Name: Mikroelektrotlar Kullanılarak Üç Boyutlu Gastrointestinal Organoidlerde Luminal pH Profili Oluşturma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-05T14:25:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Öğrenin, mikroelektrotlar kullanarak insan mide organoidlerinde lümen içi pH ölçümü yapmayı. Bu yöntem Helicobacter pylori enfeksiyonlarında mide fizyolojisini incelemek için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, Dr. Ellen Lauchnor, Dr. Phil Stewart ve Bengisu Kılıç'a önceki çalışmaları ve O2 mikrosensörleri ile ilgili yardımları için teşekkür eder; Organoid kültür ve mikromanipülasyon eğitimi için Andy Sebrell; Organoid kültürü, medya hazırlama, veri kaydı ve organizasyon konularında yardım için Lexi Burcham; ve elektrofizyoloji konusunda genel tavsiyeler için Dr. Susy Kohout. Görüntüleme konusundaki yardımları için Dr. Heidi Smith'e teşekkür eder ve Ulusal Bilim Vakfı MRI Programı (2018562), MJ Murdock Charitable Trust (202016116), ABD Savunma Bakanlığı (77369LSRIP & W911NF1910288) ve Montana Nanoteknoloji Tesisi (NSF Grant ECCS-2025391 tarafından desteklenen bir NNCI üyesi) tarafından sağlanan fonlarla desteklenen Montana Eyalet Üniversitesi'ndeki Biyofilm Mühendisliği Biyogörüntüleme Tesisi'ne teşekkür ederiz.
Bu çalışmayı mümkün kılan tüm Unisense ekibine, özellikle Dr. Andrew Cerskus, Dr. Laura Woods, Dr. Lars Larsen, Dr. Tage Dalsgaard, Dr. Line Daugaard, Dr. Karen Maegaard ve Mette Gammelgaard'a özel teşekkürler. Çalışmamızın finansmanı, Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri R01 GM13140801 (DB, RB) ve UL1 TR002319 (KNL) ve Montana Eyalet Üniversitesi Araştırma ve Ekonomik Kalkınma Ofisi'nden (DB) bir Araştırma Genişletme Ödülü tarafından sağlandı. Şekil 1A , BioRender ile oluşturulmuştur.

Bu protokol, farklı bir lümene sahip ve yapay bir hücre dışı matrise (ECM, örneğin Matrigel) gömülü olan en az 200 μm çapında 3D organoidler gerektirir. Organoid türevi için insan mide dokuları, Montana Eyalet Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu'nun onayı ve Bozeman Health'te üst endoskopi yapılan hastalardan bilgilendirilmiş onam (protokol # 2023-48-FCR, D.B.'ye) veya Ulusal Hastalık Araştırma Değişimi'nden (protokol #DB062615-EX) muaf tam mide veya sleeve gastrektomi örnekleri olarak alındı. Bu çalışma için kullanılan organoid çizgileri ve geçiş numaraları hakkında bilgi Tablo 1'de verilmiştir ve ortam bileşimi Tablo 2'de listelenmiştir. Gastrointestinal organoid hatların oluşturulması ve bakımı için daha önce yayınlanmış protokollerebakın 6,26,27.
1. pH profili oluşturma için insan mide organoidlerinin hazırlanması
<ol><li>Standart protokolleri kullanarak mide organoid kültürlerini başlatın ve sürdürün. Organoidleri, oyuk başına 500 μL genleşme ortamında 24 oyuklu plakalarda tutun (Tablo 2). Passage, pH profilleme deneylerine hazırlık olarak her 5-7 günde bir organoid hatları kurdu ve 35 mm'lik bir cam tabanlı tabağa aktardı. NOT: Deneylerimiz için organoid kültürler, yukarıda tarif edildiği gibi yetişkin dokusundan elde edilen mide bezi preparatlarından türetilmiştir. Daha önce tarif edildiği gibi, bu bezleri ECM'de askıya alınmadan önce izole etmek için bir kollajenaz doku sindirim yöntemi kullanıyoruz 25,28,29.</li>
	<li>1-15 pasajlarında aktif olarak büyüyen organoid kültürlerden, 3,5 mm'lik Petri kaplarında transfer ve genişleme için çapları 200 ila 700 μm arasında olan en az 100 organoid (yaklaşık 2 milyon hücre) içeren kuyucukları seçin.</li>
	<li>Organoidleri kaplama için hazırlarken (aşama 1.4-1.8), hücre dışı matris (ECM) alikotlarının buz üzerinde en az 45 dakika çözülmesine izin verin. Jelleşmeyi önlemek için ECM'yi bu protokol boyunca buz üzerinde tutun. Hücre kültürü plakalarını 37 °C,% 5 CO2 inkübatöre yerleştirerek önceden ısıtın.</li>
	<li>Ortamı kuyucuklardan çıkarın ve buz gibi PBS'yi her bir ECM damlacığına pipetleyerek ve jeli bir P1000 pipetinin ucuyla çizerek mide organoid kültürlerini hasat edin. PBS'yi organoidler içeren ECM parçalarıyla 15 mL'lik konik bir tüpe pipetleyin.</li>
