Name: Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Öğrenin, histoflow sitometri kullanarak çok parametreli immünofloresan mikroskopi görüntülerini analiz etmeyi. Bu yöntem, sinirbilim ve immünolojide tek hücre analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Görüntüleme altyapısı ve uzmanlığı için Hotchkiss Beyin Enstitüsü Gelişmiş Mikroskopi Platformu'na teşekkür ederiz. RWJ, Calgary Üniversitesi Göz Lisesi programından doktora sonrası burs fonu ve Kanada Multipl Skleroz Derneği ve Roche Kanada sınırsız eğitim bursu tarafından desteklendi. VWY, Kanada Araştırma Koltuğu Tier 1 programından maaş desteği aldı. Bu çalışma, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüleri Hibe 1049959, Kanada Multipl Skleroz Derneği Hibe 3236 ve Kongre Tarafından Yönetilen Multipl Skleroz Araştırma Programı ABD Savunma Bakanlığı'nın işletme fonları ile desteklenmiştir. Şekil 1 BioRender.com ile oluşturulmuştur. Bu yayında uyarlanan rakamlar ilk olarak The Journal of Immunology'de yayınlandı. Rajiv W. Jain, David A. Elliott ve V. Wee Yong. 2023. Histoflow Sitometri Kullanılarak Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Tek Hücre Analizi. J. İmmünol. 210: 2038-2049. Telif Hakkı © [2023]. Amerikan İmmünologlar Derneği, Inc.

Yüksek Parametreli Doku Görüntüleme için İmmünofloresan Mikroskopi ve Analizi

<ol><li>Bar-Or, A., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+immunology+of+relapsing+multiple+sclerosis%3A+interactions%2C+checks%2C+and+balances%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cellular immunology of relapsing multiple sclerosis: interactions, checks, and balances.</a> Lancet Neurol. 20 (6), 470-483 (2021).</li>
<li>Borst, K., Dumas, A. A., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+Immune+and+non-immune+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglia: Immune and non-immune functions.</a> Immunity. 54 (10), 2194-2208 (2021).</li>
<li>Han, R. T., Kim, R. D., Molofsky, A. V., Liddelow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte-immune+cell+interactions+in+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Astrocyte-immune cell interactions in physiology and pathology.</a> Immunity. 54 (2), 211-224 (2021).</li>
<li>Absinta, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lymphocyte-microglia-astrocyte+axis+in+chronic+active+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A lymphocyte-microglia-astrocyte axis in chronic active multiple sclerosis.</a> Nature. 597 (7878), 709-714 (2021).</li>
<li>Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+and+spatial+transcriptomics%3A+Deciphering+brain+complexity+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Single-cell and spatial transcriptomics: Deciphering brain complexity in health and disease.</a> Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).</li>
<li>Schirmer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+vulnerability+and+multilineage+diversity+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal vulnerability and multilineage diversity in multiple sclerosis.</a> Nature. 573 (7772), 75-82 (2019).</li>
<li>Jain, R. W., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+in+central+nervous+system+disease%3A+Diversity%2C+locations+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">B cells in central nervous system disease: Diversity, locations and pathophysiology.</a> Nat Rev Immunol. 22 (8), 513-524 (2022).</li>
<li>Lassmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis pathology.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 8 (3), (2018).</li>
<li>Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+multiple+sclerosis%3A+Protectors+turn+destroyers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia in multiple sclerosis: Protectors turn destroyers.</a> Neuron. 110 (21), 3534-3548 (2022).</li>
<li>Sharma, S., Boyer, J., Teyton, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practitioner%27s+view+of+spectral+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A practitioner's view of spectral flow cytometry.</a> Nat Methods. 21 (5), 740-743 (2024).</li>
<li>Longo, S. K., Guo, M. G., Ji, A. L., Khavari, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+and+spatial+transcriptomics+to+elucidate+intercellular+tissue+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell and spatial transcriptomics to elucidate intercellular tissue dynamics.</a> Nat Rev Genet. 22 (10), 627-644 (2021).</li>
<li>Ramaglia, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+imaging+of+immune+cells+in+staged+multiple+sclerosis+lesions+by+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Multiplexed imaging of immune cells in staged multiple sclerosis lesions by mass cytometry.</a> Elife. 8, e48051(2019).</li>
<li>Bolognesi, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+staining+by+sequential+immunostaining+and+antibody+removal+on+routine+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Multiplex staining by sequential immunostaining and antibody removal on routine tissue sections.</a> J Histochem Cytochem. 65 (8), 431-444 (2017).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+An+iterative+immunolabeling+and+chemical+bleaching+method+for+high-content+imaging+of+diverse+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">IBEX: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues.</a> Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).</li>
<li>Radtke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IBEX%3A+A+versatile+multiplex+optical+imaging+approach+for+deep+phenotyping+and+spatial+analysis+of+cells+in+complex+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33455-33465 (2020).</li>
<li>Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histo-cytometry%3A+A+method+for+highly+multiplex+quantitative+tissue+imaging+analysis+applied+to+dendritic+cell+subset+microanatomy+in+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Histo-cytometry: A method for highly multiplex quantitative tissue imaging analysis applied to dendritic cell subset microanatomy in lymph nodes.</a> Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).</li>
<li>Kotov, D. I., Pengo, T., Mitchell, J. S., Gastinger, M. J., Jenkins, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chrysalis%3A+A+new+method+for+high-throughput+histo-cytometry+analysis+of+images+and+movies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Chrysalis: A new method for high-throughput histo-cytometry analysis of images and movies.</a> J Immunol. 202 (1), 300-308 (2019).</li>
<li>Jain, R. W., Elliott, D. A., Yong, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+high-parameter+histology+images+using+histoflow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of high-parameter histology images using histoflow cytometry.</a> J Immunol. 210 (12), 2038-2049 (2023).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+Laboratory+Techniques.+Histological+Sample+Preparation+for+Light+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">General Laboratory Techniques. Histological Sample Preparation for Light Microscopy.</a> JoVE. , Cambridge, MA. (2023).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Berg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ilastik%3A+Interactive+machine+learning+for+%28bio%29image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">ilastik: Interactive machine learning for (bio)image analysis.</a> Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Ruhlandt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantum+yield+measurements+of+fluorescent+proteins+using+a+plasmonic+nanocavity%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Absolute quantum yield measurements of fluorescent proteins using a plasmonic nanocavity.</a> Commun Biol. 3 (1), 627(2020).</li>
<li>Combs, C. A., Shroff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%3A+A+concise+guide+to+current+imaging+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy: A concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. 79, 1-25 (2017).</li>
<li>Elliott, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy%3A+Principles+and+modern+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy: Principles and modern practices.</a> Curr Protoc Cytom. 92 (1), e68(2020).</li>
<li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Guidance+for+quantitative+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nat Protoc. 15 (5), 1585-1611 (2020).</li>
<li>McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+by+deconvolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy.</a> Methods. 19 (3), 373-385 (1999).</li>
<li>Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellpose%3A+A+generalist+algorithm+for+cellular+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Cellpose: A generalist algorithm for cellular segmentation.</a> Nat Methods. 18 (1), 100-106 (2021).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir finansal çıkar çatışması yoktur.

