tuberculosis.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1022-1025 (2002).</li>
<li>Braback, M., Riesbeck, K., Forsgren, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibilities+of+Mycobacterium+marinum+to+gatifloxacin%2C+gemifloxacin%2C+levofloxacin%2C+linezolid%2C+moxifloxacin%2C+telithromycin%2C+and+quinupristin-dalfopristin+%28synercid%29+compared+to+its+susceptibilities+to+reference+macrolides+and+quinolones%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Susceptibilities of Mycobacterium marinum to gatifloxacin, gemifloxacin, levofloxacin, linezolid, moxifloxacin, telithromycin, and quinupristin-dalfopristin (synercid) compared to its susceptibilities to reference macrolides and quinolones.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46 (4), 1114-1116 (2002).</li>
</ol>

Mycobacterium abscessus (Mab), özellikle kistik fibroz ve diğer akciğer rahatsızlıkları olan kişilerde akciğer enfeksiyonlarından sorumlu fırsatçı bir patojendir. Mab'ın neden olduğu enfeksiyonların, çoklu ilaca dirençli tüberküloz1 ile karşılaştırılabilir mükemmel içsel ilaç direnci nedeniyle tedavi edilmesi rezil bir şekilde zordur. Mevcut ilaçlar, yüksek derecede geçirimsiz mikobakteriyel hücre zarfı ve antibiyotikleri etkisiz hale getiren birkaç enzimi kodlayan bir genom nedeniyle büyük ölçüde etkisizdir2. Bu nedenle, tedavi aylar ila yıllar süren çeşitli ilaçların kombinasyonunu içerir. Bu zorlu çoklu ilaç rejimi, düşük hasta uyumu ile birleştiğinde ortalama 0 ila P arasında bir iyileşme oranı ile sonuçlanır3. Ayrıca, tüberküloz dışı mikobakterilerin neden olduğu akciğer enfeksiyonlarının prevalansı, Mab 1,4'ün neden olduğu enfeksiyonlar da dahil olmak üzere son birkaç on yılda artmıştır. Sonuç olarak, bilim topluluğu Mab enfeksiyonlarını tedavi etmek için yeni bileşikler geliştirmek için yarışıyor.
Bu amaçla izlenen stratejilerden biri, mevcut ilaçlar için yeni terapötik fırsatların belirlenmesi süreci olan ilacın yeniden kullanımıdır. Bu, yeni bir ilacın keşif ve geliştirme hattına eşlik eden en büyük zorluğun üstesinden geliyor - zaman5. Bu basit konsept, gelişimsel maliyetleri azaltmak ve bir ilacın tezgahtan yatak başına geçmesi için gereken zaman ölçeğini kısaltmak için çeşitli ilaçların halihazırda belirlenmiş farmakokinetik ve güvenlik profillerinden yararlanır6. Bu nedenle, yüzlerce ila binlerce bileşiği birleştiren kütüphaneler derlendi ve araştırmacıların, ilgilendikleri patojene karşı ilaçları yeniden kullanma olasılığını hızlı bir şekilde test etmelerine olanak sağladı.
MAB'a karşı ilaç geliştirme üzerine yapılan çalışmaların çoğu, bir bileşiğin mikobakterilere karşı in vitro aktivitesini değerlendiren altın standart, ancak geleneksel bir teste dayanmaktadır - koloni oluşturan birimler7. Doğruluğuna rağmen, bu prosedür son derece zaman alıcıdır ve birisi binlerce bileşik içeren kütüphaneleri test etmeyi hedeflediğinde hızla uygulanamaz hale gelir. Bu amaçla, yüksek verimli taramalar (HTS) ilaç geliştirmeye entegre edilmiştir - robotik ve sıvı işleme cihazlarından yararlanan ve binlerce bileşiğinparalel olarak hızlı bir şekilde taranmasına olanak tanıyan sağlam tahliller8. Bu tipik olarak, başlangıçta tek bir konsantrasyonun test edilmesiyle, 96, 384, 1536 veya 3456 kuyucuklu formatlarda mikrotitre plakaları kullanılarak, isabetleri tanımlamak ve klinik olarak kullanılmak üzere boru hattında daha da optimize etmek için bir başlangıç noktası görevi görür.
Raportör bazlı tahliller, diğer boya ve absorbans bazlı tahlillere kıyasla basitlikleri ve hassasiyetleri nedeniyle HTS'nin sağlamlığı için önemli bir avantaj sağlamaktadır 7,9. Bununla birlikte, bildiğimiz kadarıyla, yalnızca birkaç çalışma Mab9'a karşı yüksek verimli bir taramayı optimize etmiştir.
Son zamanlarda, laboratuvarımız aynı anda lüminesans ve floresan10 yayabilen çift raportör suşları geliştirmiştir. Mab operon_mScarlet bu türlerden biridir. Bir bakteriyel lusiferaz (luxAB genlerinin ekspresyonu ile) ve uzun zincirli bir aldehit substratı (luxCDE genlerinin ekspresyonu ile) içeren LuxABCDE operonunun ekspresyonu nedeniyle otomatik ışıldayandır. Öte yandan, floresan okuması, daha tipik olarak kullanılan eGFP ve mCherry proteinlerinden daha iyi performans gösteren ve daha güçlü bir sinyal11 sağlayan, yakın zamanda geliştirilen bir kırmızı floresan proteini olan mScarlet'in ekspresyonu yoluyla elde edilir. Bu suşun kullanılması, reaktifler eklemeden veya ek adımlar gerçekleştirmeden bir mikroplaka okuyucusunda ışıldayan sinyali ölçerek sıvı kültürdeki bakteri canlılığını değerlendirmemizi sağlar. Tespit açısından, içsel floresan, boya veya antikor kullanmadan canlı veya sabit hücrelerde mikroskop görselleştirmesine izin verir. Her iki okumada da tek bir suşa sahip olmak, araştırmacılara HTS tahlillerinde kullanırken önemli bir avantaj sağlar - tahlilin doğasına bağlı olarak suşları değiştirmeye gerek olmadığından, farklı okumalara sahip tahliller arasındaki azaltılmış değişkenlik.