	<li>Tüpü 200 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Organoidleri içeren ECM parçaları, tüpün dibinde bir tabaka olarak görünecektir. Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve her tüpe 350 μL% 0.25 tripsin-EDTA pipetleyin, yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. Tüpleri 37 ° C'lik bir su banyosunda 2-5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Tripsin-EDTA ile inkübasyonun ardından, her tüpe penisilin / streptomisin içeren 600 μL buz gibi soğuk DMEM ekleyin ve en az 40 kez kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyin. 200 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin. pH ölçümleri için kültürler oluşturmak için, hücre peletini buz gibi, sıvı ECM'de kaplama için organoid peletin ECM'ye 1:4 v/v oranında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Her numune için, 35 mm'lik cam tabanlı bir kabın çapı boyunca ince bir yatay çizgi halinde organoidler/organoid parçaları içeren 40 μL sıvı ECM plakalayın. NOT: Jeli yuvarlak bir damlacık yerine bir çizgi halinde plakaya dağıtmak, kültürü incelterek tek tek organoidlere daha kolay erişim sağlar.</li>
	<li>Jelin 15-30 dakika polimerize olmasına izin verin; daha sonra, jeli bozmamak için kuyunun kenarı boyunca pipetleyerek plakaya dikkatlice 2 mL organoid genleşme ortamı ekleyin.</li>
	<li>Medyayı iki günde bir değiştirin. En az 10 organoidin minimum 400 μm çapa ulaşması için 4-8 gün bekleyin.</li>
	<li>Bir pH profili oluşturma deneyine devam etmek için, her kültürün aşağıdaki kriterleri karşılayan en az 10 organoid içerdiğinden emin olun: >200 μm çap, sağlıklı görünüm (parlak alan mikroskobu ile gözlemlenen organoidler içinde çok az veya hiç koyu renkli materyal görünmez) ve diğer organoidler tarafından aşırı kalabalık değil.</li>
</ol>2. Mikroelektrotların ambalajından çıkarılması ve kalibrasyonu
NOT: Mikro ölçekli ölçümleri etkinleştirmek için, entegre (ve dolayısıyla daha hantal) bir tasarım kullanmak yerine pH sensörü mikro elektroduna ek olarak ayrı bir referans elektrodu kullanılır. Hem pH mikroelektrodu hem de referans elektrodu ıslak olarak saklanmalıdır. Bir seferde 10 dakikadan fazla havaya maruz kalmasına izin vermeyin. Uygulama için uygun uç boyutunu belirleyin. Burada, eğimli uç çapı 25 μm olan potansiyometrik bir pH mikroelektrodu kullandık.
<ol><li>Mikroelektrot hala koruma tüpündeyken, uçta herhangi bir hasar olup olmadığını görsel olarak inceleyin.</li>
	<li>Referans elektrodu, konektör aracılığıyla pH elektrot kablosuna bağlayın. Ardından, mikroelektrodu amplifikatöre ve amplifikatörü bir USB kablosu aracılığıyla yazılımla birlikte topraklanmış bir PC'ye bağlayın (Şekil 1A).</li>
	<li>İki adet 50 mL konik tüpü 2/3 %70 etanol ve deiyonize H2O (diH2O) ile doldurun. Mikroelektrodu ve referans elektrodu diH2O tüpüne yerleştirin ve her iki ucun da sıvıya en az 1 cm batırılmış göründüğünden emin olun. NOT: Bu ve benzeri adımlar için uzun beherler de kullanılabilir.</li>
	<li>Elektrotların ~ 10 dakika dengelenmesine izin verin. NOT: Prosedür bu adımda da duraklatılabilir ve elektrotlar diH2O'da saklanabileceğinden daha sonra devam ettirilebilir.</li>
	<li>Elektrotlar dengelenirken, bilgisayar iş istasyonundaki yazılımı (kırmızı simge) açın. Ayarlar sekmesi altında, mikroelektrotun yanındaki kutunun işaretli olduğundan emin olun, bu da elektrotun doğru şekilde bağlandığını ve yazılım tarafından tanındığını gösterir. Pencerenin sol üst köşesindeki Denemeyi Başlat'a tıklayın ve istediğiniz dosya adını ve hedefini girin. Sensör kalibrasyonu ve deney ayarları penceresinde, yazılımı yeni bir kalibrasyona hazırlamak için Tüm noktaları temizle'ye tıklayın.</li>
	<li>İki adet 50 mL konik tüpü 2/3 oranında pH 4.01 ve pH 9.21 kalibrasyon tamponları ile doldurun. Koruyucu hortumu ve referans elektrodu hassas bir laboratuvar mendiliyle nazikçe kurulayın.</li>
	<li>pH 4.01 tamponundaki elektrotlardan başlayarak, bilinen pH değeri olarak 4.01'i girin. MV okuması stabilize olduğunda, nokta ekle'yi seçin. Sinyalin ~380 mV'de sabit olduğunu onaylayın. Nokta eklendikten sonra, durulamak için her iki elektrodu da diH2O'ya geri yerleştirin, ardından tekrar kurulayın.</li>
	<li>Önceki adımı 9.21 arabelleği ile tekrarlayın ve sinyal sabit olduğunda (~83 mV) nokta ekle'ye tıklayın. Mikroelektrotların pH 4.01 ile 9.21 arasında doğrusal olarak yanıt verdiğini kontrol edin; Bu nedenle, sadece iki noktalı bir kalibrasyon eğrisi gereklidir. Bu noktalar arasında ortaya çıkan çizginin 50-70 mV/pH biriminde negatif bir eğime sahip olduğundan emin olun. Kalibrasyonu kaydet ve kullan'a tıklayın. NOT: Artık ölçümleri kaydetmeye başlamaya hazırsınız30.</li>
</ol>3. İnsan mide organoidlerinin pH profili
NOT: Sağ elini kullanan bir kullanıcı için aşağıdaki protokol açıklanmıştır. DİKKAT: PC'niz uyku moduna girerse devam eden ölçümler kesintiye uğrayacağından, PC'nizdeki tüm güç tasarrufu seçeneklerini devre dışı bırakın.