Burada, daha önce doğrulanmış bir teknik olan histoflow sitometrisinin kullanımı açıklanmaktadır18. Doku kesitlerini spektral olarak örtüşen boyalarla boyarken, kanallar arasındaki kanamanın spektral kompanzasyon kullanılarak giderilebileceği ve bunun sonucunda normalde geleneksel yöntemlerle mümkün olandan daha fazla sayıda floresan parametresinin net bir şekilde çözüldüğü gösterilmiştir. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin geleneksel yöntemler kullanılarak analiz edilmesi zor olduğundan, bu görüntülerden tek tek hücreleri segmentlere ayırmak için bir analiz hattı sağlanır. Floresan imzaları bu tek tek hücrelerden dışa aktararak, akış sitometrisinde yapılanlar gibi tek hücreli analizlerin benzer şekilde histoloji görüntülerine uygulanabileceği gösterilmiştir. Akış sitometrisi mekansal analizi içermezken, histoflow sitometrisinin, mekansal lokalizasyonlarını değerlendirmek için doku kesitlerine geri dönme stratejileri ile tanımlanan popülasyonları haritalayabildiği gösterilmiştir. Genel olarak, histoflow sitometrinin akım sitometrisi ve histolojinin güçlü yönlerini birleştirdiği gösterilmiştir.
Histoflow sitometri, uzamsal bilgiyi tutma avantajına sahip olsa da, geleneksel histolojinin sahip olduğu aynı sınırlamaların çoğuna da sahiptir. Akış sitometrisi, tüm bir dokudaki hücreleri ölçmek için harika olsa da, histoloji tipik olarak, dokuyu temsil etmek için alınan küçük bir doku kesiti örneğinin analiz edilmesiyle gerçekleştirilir. Histolojinin bir dokudaki hücre sayısını doğru bir şekilde ölçmesi için, dokudan alınan her doku diliminin görüntülenmesi ve her birindeki hücre sayısının ölçülmesi gerekir ki bu pratik olmayacaktır. Diğer bir konu ise, dokunun kesitlenmesi sırasında bazı hücrelerin ikiye bölünmesi ve bu hücreleri yeniden yapılandırmanın bir yolu olmamasıdır. Aslında, burada listelenen protokolün bir sınırlaması, dokunun kenarlarındaki hücreleri dışlamak için herhangi bir yöntem içermemesidir. Bu sınırlamalara rağmen, histoflow sitometrisinin akış sitometrisine göre bir avantajı, dokuları tek hücreli süspansiyonlara ayırmaya gerek olmamasıdır, bu da izole edilmiş veya yetersiz yakalanmış popülasyonlara önyargılar getirebilir22. Bu nedenle, histoflow sitometrisinin geleneksel akış sitometrisine göre çeşitli avantajları olsa da, tüm doku boyunca ölçüm elde etmek zor olmaya devam edecektir.
Burada, spektral olarak örtüşen sekiz floresan parametresinin ayrılabileceği gösterilmiştir; Bununla birlikte, diğerleri 13 floresan boyayı17 başarıyla ayırmıştır. Ayrılabilen boyaların sayısı, verilerin toplandığı mikroskobun özelliklerine bağlıdır. Floresan boyalar, optimal uyarma dalga boylarına ve en yaygın emisyon dalga boylarına göre farklılık gösterir. Floroforların optimal uyarma dalga boylarını daha hassas bir şekilde eşleştirmek için çok çeşitli uyarma dalga boyları kullanarak ve emisyon dedektörlerini en sık yayılan dalga boylarına tam olarak uyacak şekilde ayarlayarak bu özelliklerden yararlanan mikroskoplar, floresan boyaların ayrılmasını en üst düzeye çıkaracaktır. Spektral örtüşmeyi en aza indirmek, yüksek kaliteli veri üretmek için çok önemlidir, çünkü kanallar arasındaki sızıntıyı telafi etmek, birbiriyle etkileşime giren floroforların dinamik algılama aralığını potansiyel olarak etkileyebilir ve bu nedenle, emisyon ve uyarmaya dayalı ayırma, floroforların ayrılmasında kritik bir ilk adımdır. Mikroskobunuzun özelliklerine ve görüntülenmesi gereken floresan parametrelerinin sayısına bağlı olarak, aynı uyarma dalga boylarını paylaşan ancak emisyon dalga boylarında farklılık gösteren birden fazla floroforun aynı lazer çizgilerine yerleştirilmesi gerekebilir. Bu tipik olarak, konjuge boyaların daha uzun dalga boylarında yayıldığı ve böylece emisyon dalga boylarına göre ayırt edilebildiği konjuge floresan boyalarla kombinasyon halinde baz floresan boyaların kullanılmasıyla elde edilir. Genel olarak, boyalar, etkili bir şekilde ayrılma için uyarma veya emisyon frekansları ile ayırt edilmelidir.
Mükemmel tazminat elde etmek, tazminatın mekansal yönü de dahil olmak üzere çeşitli faktörler nedeniyle karmaşıktır. İlk olarak, bir floroforun bir foton yayıp yaymadığı, kısmen, her görüntüde toplanan fotonların yoğun lekelenme yerlerine doğru önyargılı olduğuşans 23'e dayanmaktadır. Bununla birlikte, daha az yoğun lekeli alanlar, şans eseri, üst üste binen kanallardan birinde görünen ancak ana kanalda görünmeyen bir foton yayabilir. Kompanzasyon voksel bazında uygulandığından, uzamsal kolokalizasyon eksikliği nedeniyle kompanzasyon sırasında spektral örtüşme kaldırılmayacaktır. Bu, kompanzasyonun yoğun lekelenme konumlarının azalmasına (boncukların kenarları) neden olduğu, ancak boncukların merkezinin değil, minimum lekelenmenin olduğu ve kanamalı kanallarla zayıf örtüşmenin olduğu Şekil 2'de görülebilir. Boncukların merkezindeki bu lekelenme, muhtemelen telafiyi etkileyebilecek başka bir sorundan kaynaklanmaktadır, bu da odak düzleminin dışında üretilen fotonların, hem ana kanalda hem de telafi edilmesi gereken kanalda yeniden üretilmesi muhtemel olmayan odak düzlemindeki voksellerde görünebilmesidir24. Sonuç olarak, bu 'gürültü', aşırı tazminat getirilmeden tazminat yoluyla etkili bir şekilde ortadan kaldırılmayacaktır. Bu sorunlar, bir çizgi ortalaması kullanılarak, tek bir vokselin floresan değerlerini birden çok kez ölçerek ve rastgele şans olaylarının etkisini sınırlamak için ortalamayı kullanarak kısmen ele alınabilir. Konfokal bir mikroskop kullanılıyorsa, odak dışı fotonların görüntüleredahil edilmesini önlemek için iğne deliği boyutu da küçültülebilir 25,26. Bu düzeltmeleri kullanmak, kapsamlı hale gelebilen ek görüntüleme elde etme sürelerinin pahasına gelir.