Bu nedenle, bu çalışma, kurum içi tasarlanmış bir çift raportör suşu kullanarak Mab'a karşı yüksek verimli bir test geliştirdi (Şekil 1). Bu, ticari bir kütüphane kullanılarak yeniden kullanılması amaçlanan in vitro aktivite 1280 ilacının hızlı bir şekilde değerlendirilmesine izin verdi (bkz. İlk olarak, aktiviteler lüminesans kullanılarak et suyu kültürü testinde değerlendirildi ve ikinci olarak, floresan sinyalinden yararlanan Mab ile enfekte makrofajlar kullanılarak, in vivo12'de görülen enfeksiyon sürecini daha iyi taklit ederek değerlendirildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig01v2.jpg"> Şekil 1: Oluşturulan protokolün grafiksel özeti. Bu taramadaki kilit oyuncu, tüm deneyler boyunca kullanılan, evde geliştirilen çift raportör mikobakteriyel suştur. İlk olarak, bir reaktif dağıtıcı ve planktonik bakteriler kullanılarak, bileşiklerin tek bir konsantrasyonda test edilmesiyle bir ilk tarama gerçekleştirilir. Tanımlanan isabetler, üç farklı konsantrasyonun test edildiği doğrulama testine devam eder. Her iki deney de ışıldayan okuma kullanılarak yapılır. Doğrulanmış isabetler, üç farklı konsantrasyonun da test edildiği enfeksiyon testine devam eder ve kemik iliği türevli makrofajlar MOI 1'de enfekte olur. Yüksek içerikli bir görüntüleme sistemi, bakteriyel floresan sinyalini alır ve Mycoload formülü aracılığıyla hücre içi yükü değerlendirmek için analiz yazılımı kullanılır. Tahlil karmaşıklığı arttıkça bileşiklerin sayısı azalır. BioRender.com ile oluşturuldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>% 10 Nötr tamponlu formalin</td><td>Bio Optica</td><td>05-01005Q</td><td>fiksasyon çözeltisi</td></tr><tr><td>384 kuyulu siyah yuvarlak tabanlı polipropilen işlem görmemiş mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3658</td><td>Beyaz mikroplakalar kullanılabilir; polistiren kullanılabilir</td></tr><tr><td>50 TS Yıkayıcı</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Breathe-Easy sızdırmazlık membranı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059-1PAK</td><td></td></tr><tr><td>hücresi:: explorer</td><td>Revvity</td><td></td><td>ekipman taşıma robotu</td></tr><tr><td>Klaritromisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3487-100MG</td><td>DMSO'da istenen konsantrasyona çözülür</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D/4121/PB15</td><td>Sıvı büyüme ortamında istenen konsantrasyona seyreltin</td></tr><tr><td>Harmony 5.1</td><td>Devir</td><td></td><td>analiz yazılımı</td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 İnkübatör, 165 L</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>hücre inkübatörü</td></tr><tr><td>JANUS, 4 Uç Kollu ve MDT Kollu</td><td>Revvity</td><td></td><td>sıvı işleyici</td></tr><tr><td>KB 8182</td><td>Çalkalama özellikli Termaks</td><td></td><td>inkübatörü</td></tr><tr><td>Libra S4+</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop&nbsp; Kombi Reaktif Dispenseri</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opera Phoenix Plus</td><td>Revvity</td><td></td><td>görüntüleme sistemi</td></tr><tr><td>PhenoPlate</td><td>Revvity</td><td>6055302</td><td>Yüksek içerikli mikroskoplar için gereklidir</td></tr><tr><td>Fosfat Tampon Salin (PBS) 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td>yıkama solüsyonu</td></tr><tr><td>Prestwick Kimyasal kütüphaneleri&nbsp;</td><td></td><td></td><td>İlacın yeniden kullanılması için tasarlanmış ticari kimyasal kütüphane</td></tr><tr><td>Çalkalama inkübatörü 3031</td><td>GFL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VICTOR Nivo</td><td>Revvity</td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Hücre kültürü ortamı: < / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>gerektiğinde, takviyenin% 10'unu</td></tr><tr><td>ekleyin DMEM</td><td>Gibco</td><td>10938-025</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Biowest</td><td>S1810</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon Çözeltisi (1 M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>LCCM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Makrofaj koloni uyarıcı faktörünü (M-CSF) serbest bırakan L929 hücre hattından şartlandırılmış ortam; hücre kültürü ortamı takviyesi</td></tr><tr><td>L-glutamin (200 mM)</td><td>Thermo Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat 100 mM (100X)</td><td>Gibco</td><td>11360-039</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Enfeksiyon yıkama solüsyonu< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>apirojenik su</td><td></td><td></td><td>Birden fazla tedarikçi mevcuttur</td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi 10x</td><td>Gibco</td><td>14060-040</td><td>Apirojenik su ile 1</td></tr> <tr><td>< seyreltin güçlü >geçirgen Çözelti< / güçlü ></td><td></td><td></td> <td>PBS ile %0.1 Triton X100</td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td> NA <td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Mevcut diğer tedarikçiler</td></tr><tr><td><güçlü>Boyama solüsyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td>DAPI (500 ng/mL) ve HCS Uzak Kırmızı (10 ng/mL) ile PBS</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>;<td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>H32721</td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Birden fazla tedarikçi mevcut</td></tr><tr><td><güçlü>Sıvı büyüme ortamı</güçlü></td><td></td><td></td><td>Gerektiğinde, %10 takviye ekleyin</td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9 Et Suyu</td><td>BD Difco</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4780</td><td>%0.05 nihai konsantrasyon. Mevcut diğer tedarikçiler</td></tr><tr><td>< güçlü > Sıvı büyüme ortamı takviyesi: < / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9702-100</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz susuz</td><td>Fisher Scientific</td><td>G / 0450/60</td><td></td></tr></tbody></table>