<ol><li>Referans elektrodunu tutmak için stereomikroskobun sol tarafına bir kelepçe ile bir halka standı monte edin. Mikroskobun sağ tarafına ağır bir laboratuvar standına bağlı bir mikromanipülatör yerleştirin (Şekil 1A).</li>
	<li>Mikroelektrodu bankın üzerine düz bir şekilde koyarak ve kasayı hızlı, hızlı bir hareketle çekerek koruma kılıfından dikkatlice çıkarın. DİKKAT: Mikroelektrotlar inanılmaz derecede kırılgandır ve ucun sert, katı malzeme ile temas etmemesine dikkat edilmelidir. En iyi sonuçları elde etmek için, tezgahın titremesine veya elektrotların istenmeyen hareketine neden olabilecek ekipmandan arındırılmış sağlam bir tezgah üzerinde ölçümler yapın.</li>
	<li>Mikroelektrodu bir mikromanipülatör üzerine monte edin ve stereoskop ve mikromanipülatörü, mikroelektrot objektife veya mikroskobun diğer kısımlarına çarpmadan kültür kabına doğru ilerleyebilecek şekilde düzenleyin.</li>
	<li>Organoidleri içeren kültür kabını, profili oluşturulacak ilk organoidin yeterli görselleştirmesine sahip olacak şekilde konumlandırın (Şekil 1B).</li>
	<li>Referans elektrodu, stereoskopun solundaki halka standı üzerindeki cl'ye hafifçe sabitleyin. Referans elektrodu, ECM'yi çevreleyen ortamda duracak şekilde konumlandırın. Sahne ölçümler arasında hareket ettirilirken organoidleri bozmayacağından emin olun.</li>
	<li>Doğrudan kültür plakasına bakarak (mikroskoba değil), mikroelektrotun ucunu ortama yeterince daldırılana kadar ilerletin. Yazılımdaki Veri kaydedici sekmesi altında, kayda başlamak için Başlat düğmesine (sağa bakan tek üçgen) tıklayın. Ekranın sağ tarafında Kalibre Edildi onay kutusunun seçili olduğundan emin olun. NOT: Bir sonraki bölgeye ilerlemeden önce her okumanın stabilize olması için ~10 saniye bekleyin.</li>
	<li>ECM'ye girmeden önce, elektrot ucunun mikroskop altında görünür olduğundan ve ilgilenilen ilk organoide doğru doğrusal olarak ilerleyecek şekilde konumlandırıldığından emin olun. Elektrodu, herhangi bir organoid ile temas etmeden yavaşça jelin içine ilerletin. En az üç pH okuması kaydedin ve ortalamayı hesaplayın.</li>
	<li>Mikroelektrodu, yüzeye dik eksen boyunca ilgilenilen ilk organoide doğru ilerlemeye hazır olacak şekilde konumlandırın. Elektrotun epitel yüzeyine nüfuz etmeden küçük bir girinti yapmasına izin verin (Şekil 1C). NOT: Bu adım aynı zamanda organoidin yerinde kalıp kalmayacağı veya ECM'de daha serbestçe hareket edip edemeyeceği konusunda da fikir verecektir.</li>
	<li>Tek bir hızlı hareketle mikroelektrodu organoidin içine ilerletin. Organoid mikroelektrotun etrafında hareket ederse veya uzaklaşırsa, biraz farklı bir açı deneyin veya başka bir organoide veya tabağın kapak camı tabanını çevreleyen plastik kenara karşı yedekleyin. Her deneysel koşul için 10 farklı organoidin lümen pH'ını (üç ayrı kez) ölçün. Ölçümleri kaydetmeyi bitirdiğinizde, kare dur düğmesine tıklayın. DİKKAT: Elektrodu organoid lümene ne kadar ilerleteceğinize karar vermek için organoidin çapını tahmin edin ve onu delmemeye dikkat edin. Daha fazla doğruluk için, varsa mikroskobunuzun kamera yazılımıyla çapı ölçün. NOT: Mikroelektrotun ucu bir veya birden fazla ölçümden sonra gözle görülür şekilde kalıntılarla kaplanırsa, devam etmeden önce mikroelektrodu hücre ayrışma solüsyonu, PBS, EtOH ve ardından diH2O içinde yıkayın.</li>
</ol>4. Motorlu profil oluşturma (isteğe bağlı)
NOT: Bu seçenek, nihai olarak bir motor kontrolörü31 aracılığıyla bilgisayar yazılımı tarafından kontrol edilen mekanik bir motor aşamasına monte edilmiş bir mikromanipülatör gerektirir.