Bu teknik, konfokal bir mikroskoptan alınan görüntüler kullanılarak geliştirilmiş olsa da, diğer mikroskop türleriyle de çalışacaktır. Benzer yöntemler kullanan diğerleri, bu metodolojileri iki fotonlu mikroskoplardan17 alınan görüntülere büyük bir başarı ile uyguladılar. Bu teknik, geniş alan mikroskoplarından alınan görüntülere uygulanabilirken, bir fotonun odak düzleminden kaynaklanıp kaynaklanmadığını çözmeyi geliştiren konfokal mikroskoplarla ilişkili çeşitli avantajlar vardır. Fotonların konumunun doğru bir çözünürlüğü (yani, optik kesitleme) kompanzasyon kalitesini iyileştirdiğinden, kompanzasyon kalitesinin nispeten düşük olması beklenir. Bu, geniş alan görüntülerinin27 çözünürlüğünü iyileştirmek için odak dışı fotonları çıkarmak için evrişim giderme kullanılarak potansiyel olarak ele alınabilir. Dekonvolüsyonun bu protokolle uyumlu olup olmadığını belirleyecek önemli bir uyarı, her kanaldaki floresan değerlerinin analiz edilen tüm görüntülerde birbiriyle orantılı kalıp kalmadığıdır. Evrişimden sonraki floresan değerleri keyfi hale gelirse, bir görüntüde oluşturulan aynı telafi matrisinin diğer görüntülere başarılı bir şekilde uygulanması olası değildir. Genel olarak, bir mikroskobun bu iş akışını kullanıp kullanamayacağını belirleyen en önemli faktör, bu mikroskobun algılama aralığı esnek bir şekilde ayarlanabilen dedektörlere sahip olup olmadığıdır. Bu mevcutsa, aynı uyarma yoluyla uyarılan birden fazla florofor, farklı algılama pencereleri içinde emisyon spektrumlarının tespiti yoluyla çözülebilir.
Floresan parametrelerinin sayısı, aynı dokuyu IBEX 14,15 gibi birden çok kez seri olarak boyama teknikleriylebirleştirilirse daha da artırılabilir13. Seri boyama kullanılarak, etkili bir şekilde sınırsız sayıda parametre ölçülebilir; Ancak, bu çok zaman alıcı olabilir. Burada tartışılan kompanzasyon yöntemlerinin ve seri boyamanın bir kombinasyonunun kullanılması, her boyama turu için aynı anda daha fazla kanal görüntülenebildiğinden, bu görüntüleri almak için gereken süreyi önemli ölçüde azaltabilir. Burada açıklanan analiz hattı, istendiği kadar çok işaretleyici için ölçeklenecek ve seri olarak boyanmış doku bölümleriyle uyumlu olacaktır.
Bu analiz hattındaki kritik bir adım, histoloji görüntülerinden tek hücrelerin segmentasyonudur. Histoloji görüntülerinden hücreleri doğru bir şekilde segmentlere ayırmak için etkili stratejiler bulmak yaygın bir konudur28 ve sürekli olarak yeni yöntemler geliştirilmektedir. Bu yöntem, tek hücreleri yakından paketlenmiş hücrelerden etkili bir şekilde ayırabilirken, hücrelerin kesin sınırları genellikle kusurludur. Bu nedenle, kullanıcıların analizi yalnızca ilgilendikleri hücre popülasyonlarıyla sınırlamaları önerilir, çünkü ayrılması gereken hücreler ne kadar az olursa, hücre sınırları o kadar doğru olacaktır. Kullanıcılar ayrıca ilastik'te birden fazla popülasyon tanımlayarak hücrelerin daha iyi ayrılmasını sağlayabilir ve programın farklı hücre popülasyonlarını bölümlere ayırmasına olanak tanır. Bununla birlikte, bu yaklaşımla ilgili bir sorun, bu şekilde tanımlanan hücrelerin Yazılım 3'te aynı 'hücre' nesnesinde birleştirilememesi ve muhtemelen hücrelerin iki kez sayılmasına yol açabilmesidir. Bununla birlikte, bir deney için daha doğru hücre sınırları kritikse, bu yaklaşım kullanılabilir. Kullanıcıların, geliştirildikçe daha yeni segmentasyon algoritmalarını denemeleri ve daha da iyi sonuçlar için bunları bu boru hattına dahil etmeleri teşvik edilir.
Yeni bir histoflow sitometri paneli geliştirirken çeşitli sorunlar ortaya çıkabilir. İlk olarak, farklı floresan belirteçlerin kabaca benzer miktarlarda floresan üretmesi çok önemlidir. Bir florofor diğerinden çok daha parlaksa, bu florofor başka bir florofora sızarsa bu sorunlu olabilir, çünkü kanama o kanaldaki gerçek lekelenmeyi geçebilir. Bu, Alexa Fluor 546'nın PE-eFluor 610'a ciddi şekilde sızdığı Şekil 3'te görülmektedir. Kompanzasyon bu taşmayı yine de ortadan kaldırabilse de, odak dışı ışığın kaldırılmaması nedeniyle genellikle hala bir miktar floresan olacaktır ve bu da telafiyi eksik hale getirebilir. Ayrıca, mikroskoplarda kullanılan çoğu dedektör, akış sitometrelerindekiler gibi geniş dinamik aralıklara sahip değildir. Sonuç olarak, bir kanaldaki sızıntı arttıkça, o dedektördeki dinamik aralığın daha fazlası diğer floroforlardan gelen sinyallerle doygun hale gelecek ve ilgilenilen florofordan daha az olacaktır. Kompanzasyon, geniş bir sızıntı ile böyle bir kanaldan çıkarıldığında, gerçek sinyal çözülebilir; Bununla birlikte, bu işaretleyici için pozitif olan hücreler ile onun için negatif olan hücreler arasındaki fark daha küçük hale gelecektir ve ara durumları çözememe veya potansiyel olarak negatiflerden pozitifleri çözememe ile sonuçlanabilir. Bu nedenle kanallar arası çakışmalardan kaçınılmalıdır. İkincisi, işaretleyicilerin parlaklığı farklı dokular arasında değişebilir. Örneğin, lenf düğümleri üzerinde çalışan bir belirteç paneli, dalak veya merkezi sinir sistemi üzerinde kullanıldığında artık çalışmayabilir, çünkü bir belirteç çok parlak veya sönük hale gelebilir, bu da o kanalın diğer kanallara çok fazla kanamasına veya diğer kanallardan gelen kanama nedeniyle boğulmasına neden olabilir. Böyle bir durumda, floroforların markörler üzerindeki değişimine geçmek veya primer konjuge antikorların kullanımını sekonder antikorların kullanımına geçirmek gerekebilir. Son olarak, kanallar arasında aşırı örtüşme olduğunda işaretçilerin lokalizasyonundaki farklılıklardan yararlanmak değerli olabilir. İki kanal birbiriyle yoğun bir şekilde örtüşüyorsa, ancak biri nükleer bir işaretleyici ve diğeri bir hücre yüzeyi işaretleyicisiyse, spektral örtüşme birbirini minimum düzeyde etkileyecektir çünkü telafi aynı vokselleri etkilemeyecektir. Mümkünse, paneller, çakışan kanalların lokalizasyonlarında farklılık göstermesini veya işaretleyicilerin ayrı hücrelerde ifade edilmesini sağlayacak şekilde tasarlanmalıdır.
Genel olarak, histoflow sitometrinin histoloji görüntülerini tek hücre düzeyinde analiz etmek için çok yönlü bir teknik olduğu gösterilmiştir. Daha eski teknikler, doğrudan hücre-hücre teması halinde olmayan hücrelerin analizi ile sınırlı olabilirken, bu analiz boru hattı, temas halindeki hücreleri ayırabilir, bu da onu homeostazdaki dokulardaki hücrelerin incelenmesi için veya bağışıklık hücrelerinin hasar bölgelerinde kümelendiği iltihaplanma sırasında uygun hale getirir.