mikobakterilere karşı yüksek verimli İlaç taraması için test geliştirme

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Z' faktörü değerlendirmesi Şekil 2, Z' faktörünü hesaplamak için gerçekleştirilen iki deneyden birinin verilerini göstermektedir. Pozitif kontrol 4 μg/mL'de klaritromisin idi. Her iki deney de 0.64 ve 0.62'lik Z' faktörlerini verdi, bu da bu test için kullanılan koşulların ve okumanın takip eden tarama testine uygulanabileceği anlamına gelir (Z' &gt; 0.5). Bununla birlikte, her deneyin performansını kontrol etmek için kalan tüm deneyler (enfeksiyon testi) için Z' faktörü hesaplandı.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig02large.jpg" target="_blank"></a> <img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig03large.jpg" target="_blank"></a> <img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig04large.jpg" target="_blank"></a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig05.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig05large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66860/66860fig06.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/66860fig06large.jpg" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%203.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%204.zip" target="_blank"></a><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66860/Supplementary%20Figure%205.zip" target="_blank"></a>

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

assay-development-for-high-throughput-drug-screening-against

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video, ilaçların Mycobacterium tuberculosis (Mtb) enfeksiyonuna karşı etkinliğini değerlendirmek için bir testi göstermektedir. İn vivo enfeksiyonu taklit eden Mtb/makrofaj agregatları içeren bir in vitro enfeksiyon modeli oluşturulur. Uygun antibiyotikler eklendikten sonra, artan ilaç konsantrasyonları ile bakterilerin hayatta kalmasını izlemek için etkinlikleri resuzarin testi ile test edilir.

Mycobacterium tuberculosis Enfeksiyon Modeline Karşı İlaç Etkinliğini Değerlendirmek İçin Bir Test

Burada, küçük müdahale eden sentetik RNA (siRNA), kimyasal bileşik ve Mycobacterium tuberculosis mutant kütüphanelerinin Yüksek verimli / Yüksek içerikli ekranları için geçerli olan fenotipik bir test açıklıyoruz. Bu yöntem, otomatik konfokal mikroskopi kullanılarak floresan etiketli konak hücre içinde floresan etiketli Mycobacterium tuberculosis'in tespitine dayanır.