<ol><li>Profil oluşturma yazılımını (kahverengi simge) açın ve Profil Oluşturma sekmesi altında yeni bir deneme başlatın.</li>
	<li>Z ekseni ayarları, bir motor aparatı düzgün şekilde bağlandığında Motoru otomatik olarak tanıyacaktır. NOT: Bu kurulumda x ve y yönlerindeki hareket hala manuel olarak kontrol edilir.</li>
	<li>Profil etkileşimi sekmesinibulun 30. Başlatmaya basmadan önce, istenen mesafeden organoid girişini sağlamak için mikroskop merceğine hızlı bir şekilde bakmaya geçmenin mümkün olduğundan emin olun. Profil ayarları'na gidin ve aşağıdakileri yapın:<ol><li>Başlangıç mesafesinin 0 μm olduğunu belirtin. DİKKAT: Epitel kabuğu belirli bir organoid üzerinde özellikle sertse, organoid nüfuz etmek yerine itilebilir veya deforme olabilir. İtme söz konusuysa, elektrodu ilerletmeye devam edin, ancak yazılım bunu otomatik olarak kaydedemediği için girişin gerçekleştiği noktaya dikkat edin.</li>
		<li>Profili çıkarılan organoidin boyutuna bakarak, bir organoidin tahmini çapından en fazla 3/4 oranında bir Bitiş mesafesi belirtin. NOT: Bu özel adım, elektrot ucunun hasar görmesini önlemek için tasarlanmıştır.</li>
		<li>Şekil 2E'de gösterildiği gibi istenen adım boyutunu (100 μm) belirtin. Minimum adım boyutunun elektrot ucunun boyutuyla eşleştiğinden emin olun (örneğin, 25 μm pH-25 elektrot ucu için 25 μm).</li>
		<li>Motorun elektrot ucunu profiller arasına geri döndüreceği güvenli bir konumu belirtin. NOT: Bu, sensörün manuel mikromanipülatör ile x ve y yönlerinde güvenli bir şekilde yanlara doğru hareket ettirilebileceği numunenin üzerinde (organoidin dışında) rahat bir yükseklik olmalıdır. Sensör açısını varsayılan ayarında bırakın.</li>
		<li>Elektrotun dengelenmesini sağlamak için, Ölçüm(ler)den önce bekleyin altında en az 3 saniye belirtin.</li>
		<li>Hesaplama dönemlerini en az 1 sn olarak ayarlayın. Bu dönemdeki ölçümlerin ortalaması alınacaktır. NOT: Elektriksel gürültünün yüksek olduğu bir ortamda ölçüm yapıyorsanız, daha uzun bir süre belirtmek yardımcı olabilir.</li>
		<li>Arasındaki Gecikme(ler)i en az 1 sn olarak ayarlayın.</li>
		<li>Her derinlikte ölçülecek tercih edilen Çoğaltma sayısını ayarlayın.</li>
		<li>Başlat düğmesine basarak ölçümleri kaydetmeye başlayın.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Elektrotların temizlenmesi
<ol><li>Temizlenecek elektrodu tekrar koruma tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Ölçümlerden sonra elektrotları diH2O ile yıkayın.</li>
	<li>Elektrotları birkaç dakika boyunca %70 etanol ile yıkayın.</li>
	<li>Elektrotları pH 4.01 tamponu ile durulayın.</li>
	<li>Ölçümlere devam etmeden önce elektrotları diH2O ile bir kez daha durulayın.</li>
</ol>6. Elektrotların saklanması
NOT: Her iki elektrot da oda sıcaklığında, kazara hasara karşı güvenli, düşük aktiviteli bir yerde saklanmalıdır.