Bağışıklık sistemi hücreleri ve glial hücreler tarafından yönlendirilen iltihaplanma, her bir popülasyonun diğer 1,2,3'ün aktivitesini teşvik edebileceği CNS'nin kronik bozukluklarına katkıda bulunabilir. Bağışıklık sisteminin, CNS inflamasyonunu teşvik etmek için CNS'nin bu unsurları ile nasıl etkileşime girdiğini anlamak şu anda önemli bir ilgi konusudur ve tek hücreli RNA dizilimi gibi yüksek parametreli tekniklerle büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Tek hücreli RNA dizilimi sayesinde, çeşitli CNS bozukluklarındaglial hücreler ve bağışıklık sistemi arasında geniş bir iletişim olduğunu keşfettik 4,5,6. Bu etkileşimlerin bu bozuklukları nasıl etkilediğini anlamak, bu hastalıkların biyolojisini aydınlatmak için çok önemli olacaktır.
Tek hücreli dizileme analizleriyle ilgili bir sorun, bu tekniklerin tek hücreler veya çekirdekler elde etmek için dokunun bozulmasını gerektirmesi ve bunun da tam bir uzamsal bilgi kaybına neden olmasıdır. Bir hücrenin bir dokuda nerede bulunduğunu bilmek, hücrenin iltihabı yönlendirmedeki rolünü anlamak için kritik öneme sahiptir. Örneğin, B hücreleri gibi bağışıklık hücreleri, nöroinflamasyon sırasında CNS'de konsantre olabilir; bununla birlikte, nadiren CNS parankimine girerler ve bunun yerine CNS bariyerlerine7 konsantre olurlar. Lokalizasyonları göz önüne alındığında, bu hücrelerin CNS parankimindeki glial hücrelerle fiziksel olarak etkileşime girerek CNS inflamasyonuna katkıda bulunmaları olası değildir, bu da glial hücrelerle sahip olabilecekleri herhangi bir etkileşimin salgılanan faktörler yoluyla gerçekleşeceğini düşündürür. Ek olarak, CNS bozukluklarında ortaya çıkan patoloji genellikle 8,9 yapısına sahiptir, öyle ki bir hücrenin dokudaki lokalizasyonu, bozukluğa aktif olarak katkıda bulunup bulunmadığını veya bir seyirci olup olmadığını kritik olarak belirleyebilir. Bu nedenle, bir hücrenin patolojideki rolünü değerlendirmek için uzamsal yönelimin kullanılması esastır.
Dokudaki hücrelerin incelenmesi tipik olarak immünohistokimya veya immün floresan mikroskobu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tekniklerle ilgili bir sorun, tipik olarak aynı anda en fazla dört parametreyi görüntüleyebilmeleridir. Akış sitometrisi ve tek hücreli RNA dizileme analizlerinden bildiğimiz gibi, birçok hücre popülasyonunun tanımlanması için iki veya daha fazla parametreye ihtiyaç duyduğunu bildiğimiz için, bu teknikler için önemli bir sınırlamadır; Ayrıca, bir hücre tipi10'un belirli alt kümelerini ararken gereken parametrelerin sayısı tipik olarak artar. Bu nedenle, hücre alt kümelerinin bir doku içinde nasıl etkileşime girebileceğini incelemek için standart görüntüleme tekniklerini kullanmak pratik değildir.
Bu sorun, uzamsal RNA dizilimi11 ve görüntüleme kütle sitometrisi12 gibi uzamsal bilgileri koruyabilen daha yeni yüksek parametreli yöntemlerle kısmen aşılmıştır. Bu teknikler değerli olsa da, yaygın olarak bulunamama, üç boyutlu verileri iki boyuta indirgeme ve yürütme konusunda önemli uzmanlık gerektirme gibi çeşitli sorunları vardır. Dokuların bir antikor seti ile boyandığı ve ardından başka bir antikor seti ile boyanmadan önce önceki antikor setinin inaktive edildiği sıralı boyama olarak bilinen başka bir teknik, özel ekipman veya uzmanlığa ihtiyaç duymadan yüksek parametreli histoloji elde edebilir 13,14,15. Bununla birlikte, sıralı boyama son derece emek yoğun olabilir ve büyük miktarda mikroskopi süresi gerektirir, bu da kişisel mikroskobu olmayan laboratuvarlar için pratik olmayabilir. Bu nedenle, yaygın olarak bulunan mikroskoplarda bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını ve zamanında genişletilebilen tekniklere ihtiyaç vardır.
Yüksek parametreli veriler elde edildikten sonra, başka bir sorun ortaya çıkar: geleneksel görüntü analizi yöntemlerinin verileri başarılı bir şekilde analiz etmesi pek olası değildir. Manuel sayma veya eşikleme gibi teknikler, yalnızca analiz tek bir parametreden oluşuyorsa veya yalnızca çakışan sinyallerin sayıldığı birden fazla işaretleyici aynı lokalizasyona sahipse geçerlidir. Bu sınırlama, geleneksel analizi yüksek parametreli veri kümeleriyle çalışmak için yetersiz hale getirir. Bu veri kümelerinin başarılı analizi, histoloji görüntülerinden tek hücrelerin bölümlere ayrılması ve ardından hücre tiplerini tanımlamak için akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yürütülmesiyle elde edilmiştir16,17. Bununla birlikte, bu analizleri etkileyen bir diğer konu da, yalnızca ilgilenilen tüm hücrelerin fiziksel olarak birbirinden ayrıldığı veri kümeleri için çalışmalarıdır, çünkü bu teknikler fiziksel temas halinde olan hücreleri doğru bir şekilde ayırabilecek yöntemler kullanmaz. Bu nedenle, hücreler fiziksel temas halinde olsa bile histoloji kesitleri üzerinde tek hücreli analizler yapabilen daha yeni bir yöntem gereklidir.
Bu makalede, daha önce tanıtılanve yaygın olarak bulunan mikroskoplar kullanılarak aynı anda görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişleten histoflow sitometri adı verilen basit bir protokol açıklanmaktadır 18. Bu protokol, dokuları spektral olarak örtüşen boyalarla boyayarak ve daha sonra net tek lekeler elde etmek için üst üste binen kanallardan kanamayı gidermek için spektral kompanzasyon kullanarak çalışır. Yüksek parametreli histoloji görüntülerinin analizini kolaylaştırmak için, akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanarak hücreleri farklı popülasyonlara ayırmak amacıyla doku bölümlerinden tek hücreleri çıkaran ayrıntılı bir analiz hattı açıklanmaktadır. Bu protokol, hücrelerin yaygın olarak bulunduğu dokularda ve hücrelerin birbirine sıkı sıkıya sıkıştırıldığı dokularda çalışır ve bu tekniği hem homeostaz hem de nöroinflamasyonda CNS gibi dokuların incelenmesi için çok yönlü hale getirir. Bu nedenle, histoflow sitometri, uzamsal bilgileri korurken hücreleri tanımlamak için birden fazla hücre işaretleyicisi gerektiren karmaşık hücre tipleri arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı bir tekniktir.