Yüksek Verimli/Yüksek İçerikli Taramaya Uyarlanmış Hücre İçi Mikobakterilerin Nicelleştirilmesi için Mikroskobik Fenotipik Bir Tahlil

Bu hücre içi, Mycobacterium tuberculosis karşısında roman bileşiklerin bulunması hedefleme için ve in suyu memeli konakçı hücreye karşı bakteri hem de sitotoksisite büyüyen modüler yüksek verimli bir tarama sistemini geliştirdik.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Yeni nesil anti-tüberküloz ilaçlar için erken ilaç geliştirme sürecini iyileştirecek yeni modeller ve testler oldukça arzu edilmektedir. Burada, Mycobacterium tuberculosis'e karşı ilaç etkinliğini değerlendirmek için yüksek verimli tarama için kolayca uyarlanabilen hızlı, ucuz ve BSL-2 uyumlu bir testi açıklıyoruz.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Bu yöntem, yüksek hassasiyet enfekte olmuş fareler bronkoalveoler lavaj (BAL) sıvısında H1N1 tespiti için Kızılötesi boya temelli görüntüleme sisteminin kullanımı açıklanmaktadır. Bu metodoloji, bir 96 veya plaka 384-iyi, test malzemesi &lt;10 ul hacmi gerektirir ve birden fazla patojenlerin eşzamanlı tarama için bir potansiyele sahiptir.

Gribi için yüksek verimlilik Tespit Yöntemi

Bu tümör hedef hücreleri ile inkübe zaman T hücrelerinin sitotoksisiteye ölçmek için bir tek hücreli yüksek verim tahlil açıklanmaktadır. Bu yöntem, mekansal olarak tanımlanan oranlarda T hücreler ve hedef hücrelerin sınırlandırmak için alt nanolitre kuyular (~ 100.000 kuyu / dizi) ve bir yoğun, elastomerik dizisi kullanır ve efektör-hedef konjugasyon ve daha sonra apoptoz izlemek için flüoresan mikroskop ile birleştirilmiştir.

T Hücreleri İçin Kantitatif Yüksek throughput Tek hücreli Sitotoksisite Testi

Sitopatik etki (CPE)-bazlı analiz, doz-yanıt tahlil ve Time-of-adisyonu (TOA) deneyi de dahil olmak üzere üç deneyleri yanı sıra, gelişmiş optimize edilmiş, doğrulanmış ve Bluetongue virüsüne karşı yeni antiviraller (BTV) tanımlamak için kullanılmıştır yeni tespit antiviraller için olası Mekanizması-of-Eylem (MoA) belirlemek gibi.

Bluetongue Virüs karşı Roman Antiviraller belirlenmesi için Tahliller

Virüs çoğaltma ölçmek için in vitro deneylerinde önemli ölçüde lusiferaz veya biyolüminesans edebilen diğer enzimleri ifade eden rekombinant RNA virüslerinin geliştirilmesi yolu ile iyileştirilmiştir. Burada ayrıntılı kızamık ve kimyasal kütüphanelerden geniş spektrumlu antiviral izole etmek Chikungunya virüsler, rekombinant suşlar birleştiren bir yüksek verimli tarama hattını.

RNA Virüslerinin geniş spektrumlu Kimyasal Önleyicileri için yüksek verimli tarama

Burada tarif ve hücresel sitotoksisitesi bileşiklerin hızlı ve doğru tarama için izin tek tur enfekte edebilirlik analizleri, kendi hücresel sitotoksisiteye (CC 50) tespit etmek ve WT ve ilaç dirençli HIV-1 karşı IC50 değerleri.

HIV ters transkriptaz ve integraz inhibitörleri hızlı taranması

Bu protokol, tip I ve III IFN ekspresyon imzalarının analizi için yüksek verimli bir qRT-PCR testini tanımlar. Tahlil, bu genlerin oldukça benzer transkriptleri arasındaki tek baz çifti farklılıklarını ayırt eder. Toplu montaj ve robotik pipetleme sayesinde tahliller tutarlı ve tekrarlanabilirdir.

Yüksek verim Kantitatif Gerçek zamanlı RT-PCR Testi Türleri I ve III İnterferon Alttipleriyle İfadesi Profilleri belirlenmesi için

Öğrenin, Mycobacterium abscessus'a karşı çift raporlayıcı suş ve robotik otomasyon kullanarak yüksek verimli ilaç taraması protokolü geliştirmeyi. Bu yöntem, dirençli enfeksiyonlar için yeni tedavi adaylarının hızla belirlenmesini sağlar.

Mikobakterilere Karşı Yüksek Verimli İlaç Taraması için Test Geliştirme

Daha fazla video keşfet