<ol><li>pH mikroelektrodunu kullandıktan sonra, dikkatlice yatay olarak koruma tüpüne geri kaydırın (yatay destek için laboratuvar tezgahı boyunca kaydırın).</li>
	<li>Mikroelektrodu dik tutarak (uç yukarı bakacak şekilde), koruma tüpünü nazikçe steril suyla doldurun. Koruma tüpünü, elektrotla birlikte gelen tıpa ile tıka. Koruma borusundaki tüm deliklerin elektrik bandı ile kapatıldığından emin olun. Bir sonraki kullanıma kadar kırılmaz bir kutuda saklayın. NOT: Saklandığında elektrotları yerinde tutmak için tasarlanmış koruyucu ekler içereceğinden, elektrotların geldiği orijinal kutunun kullanılması önerilir.</li>
	<li>Referans elektrodu, 3M KCl çözeltisi ile doldurulmuş bir beher veya dereceli silindirde saklayın. Çözeltinin buharlaşmasını önlemek için beher/dereceli silindiri parafilm ile örtün. NOT: Dereceli bir silindir kullanılıyorsa, kazara hareket etmesini önlemek için laboratuvar tezgahına bantla sabitlenmesi önerilir.</li>
</ol>7. Metil kırmızı enjeksiyon (isteğe bağlı)
NOT: Metil kırmızısı, mikroelektrot ölçümlerini doğrulamak için kullanılabilen kolorimetrik bir indikatör boyadır.
<ol><li>2 μL'lik bir cam kılcal damarı steril mineral yağ ile doldurun, mikromanipülatör kontrollü bir nL otomatik enjektöre yükleyin ve ardından %0.02 metil kırmızısı ve 150 mM HCl içeren bir çözelti ile doldurun. NOT: HCl'nin asitliği nedeniyle çözelti kılcal damar içindeyken kırmızı/pembe görünmelidir.</li>
	<li>Çapı en az 300 μm olan organoidleri 9.2 μL çözelti25 ile enjekte edin.</li>
	<li>Stereomikroskoba uyarlanmış bir kamera kullanarak görüntü veya video çekin (Şekil 2G).</li>
</ol>

Mikroelektrotlar ile 3D Gastrik Organoidlerde Hassas Luminal pH Ölçümü

<ol><li>Zhang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+spatial+omics+dissects+organoid+biomimicry%5BTitle%5D)+AND+%22GEN+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Tissue spatial omics dissects organoid biomimicry.</a> GEN Biotechnology. 2 (5), 372-383 (2023).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Lancaster, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebral+organoids+model+human+brain+development+and+microcephaly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cerebral organoids model human brain development and microcephaly.</a> Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3d+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3d organoid systems.</a> Trends Mol Med. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Achberger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+organoid+and+organ-on-a-chip+technology+to+generate+complex+multi-layer+tissue+models+in+a+human+retina-on-a-chip+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Merging organoid and organ-on-a-chip technology to generate complex multi-layer tissue models in a human retina-on-a-chip platform.</a> Elife. 8, e46188(2019).</li>
<li>Bartfeld, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+human+gastric+epithelial+stem+cells+and+their+responses+to+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection.</a> Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nat Cell Biol. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Davies, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDavies%2C+JA+%22Organoids+and+Mini-organs%22">Organoids and Mini-organs</a>. Davies, J. A., Lawrence, M. L. , Academic Press. Ch. 1-2 3-40 (2018).</li>
<li>Ambrosini, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recapitulation+of+the+accessible+interface+of+biopsy-derived+canine+intestinal+organoids+to+study+epithelial-luminal+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions.</a> PLoS One. 15 (4), e0231423(2020).</li>
<li>Williams, S. E., Turnberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+a+pH+gradient+across+mucus+adherent+to+rabbit+gastric+mucosa%3A+Evidence+for+a+%27mucus-bicarbonate%27+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Demonstration of a pH gradient across mucus adherent to rabbit gastric mucosa: Evidence for a 'mucus-bicarbonate' barrier.</a> Gut. 22 (2), 94-96 (1981).</li>
<li>Schubert, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastric+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Gastric secretion.</a> Curr Opin Gastroenterol. 20 (6), 519-525 (2004).</li>
<li>Celli, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rheology+of+gastric+mucin+exhibits+a+pH-dependent+sol%E2%88%92gel+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Rheology of gastric mucin exhibits a pH-dependent sol−gel transition.</a> Biomacromolecules. 8 (5), 1580-1586 (2007).</li>
<li>Takeshita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+pH-dependent+errors+in+spectrophotometric+pH+measurements+of+seawater%5BTitle%5D)+AND+%22Marine+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Assessment of pH-dependent errors in spectrophotometric pH measurements of seawater.</a> Marine Chemistry. 223, 103801(2020).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%CE%B2-catenin+promotes+gastric+fundus+specification+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt/β-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans.</a> Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).</li>
<li>Larsen, M., Borisov, S. M., Grunwald, B., Klimant, I., Glud, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+inexpensive+high+resolution+color+ratiometric+planar+optode+imaging+approach%3A+Application+to+oxygen+and+ph+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%3A+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple and inexpensive high resolution color ratiometric planar optode imaging approach: Application to oxygen and ph sensing.</a> Limnology and Oceanography: Methods. 9 (9), 348-360 (2011).</li>