<table><tbody><tr><td>% 100 Etanol</td><td>Sigma</td><td>676829-1L%</td><td></td></tr><tr><td>4 PFA</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>157-4</td><td></td></tr><tr><td>Anakonda</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.anaconda.com/download <tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Soğuk balık lekesi jelatin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Imaris.ipynb komut dosyasından çok kanallı verileri harmanlama</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td> https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Imaris.ipynb</tr> <tr><td>komut dosyasında Hücre seçimi için FlowJo çıkışını txt dosyasına dönüştürün</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://github.com/elliottcalgary/Histoflow-Cytometry-Analysis-Eşek</td></tr> <tr><td>sıçan önleyici Alexa Fluor 647</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>712-605-153</td><td>1:300 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Eşek anti-sıçan DyLight 405</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-475-153</td><td>1:200 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Eşek Serumu</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>F(ab')2-Keçi anti-Fare IgG PerCP-eFluor 710</td><td>Thermofisher</td><td>46-4010-82</td><td>1:25 konsantrasyon</td></tr><tr><td>FIJI</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td></tr> <tr><td>FlowJo</td><td>FlowJo LLC</td><td></td><td>Yazılımı 4</td></tr><tr><td>Floresan spektratörü</td><td></td><td></td><td>https://www.thermofisher.com/order/fluorescence-spectraviewer/#!/</td></tr> <tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>Taze dondurulmuş insan bademcik bölümleri</td><td>amsbio</td><td>HF-707</td><td></td></tr><tr><td>Cam lamel</td><td>VWR</td><td>48393 106</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgA Alexa Fluor 488</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>109-546-011</td><td>1:400 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgG Cy3</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>709-166-098</td><td>1:400 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Keçi anti-insan IgM Dylight 405</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>109-476-129</td><td>1:300 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan A546</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>A-11035</td><td>1:250 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan IgG PE-Alexa Fluor 610</td><td>Thermofisher</td><td>A-20981</td><td>1:250 konsantrasyon</td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Ilastik</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ilastik.org/ <tr><td>Ilastik FIJI eklentisi</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://www.ilastik.org/documentation/fiji_export/plugin<tr><td>Imaris Dosya Dönüştürücü</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Yazılımı 2</td></tr><tr><td>Hücre modüllü Imaris</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>Yazılımı 3</td></tr><tr><td>kimwipe</td><td>Kimtech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>LasX Yaşam Bilimleri yazılımı</td><td>Leica</td><td></td><td>Yazılımı 1</td></tr><tr><td>Fare anti-insan CD20 VWR</td><td></td><td>CA95024-322</td><td>1:40 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Fare anti-insan CD38 APC-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>564980</td><td>1:20 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Normal Keçi Serumu</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>005-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normal Fare Serumu</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>015-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normal Tavşan Serumu</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>011-000-001</td><td></td></tr><tr><td>Normal Sıçan Serumu</td><td>JacksonImmunoResearch</td><td>012-000-120</td><td></td></tr><tr><td>Nükleer Sarı</td><td>Abcam</td><td>ab138903</td><td>DMSO'da 2 mg / ml konsantrasyonda çözün ve 4 ° C'de saklayın; Karanlıkta C</td></tr><tr><td>PAP kalemi</td><td>Cedarlane</td><td>MU22</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-insan Ki67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>1:500 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Tavşan anti-fare Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:500 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-insan Blimp1</td><td>Thermofisher</td><td>14-5963-82</td><td>1:40 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare B220 Alexa Fluor 647</td><td>BioLegend</td><td>103226</td><td>1:250 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD138</td><td>Biolegend</td><td>142502</td><td>1:200 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD3 PE-eFluor 610</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61-0032-82</td><td>1:40 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD4 Alexa Fluor 488</td><td>BioLegend</td><td>100529</td><td>1:200 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare CD45 allofikosiyanin-R700</td><td>BD Biosciences</td><td>565478</td><td>1:50 konsantrasyon</td></tr><tr><td>Sıçan anti-fare IgD PerCP-eFluor 710</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>46-5993-82</td><td>1:50 konsantrasyon</td></tr><tr><td>SP8 Konfokal mikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Trueblack</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Ultracomp Emici</td><td>Thermofisher</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr></tbody></table>