<li>Jewell, M. P., Galyean, A. A., Kirk Harris, J., Zemanick, E. T., Cash, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminescent+nanosensors+for+ratiometric+monitoring+of+three-dimensional+oxygen+gradients+in+laboratory+and+clinical+pseudomonas+aeruginosa+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Luminescent nanosensors for ratiometric monitoring of three-dimensional oxygen gradients in laboratory and clinical pseudomonas aeruginosa biofilms.</a> Appl Environ Microbiol. 85 (20), e01116-e01119 (2019).</li>
<li>Brooks, E. L., Hussain, K. K., Kotecha, K., Abdalla, A., Patel, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional-printed+electrochemical+multiwell+plates+for+monitoring+food+intolerance+from+intestinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sens%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional-printed electrochemical multiwell plates for monitoring food intolerance from intestinal organoids.</a> ACS Sens. 8 (2), 712-720 (2023).</li>
<li>pH and reference electrode manual. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2023/05/2023.05-pH-and-ref-sensor-manual.pdf</a> (2023).</li>
<li>Villahermosa, D., Corzo, A., Garcia-Robledo, E., Gonzalez, J. M., Papaspyrou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+indigenous+nitrate+reducing+sulfide+oxidizing+activity+in+microaerophilic+wastewater+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Kinetics of indigenous nitrate reducing sulfide oxidizing activity in microaerophilic wastewater biofilms.</a> PLoS One. 11 (2), 0149096(2016).</li>
<li>Pabst, B., Pitts, B., Lauchnor, E., Stewart, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gel-entrapped+staphylococcus+aureus+bacteria+as+models+of+biofilm+infection+exhibit+growth+in+dense+aggregates%2C+oxygen+limitation%2C+antibiotic+tolerance%2C+and+heterogeneous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Gel-entrapped staphylococcus aureus bacteria as models of biofilm infection exhibit growth in dense aggregates, oxygen limitation, antibiotic tolerance, and heterogeneous gene expression.</a> Antimicrob Agents Chemother. 60 (10), 6294-6301 (2016).</li>
<li>Ploug, H., Stolte, W., Epping, E. H. G., Jørgensen, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusive+boundary+layers%2C+photosynthesis%2C+and+respiration+of+the+colony-forming+plankton+algae%2C+phaeocystis+sp%5BTitle%5D)+AND+%22Limnology+and+Oceanography%22%5BJournal%5D)">Diffusive boundary layers, photosynthesis, and respiration of the colony-forming plankton algae, phaeocystis sp.</a> Limnology and Oceanography. 44 (8), 1949-1958 (1999).</li>
<li>Kolpen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrous+oxide+production+in+sputum+from+cystic+fibrosis+patients+with+chronic+pseudomonas+aeruginosa+lung+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nitrous oxide production in sputum from cystic fibrosis patients with chronic pseudomonas aeruginosa lung infection.</a> PLoS One. 9 (1), 84353(2014).</li>
<li>Murphy, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+oxygen+tension+within+mesenchymal+stem+cell+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Measurement of oxygen tension within mesenchymal stem cell spheroids.</a> J R Soc Interface. 14 (127), 20160851(2017).</li>
<li>Sebrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+gastric+spheroid+co-culture+model+reveals+chemokine-dependent+recruitment+of+human+dendritic+cells+to+the+gastric+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">A novel gastric spheroid co-culture model reveals chemokine-dependent recruitment of human dendritic cells to the gastric epithelium.</a> Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 8 (1), e153 157-171 (2019).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nat Protoc. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Takase, Y., Fujishima, K., Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+3d+culturing+of+organoids+from+murine+intestinal+crypts+and+a+single+stem+cell+for+organoid+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The 3d culturing of organoids from murine intestinal crypts and a single stem cell for organoid research.</a> J Vis Exp. (194), e65219(2023).</li>
<li>Cherne, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+hydrogel%2C+vitrogel%28%28r%29%29+organoid-3%2C+improves+immune+cell-epithelial+interactions+in+a+tissue+chip+co-culture+model+of+human+gastric+organoids+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">A synthetic hydrogel, vitrogel((r)) organoid-3, improves immune cell-epithelial interactions in a tissue chip co-culture model of human gastric organoids and dendritic cells.</a> Front Pharmacol. 12, 707891(2021).</li>
<li>Sebrell, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+analysis+of+human+gastric+epithelial+spheroids+reveals+spontaneous+rupture%2C+rotation+and+fusion+events%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Live imaging analysis of human gastric epithelial spheroids reveals spontaneous rupture, rotation and fusion events.</a> Cell Tissue Res. 371 (2), 293-307 (2018).</li>
<li>Sensortrace suite user manual. 3.3. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/10/SensorTrace-Suite-Manual.pdf</a> (2023).</li>
<li>Microprofiling system user manual. Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf">https://unisense.com/wp-content/uploads/2021/09/2023.11-MicroProfiling-System-2.pdf</a> (2023).</li>
<li>Wolffling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egf+and+bmps+govern+differentiation+and+patterning+in+human+gastric+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Egf and bmps govern differentiation and patterning in human gastric glands.</a> Gastroenterology. 161 (2), e616 623-636 (2021).</li>
<li>Boccellato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarised+epithelial+monolayers+of+the+gastric+mucosa+reveal+insights+into+mucosal+homeostasis+and+defence+against+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection.</a> Gut. 68 (3), 400-413 (2019).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+human+development+and+disease+in+pluripotent+stem-cell-derived+gastric+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modelling human development and disease in pluripotent stem-cell-derived gastric organoids.</a> Nature. 516 (7531), 400-404 (2014).</li>
<li>Schumacher, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+murine-derived+fundic+organoids+in+studies+of+gastric+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">The use of murine-derived fundic organoids in studies of gastric physiology.</a> J Physiol. 593 (8), 1809-1827 (2015).</li>
<li>Unisense. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://unisense.com/products/ph-microelectrode/">https://unisense.com/products/ph-microelectrode/</a> (2024).</li>
<li>Mccracken, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+promotes+gastric+fundus+specification+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin promotes gastric fundus specification in mice and humans.</a> Nature. 541 (7636), 182-187 (2017).</li>
<li>Schreiber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+measurement+of+ph+in+the+secreting+canaliculus+of+the+gastric+parietal+cell+and+adjacent+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">In situ measurement of ph in the secreting canaliculus of the gastric parietal cell and adjacent structures.</a> Cell Tissue Res. 329 (2), 313-320 (2007).</li>
<li>Xu, H., Li, J., Chen, H., Wang, C., Ghishan, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nhe8+plays+important+roles+in+gastric+mucosal+protection%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Nhe8 plays important roles in gastric mucosal protection.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 304 (3), G257-G261 (2013).</li>
<li>Gawenis, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+gastric+acid+secretion+in+mice+with+a+targeted+disruption+of+the+nhe4+na%2B%2Fh%2B+exchanger%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Impaired gastric acid secretion in mice with a targeted disruption of the nhe4 na+/h+ exchanger.</a> J Biol Chem. 280 (13), 12781-12789 (2005).</li>
<li>Lewis, O. L., Keener, J. P., Fogelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physics-based+model+for+maintenance+of+the+ph+gradient+in+the+gastric+mucus+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol-Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">A physics-based model for maintenance of the ph gradient in the gastric mucus layer.</a> Am J Physiol-Gastrointest Liver Physiol. 313 (6), G599-G612 (2017).</li>
<li>Okkelman, I. A., Neto, N., Papkovsky, D. B., Monaghan, M. G., Dmitriev, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deeper+understanding+of+intestinal+organoid+metabolism+revealed+by+combining+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+%28flim%29+and+extracellular+flux+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">A deeper understanding of intestinal organoid metabolism revealed by combining fluorescence lifetime imaging microscopy (flim) and extracellular flux analyses.</a> Redox Biol. 30, 101420(2020).</li>
<li>Pleguezuelos-Manzano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+culture+of+human+intestinal+organoids+derived+from+adult+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells.</a> Curr Protoc Immunol. 130 (1), e106(2020).</li>
<li>Guimera, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimally+invasive+microsensor+specially+designed+for+simultaneous+dissolved+oxygen+and+ph+biofilm+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A minimally invasive microsensor specially designed for simultaneous dissolved oxygen and ph biofilm profiling.</a> Sensors (Basel). 19 (21), 4747(2019).</li>
</ol>

Yazarların açıklanacak herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Organoidlerin luminal boşluğuna sınırlı erişim, bu mikro çevrenin fizyolojik dinamikleri hakkındaki anlayışımızı ciddi şekilde kısıtlamıştır. Luminal fizyolojinin fonksiyonel analizleri için güvenilir bir araç, fizyoloji, farmakoloji ve hastalık araştırmaları için in vitro modeller olarak organoidlerden yararlanma yeteneğimizi artıracaktır. Organoidler, insan popülasyonu içindeki genetik değişkenliği çoğaltma potansiyeline sahip, son derece ayarlanabilir, fizyolojik olarak ilgili modellerdir. Organoid lümen içinde pH ölçümü için mevcut yöntemler, genellikle floresan mikroskobu veya spektroskopi 16,17,37 ile birleştirilmesi gereken yöntemler olan pH'a duyarlı boyalar veya nanopartiküller kullanmıştır. Açıklanan mikrosensör tabanlı profil oluşturma yöntemi, gastrointestinal organoidlerin intraluminal pH'ını yeni uzamsal hassasiyetle ölçmek için yeni bir yol sağlar. Yöntemimiz, gastrointestinal organoid luminal pH'ın tutarlı ve güvenilir ölçümünün yanı sıra bir pH gradyanının kanıtını göstermektedir. Yayınlanmamış deneylerde, bikarbonat sekresyonundan sorumlu olduğu bilinen SLC ailesi genleri SLC4A2 ve 26A7'nin yanı sıra proton değişiminden sorumlu olan SLC9A3, 9A4 ve 9A8'in ekspresyonunu doğruladık (Ek Şekil S1)38,39,40,41. Çalışmalarımız, organoidlerimizde bikarbonat sekresyonunun baskın olduğunu ve alkaliniteyi açıklayabilecek parietal hücrelerin eksikliğini göstermektedir.