histoflow sitometri ile yüksek parametreli histoloji görüntülerinin oluşturulması ve analiz edilmesi

Generating and Analyzing High-Parameter Histology Images with Histoflow Cytometry

Merkezi sinir sisteminden (CNS) türetilenler gibi doku kesitlerinde bağışıklık hücresi çeşitliliğini araştırmak için histolojinin kullanımı, tek bir seferde görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısı ile kritik bir şekilde sınırlıdır. Çoğu bağışıklık hücresi alt kümesi, protein belirteçlerinin karmaşık kombinasyonları kullanılarak akış sitometrisi kullanılarak tanımlanmıştır, bu genellikle kesin olarak tanımlamak için dört veya daha fazla parametre gerektirir, bu da çoğu geleneksel mikroskobun yeteneklerinin ötesindedir. Akış sitometrisi dokuları ayrıştırdığından ve uzamsal bilgiyi kaybettiğinden, karmaşık hücre tiplerinin rollerini sorgularken uzamsal bilgiyi koruyabilen tekniklere ihtiyaç vardır. Bu sorunlar burada, spektral olarak örtüşen floroforların sinyallerini toplayarak ve her bir ayrı floroforun sinyallerini ayırmak için spektral karıştırma kullanarak görüntülenebilen floresan parametrelerinin sayısını genişletmek için bir yöntem oluşturularak ele alınmaktadır. Bu görüntüler daha sonra yüksek parametreli histoloji görüntüleri almak ve bu görüntülerden tek hücreleri çıkarmak için bir analiz hattı kullanılarak işlenir, böylece her hücrenin benzersiz floresan özellikleri tek hücre düzeyinde analiz edilebilir. Akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri kullanılarak, hücreler daha sonra alt kümelere ayrılabilir ve yalnızca bolluklarını ölçmekle kalmayıp aynı zamanda doku ortamıyla nasıl etkileşime girdiklerini belirlemek için histoloji bölümlerine geri eşlenebilir. Genel olarak, histoloji bölümlerinde karmaşık immün popülasyonları incelemek için histoflow sitometri kullanmanın basitliği ve potansiyeli gösterilmiştir.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig01.jpg"> Şekil 1: Histoflow sitometri iş akışı. Doku kesitleri spektral olarak örtüşen boyalarla boyanır (adım 1). Görüntüler, floroforlar arasındaki spektral sızıntıyı en aza indirmek için ayarlanabilir bant geçiren filtrelerle eşleştirilmiş bireysel uyarma lazerleri arasında toplanır (adım 2). Kanallar arasındaki spektral kanama, tek renk lekeli doku kontrolleri kullanılarak oluşturulan bir kompanzasyon matrisine dayalı olarak düzeltilir (adım 3). Görüntülerdeki çekirdekler ve hücreler daha sonra ilastik (adım 4) kullanılarak tanımlanır ve Yazılım 3'te (adım 5) tek hücrelere bölünür. Akış sitometrisi analizi yapmak için tüm verileri Yazılım 3'ten Yazılım 4'e aktarmadan önce ek parametreler dahil edilir. Hücre kimlikleri daha sonra Yazılım 4'ten dışa aktarılır ve doku bölümlerindeki hücrelerin uzamsal lokalizasyonunu çözmek için orijinal dokudaki hücre kimliklerine geri eşlenir (adım 6). Para işaretleri, satın alınması gereken ticari yazılımları temsil eder ve bilgisayar işaretleri, özgür yazılımı temsil eder. Her adım için yaklaşık süre kum saatinin yanında belirtilmiştir. Ticari yazılım, Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Şekil 3'te, lenf nodu dokuları, bir eşek anti-sıçan Dylight 405 ikincil antikoru ile eşleştirilmiş bir sıçan anti-fare CD138 antikoru, Alexa Fluor 488'e konjuge bir sıçan anti-fare CD4 antikoru, PerCP-eF710'a konjuge bir sıçan anti-fare IgD antikoru, bir Eşek anti-tavşan Alexa Fluor 546 ikincil antikoru ile eşleştirilmiş bir tavşan anti-fare Iba1 antikoru ile boyandı, PE-eF610'a konjuge edilmiş bir sıçan anti-fare CD3ε antikoru, Alexa Fluor 647 ile konjuge edilmiş bir sıçan anti-fare B220 antikoru ve APC-R700'e konjuge edilmiş bir sıçan anti-fare CD45 antikoru. Dylight 405 ve Nuclear sarı boyalarını uyarmak için mor 405 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 408-438 nm ve 460-530 nm aralıklarında tespit edildi. Alexa Fluor 488 ve PerCP-eF710 boyalarını uyarmak için yeşil bir 488 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 495-545 nm ve 682-750 nm aralıklarında tespit edildi. Alexa Fluor 546 ve PE-eF610 boyalarını uyarmak için sarı-yeşil 552 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 557-600 nm ve 615-652 nm aralıklarında tespit edildi. Alexa Fluor 640 ve APC-R647 boyalarını uyarmak için kırmızı bir 700 nm lazer kullanıldı ve emisyonları sırasıyla 647-682 nm ve 700-750 nm aralıklarında tespit edildi.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig02.jpg"> Şekil 2: Düşük ve kaliteli tazminat örnekleri. Boncuklar, PE-eFluor 610'a konjuge edilmiş bir antikor ile boyandı ve PE-eFluor 610 (PE-eF610) ve Alexa Fluor 546 (A546) kanallarına karşılık gelen kanallarda görüntülendi. PE-eF610 florofordan sızıntıyı gidermek için A546 kanalında aynı görüntüye farklı derecelerde telafi uygulandı (eksik telafi için azalma, doğru telafi için ( azalma ve fazla telafi için ` azalma), bu da farklı derecelerde ayırma ile sonuçlandı. Telafi derecelerini daha iyi görselleştirmek için, taşma payı görüntülerinin aydınlatılmış bir versiyonu sağlanır. Sarı ok, PE-eF610 kanalında gerçek lekelenmenin olduğu bir alana karşılık gelen her görüntüdeki aynı alanı gösterir. Ölçek çubukları: 4 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig03.jpg"> Şekil 3: Lekeli doku kesitleri kullanılarak floresan telafisi. (A-C) Lenf nodu doku kesitleri, listelenen floroforlara konjuge edilmiş tek Abs ile boyandı. Telafi edilmemiş tek lekeli numuneler daha sonra tüm kanallarda (A, üst) görüntülendi ve tek renkli kontrollere (A, alt) kompanzasyon uygulandı. (B) (A)'daki kanallar arasındaki hava kaçağı nicelleştirildi (mevcut görüntünün ortalama floresan yoğunluğunun mevcut floroforun kanalının ortalama floresan yoğunluğuna bölünmesi) ve ısı haritalarında sunuldu. Beyaz kareler, 0 taşma payını aşan değerleri temsil eder. (C) Spektral örtüşme, tamamen boyanmış numunelerde Iba1-A546 ve CD3-PEeF610'un spektral ayrımı karşılaştırılarak telafi edilmemiş ve hücre bazlı kompanzasyon koşullarında değerlendirilir. Ölçek çubukları: 30 μm. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu protokolü izleyerek (Şekil 1'de özetlenmiştir), spektral olarak örtüşen floresan boyalar, Şekil 3A,B'de gösterildiği gibi etkili bir şekilde ayrılmalıdır. Boyaların tamamen ayrılması mümkün olmasa da, ayırma farklı hücre tiplerini açıkça ayırt etmek için yeterli olmalıdır (Şekil 3C). Başka bir kanalda hala spektral olarak örtüşen hücrelerin gölgeleri varsa, bu hala sızıntı olduğunu ve görüntülerin yeniden işlenmesi gerekebileceğini gösterebilir (Şekil 2). Ek olarak, telafi edilen alan arka plan boyamasıyla ilişkili floresan seviyelerinin altına düşerse ve taşmanın bir kez olduğu yerde siyah alanlar olarak görünürse aşırı telafi belirgin olacaktır (Şekil 2). Aşırı kompanzasyon, kompanzasyonun uygulandığı kanalda gerçek sinyalin kaybına yol açabilir ve bundan kaçınılmalıdır. Bununla birlikte, bu protokol doğru bir şekilde takip edilmişse, tazminatla ilgili herhangi bir sorun olmamalıdır ve bu nedenle araştırmacı, herhangi bir belirgin kanamanın yapay mı yoksa biyolojinin bir parçası mı olduğunu düşünmelidir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig04.jpg"> Şekil 4: İlastik tabanlı çekirdek ve hücre tespiti örneği. Nükleer sarı boyama (sol üst), çekirdekleri (sağ üst sarı renkte) ve çekirdek olmayanı (mavi renkte) tanımlamak için kullanıldı. Temsili CD45 boyama (sol altta gösterilmiştir) hücreleri (sağ altta sarı renkte) ve hücre olmayanı (mavi renkte) tanımlamak için kullanılır. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Boyalar doğru bir şekilde ayrıldıktan sonra, dokuyu tek tek hücrelere bölmek, tek hücreli analizlerin yürütülmesi için çok önemlidir. Burada açıklanan protokol, Şekil 6'da gösterilen lenf düğümlerinde gösterildiği gibi, hücreleri birbirine yakın bir şekilde sıkıştırıldıklarında bile ayırmak için kullanıcı tanımlı makine öğrenimini (Şekil 4) kullanır.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig05.jpg"> Şekil 5: Bir kapının doğru ayarlanıp ayarlanmadığının değerlendirilmesi. Bir lenf nodunda temsili CD138 boyaması (camgöbeği renkli) gösterilmiştir ve dokudaki CD138 + hücrelerini tanımlamak için üç ayrı kapı (soldaki nokta grafiği) yapılmıştır. CD138 + hücrelerinin aşırı muhafazakar bir tahmini mavi kapı olarak gösterilir ve mavi dokuya eşlenir. CD138 + hücrelerinin dengeli bir tahmini yeşil kapı olarak gösterilir ve dokuya yeşil renkte eşlenir. CD138 + hücrelerinin aşırı izin verilen bir tahmini, kırmızı kapı olarak gösterilir ve kırmızı dokuya eşlenir. Sarı daire, CD138+ hücrelerinin aşırı muhafazakar kapı tarafından tanımlanmadığı bir alanı tanımlar ve macenta daire, aşırı izin veren kapı tarafından CD138+ hücreleri içerdiği iddia edilen CD138+ hücrelerinin olmadığı bir alanı tanımlar. Ölçek çubukları: 30 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Akış sitometrisi analizinde ( Şekil 5'te gösterilmiştir) kapıların kesin konumlarını belirlerken, bu kapıların hücre bolluğunu fazla tahmin etmediğinden veya küçümsemediğinden emin olmak için dikkatli olunmalıdır. Bu, ilgilendiğiniz belirteçleri ifade eden hücrelerin analizde yakalanıp yakalanmadığını görmek için, Şekil 5'te olduğu gibi, hücrelerin dokuya geri eşlenmesiyle belirlenmelidir. Çok fazla hücre seçiliyorsa (örneğin, CD138'i ifade etmeyen hücreler CD138+ olarak seçiliyorsa), kapılar daha az izin verilecek şekilde kaydırılmalı ve çok az hücre seçiliyorsa, kapılar daha izin verilebilir hale getirilmelidir. Kapılar, seçicilik için optimize edilmelidir, böylece önce yukarı akış kapıları optimize edilir, ardından zincirdeki sonraki her kapı daha sonra optimize edilir. Sonuç olarak, bir geçit stratejisinin etkili optimizasyonu, ilgilenilen hücre alt kümelerini çözebilmelidir (Şekil 6 ve Şekil 7).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig06.jpg"> Şekil 6: Doku bölümlerindeki hücrelerin akış sitometrisine dayalı tanımlanması. (A) Lenf nodu kesitlerinde Yazılım 3'ten tek hücrelerden dışa aktarılan floresan değerleri, gösterilen geçit stratejisine dayalı olarak belirtilen hücre popülasyonlarını tanımlamak için Yazılım 4'te analiz edildi. (B) Yazılım 4'te tanımlanan popülasyonlar aynı doku bölümüne tekrar eşlendi ve her popülasyon için yüzeyler oluşturuldu. CD45 lekesi gösterilmemiştir. Ölçek çubuğu: 30 μm. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig07.jpg"> Şekil 7: Fare lenf düğümlerindeki bireysel lekelerin ve popülasyonların dağılımı. İmmün hücre belirteçleri için bireysel lekeler üst panellerde gösterilmiştir ve Şekil 6A'da tanımlanan ilişkili kapılı popülasyonları her bir lekenin altında gösterilmiştir. Ölçek çubuğu: 30 μm, sol üst panelde gösterilmiştir. Bu rakam Jain ve ark.18'den uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu teknik daha öncenöroinflamasyon sırasında omuriliklere bağışıklık hücresi infiltrasyonlarını karakterize etmek için kullanılmış ve histoflow sitometrisi ve akış sitometrisi kullanılarak eşdeğer oranlarda sızan immün hücrelerin bulunduğunu doğrulamıştır. Teknik ayrıca, fare dalaklarında ve beyinlerinde çalıştığını ve aynı akış sitometrisi deneylerinde (yayınlanmamış) yeniden üretilen tedavi koşulları arasındaki farkları belirleyebildiğini göstererek doğrulanmıştır. Bu teknik aynı zamanda CNS modellerinin stereotaktik enjeksiyonlarını alan farelerin omuriliklerini analiz etmek için de kullanılmıştır.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66889/66889fig08.jpg"> Şekil 8: Bir insan bademcik bölümünde 8 boyanın ayrılması. İnsan bademcik kesitleri B hücrelerini tanımlamak için CD20 ve plazma hücrelerini tanımlamak için IgM, IgA ve IgG ile boyandı. Plazma hücresi kimliklerini daha fazla doğrulamak için Blimp1 ve CD38 boyaları ve çoğalan hücreleri tanımlamak için Ki67 dahil edildi. Nükleer sarı leke birleşik görüntüde gösterilmemiştir. Ölçek çubuğu: 22 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/66889fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu teknik, insan dokusu kesitlerini analiz etmek için de uygulanabilir. İnsan dokularındaki lekelenmeye bir örnek olarak, insan bademcik bölümleri 8 işaretleyici ile boyandı: Dylight 405'e konjuge edilmiş bir keçi anti-insan IgM antikoru, Alexa Fluor 488'e konjuge edilmiş bir keçi anti-insan IgA antikoru, PerCP-eFluor 710'a konjuge edilmiş bir keçi anti-fare F(ab')2 fragmanı ile eşleştirilmiş bir fare anti-insan CD20 antikoru, Cy3'e konjuge edilmiş bir keçi anti-insan IgG, PE-Alexa Fluor 610'a konjuge edilmiş bir keçi anti-tavşan antikoru ile eşleştirilmiş bir tavşan anti-insan Ki67 antikoru, Alexa Fluor 647'ye konjuge edilmiş bir eşek anti-sıçan antikoru ile eşleştirilmiş bir sıçan anti-insan Blimp1 antikoru ve APC-R700'e konjuge edilmiş bir fare anti-insan CD38 antikoru. Kompanzasyon sonrası bademcik bölümünde bu belirteçlerin ayrılması görülebilir (Şekil 8). Bu, bu tekniğin farklı doku ve türlerde faydasını göstermektedir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Çözüm adı</td>
			<td colspan="2">Kompozisyon</td>
			<td colspan="4">Nasıl yapılır</td>
		</tr><tr><td>Engelleme tamponu</td>
			<td colspan="2">PBS'de At Serumu, %1 BSA ve %0.1 soğuk balık lekesi jelatini</td>
			<td colspan="4">45 mL PBS'ye 5 mL at serumu, 0.5 g BSA, 50 μL soğuk balık lekesi jelatini ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.</td>
		</tr><tr><td>Perma ve engelleme tamponu</td>
			<td colspan="2">PBS'de At Serumu, %1 BSA, %0.1 soğuk balık lekesi jelatini, %0.1 Triton X-100, %0.05 Tween-20</td>
			<td colspan="4">5 mL at serumu, 0.5 g BSA, 50 μL soğuk balık lekesi jelatini, 50 μL Triton X-100 ve 25 μL Tween-20 ila 45 mL PBS ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.</td>
		</tr><tr><td>Perma ve boyama tamponu</td>
			<td colspan="2">PBS'de %1 BSA, %0.1 soğuk balık lekesi jelatini, %0.5 Triton X-100</td>
			<td colspan="4">0,5 g BSA, 50 μL soğuk balık lekesi jelatini ve 250 μL Triton X-100 ila 50 mL PBS ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.</td>
		</tr><tr><td>Söndürme tamponu</td>
			<td colspan="2">%5 Trueblack, f,5 etanol, (,5 su</td>
			<td colspan="4">Trueblack solüsyonunu 70 °C'de 5 dakika önceden ısıtın. Daha sonra Trueblack tamponunu yapmak için 950 μL p etanole 50 μL Trueblack ekleyin. Bunu her seferinde taze yapın. Slayt başına ~ 500 μL'ye ihtiyacınız olacak, ancak belirli miktarlar dokularınızın doğasına bağlı olacaktır.</td>
		</tr><tr><td>Boyama tamponu</td>
			<td colspan="2">PBS'de %1 BSA ve %0.1 soğuk balık lekesi jelatini</td>
			<td colspan="4">50 mL PBS'ye 0,5 g BSA ve 50 μL soğuk balık lekesi jelatini ekleyin. Bu çözeltiyi 15 mL'lik tüplere koyun ve ihtiyaç duyulana kadar -20 °C'de saklayın.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Doku kesitlerini boyamak için gerekli çözeltilerin ve bileşimlerinin bir listesi.
Ek Kodlama Dosyası 1: Her kanaldan floresan değerlerini toplayan ve bir özet dosyası oluşturan bir Python betiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/Supplementary%20Coding%20File%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Kodlama Dosyası 2: Geçitli hücrelerin tüm kimlik numaralarının bir listesini bir metin dosyasında oluşturan bir Python betiği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66889/Supplementary%20Coding%20File%202v2.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Burada açıklanan, immünofloresan mikroskobu ile beş veya daha fazla floresan parametreyi görüntülemek için kullanılabilecek bir yöntemdir. Bu görüntülerden tek hücrelerin çıkarılması ve doku bölümlerindeki hücre alt kümelerini tanımlayabilen akış sitometrisi benzeri geçit stratejileri yoluyla tek hücre analizi yapmak için bir analiz boru hattı ana hatlarıyla belirtilmiştir.

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

The usage of histology to investigate immune cell diversity in tissue sections such as those derived from the central nervous system (CNS) is critically ...

Kapsayıcı hedefimiz, bağışıklık sistemi hücrelerinin ve merkezi sinir sistemi içindeki glial hücrelerin, multipl skleroz gibi nörolojik bozuklukların gelişimine ve ilerlemesine nasıl katkıda bulunduğunu incelemektir. İmmünofloresan mikroskopi, biyolojik disiplinler arasında standart ve yaygın olarak kullanılan bir tekniktir ve sinirbilim ve immünoloji araştırmaları için gereklidir. Araştırmacıları rahatsız eden ana konulardan biri, immünofloresan mikroskobunun tipik olarak geleneksel mikroskopların sınırlamaları nedeniyle tek bir seferde görüntülenebilen prob sayısında sınırlı olmasıdır.Bu protokolde, birçok mikroskobun tek seferde görüntüleyebileceği prob sayısını genişletmek için bir yöntem açıklıyoruz ve bilgi yoğun görüntüleri işlemek için bir analiz hattı sağlıyoruz. Bu protokolün avantajı, yaygın olarak bulunan birçok mikroskoba uyarlanabilmesi ve yürütülmesinin kolay olmasıdır, bu da multipleks histoloji analizini daha fazla sayıda laboratuvara uygun hale getirecektir.

generating-analyzing-high-parameter-histology-images-with-histoflow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kemik iliğindeki histolojik verileri kantitatif olarak analiz etmek için bir strateji sunulmuştur. Doku kesitlerindeki floresan etiketli hücrelerin konfokal mikroskobu, otomatik olarak analiz edilen 2 boyutlu görüntülerle sonuçlanır. Farklı hücre tiplerinin birlikte lokalizasyon analizleri, simüle edilmiş görüntülerden elde edilen verilerle karşılaştırılarak hücresel etkileşimler hakkında nicel bilgiler verilir.

Hematopoetik Hücre Otomatik Ölçümü - undekalsifiye Kemik histolojik Görüntüler stromal hücre etkileşimleri

Bu el yazmasında, mineralize dokuların donmuş kesitleri üzerinde birkaç tur floresan görüntülemeden çoklu yanıt ölçümlerinin hizalanmış kompozit görüntülerini üretmek için yüksek verimli, yarı otomatik bir kriyohistoloji platformu sunuyoruz.

Yüksek Verim, Mineralize Dokuların Çoklu Resim Cryohistology

Değişikliklere tepki olarak heterosellüler popülasyon dinamiklerini incelemek için yeni bir protokol geliştirdik. Bu el yazması heterosellüler popülasyonların çoklu hücresel fenotiplerinin aynı anda karakterize edilmesi için nicel veri kümeleri üreten görüntü tabanlı bir platformu açıklamaktadır.

Kantitatif Görüntüleme Teknikleri Kullanılarak Heterosellüler Popülasyonların Ayrımcılaştırılması ve Karakterizasyonu

ExCYT bir MATLAB tabanlı grafiksel kullanıcı arayüzü (kullanıcıların kendi akış sitometresi veri yolu ile yaygın olarak analiz olanak sağlayan GUI) dimensionality azaltma yolu ile t-SNE, otomatik ve el ile çeşitli dahil olmak üzere yüksek boyutlu verileri için analitik teknikler istihdam olduğunu kümeleme yöntemleri, heatmaps ve Roman yüksek boyutlu Akış grafiğini çizer.

ExCYT: yüksek boyutlu sitometresi veri analizi düzene için bir grafik kullanıcı arabirimi

Cytofast kümeleme çıktıanaliz etmek için kullanılan bir görselleştirme aracıdır. Sitofast iki kümeleme yöntemini karşılaştırmak için kullanılabilir: FlowSOM ve Cytosplore. Sitofast hızla kütle sitometri verilerinin nicel ve nitel bir genel bakış oluşturabilir ve farklı kümeleme algoritmaları arasındaki temel farkları vurgulayabilir.

Sitofast ve Upstream Kümeleme Yöntemleri FlowSOM ve Cytosplore kullanılarak Yüksek Boyutlu Sitometri Verilerinin Görselleştirilmesi ve Ölçülmesi

Çığır açan eğriler (BTC'ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC'ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Bu protokol, monositler, mikroglia, makrofajlar ve dendritik hücreler de dahil olmak üzere belirli oküler mononükleer fagositik popülasyonları tanımlamak için çok parametreli akış sitometrik analizi amacıyla tüm gözleri tek bir hücre süspansiyonuna sindirmek için bir yöntem sağlar.

Mononükleer Fagositlerin Çok Parametreli Akış Sitometrik Analizi için Tüm Fare Gözlerinin Sindirimi

Bu çalışma, mitokondriyal hacim, mitokondriyal membran potansiyeli, reaktif oksijen türleri seviyesi, mitokondriyal solunum zinciri bileşimi ve mitokondriyal DNA'daki değişiklikleri tespit etmek için iki floresan muhabir veya antikor ile akış sitometrisine ve çift boyamaya dayalı çoklu mitokondriyal fonksiyonel parametreleri ölçmek için yeni bir yaklaşım sunmaktadır.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerde Multipl Mitokondriyal Parametrelerin ve Nöral ve Glial Türevlerinin Akış Sitometrik Analizi

Burada sunulan, hücre bölünmelerinin sayısını, yüzey hücresi fenotipini ve hücresel akrabalığı aynı anda ölçmeye izin veren akış sitometrisine dayalı bir tekniktir. Bu özellikler, permütasyon tabanlı bir çerçeve kullanılarak istatistiksel olarak test edilebilir.

Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücreler için Akış Sitometrisi ile Akrabalık, Bölünme Sayısı ve Fenotipin Eşzamanlı Değerlendirilmesi

Burada, yüksek güçlü 375 nm ve 405 nm lazerlerin Hoechst 33342'yi etkili bir şekilde uyarabileceğini ve yan popülasyon (SP) hücre tespiti için 355 nm lazere uygun bir alternatif olarak hizmet edebileceğini ve böylece akış sitometrisi uygulamalarında mevcut lazer yelpazesini genişletebileceğini gösteriyoruz.

Hoechst Yan Popülasyon Hücrelerinin Akış Sitometrisi ile Etkili Tespiti

Öğrenin, histoflow sitometri kullanarak çok parametreli immünofloresan mikroskopi görüntülerini analiz etmeyi. Bu yöntem, sinirbilim ve immünolojide tek hücre analizi sağlar.

Histoflow Sitometri ile Yüksek Parametreli Histoloji Görüntülerinin Oluşturulması ve Analiz Edilmesi

Daha fazla video keşfet