Kullanılan mikroelektrotların organoid mikroprofil oluşturma için çok uygun olduğundan emin olmak önemlidir - buna doğru uç çapının seçilmesi de dahildir. Hem 25 μm hem de 50 μm uçları denedik ve benzer sonuçlar elde ettik (Şekil 2A), ancak daha az invaziv olması ve daha yüksek bir uzamsal çözünürlük sağlaması beklendiğinden, üreticinin tavsiyesine göre daha küçük uç boyutuyla ilerlemeye karar verdik. Bununla birlikte, bir dezavantaj olarak, daha küçük uçlar daha kırılgandır. İstenen uzamsal çözünürlüğün belirlenmesinde organoid boyutu dikkate alınmalıdır.
Protokoldeki kritik bir adım, organoid intraluminal pH ile ECM'deki ve ardından çevredeki kültür ortamındaki pH arasında ayrım yapma yeteneğinin sağlanmasıydı. Organoidlerin içine ve dışına makul miktarda metabolit akışı beklenir42. Bir organoidin pH'ının çevresinden etkilenmesini bekliyoruz ve altı bağımsız deneyde organoidlerin çevrelerinden sürekli olarak daha az alkali olduğunu bulduk (Şekil 2D). Ek olarak, sensör kalibrasyonu sırasında olduğu kadar profil oluşturmada da kararlılık önemlidir.
Doku kaynaklı organoidlerin belirli bir derecede donörden donöre değişkenlik göstermesi beklenir, bu nedenle ilaç tedavisi gibi herhangi bir deneysel müdahaleyi uygulamadan önce başlangıçta herhangi bir organoid çizgisinin profilini çıkarmak önemlidir43. Herhangi bir organoid kültür içindeki pH dalgalanmalarının, mikro ölçekte lokal iyon gradyanlarına ve immünofloresan ve immünohistokimyasal boyama (yayınlanmamış veriler) ile belirlenen luminal mukusun heterojen dağılımına bağlı olabileceğini varsayıyoruz. Tek tek organoid çizgileri ve pasajları arasında pH'da gözlenen değişiklikler, hücre bileşimindeki ve organoidlerin salgı aktivitesindeki bireysel farklılıklardan kaynaklanabilir. Ayrıca, bazı organoid çizgilerin doğal olarak nüfuz etmesinin diğerlerinden daha zor olduğunu bulduk. Benzer şekilde, bazıları elektrot girişinde yapısal bütünlüklerini kaybedebilir ve çökebilir (Ek Şekil S2 ve Ek Video S1). Bu, organoid geçişi ile ilişkili görünmemektedir, ancak en yaygın olarak ~ 1.5 mm çapındaki organoidlerde gözlenmiştir. Önceki bir çalışmada, organoidlerin içindeki mukusun heterojen olarak dağıldığını gösterdik29. Bu heterojenlik nedeniyle, mukus dağılımının bir ölçümü etkileyip etkilemediğini (veya ne ölçüde etkilediğini) belirlemek zorlaşır.
Mikrosensörler, organoid intraluminal fizyolojiyi yüksek hız ve yüksek uzamsal çözünürlükle profilleyebilen minimal invaziv araçlardır. Bu tür sensörler ayrıca kimyasal gradyanları bozmaz ve ilgilenilen mikro ortamdaki türbülansa karşı minimum düzeyde hassastır. Küçük tasarım, sensör elektrodunun referans elektrottan ayrılmasıyla mümkün hale gelir: Standart laboratuvar pH probları bu iki elektrotu birleştirerek daha büyük bir boyut elde edilmesini sağlar. Hücre içi ölçümler için optik pH ve O2 nanosensörleri, Colorado Maden Okulu'ndaki Cash grubu tarafından geliştirilmiştir ve hem fare hem de biyofilm modellerinde metabolitlerin ölçülmesinde başarılı olmuştur. Bununla birlikte, organoid lümendeki heterojenlik nedeniyle, bu tür sensörler yorumlanamayan sonuçlarayol açabilir 17. McCracken ve ark. SNARF-5F enjekte ederek ve pH'a duyarlı boyayı gerçek zamanlı konfokal mikroskopi37 ile görselleştirerek embriyonik kök hücre kaynaklı mide organoidlerinde luminal pH'ı analiz etti. Özellikle, McCracken tarafından bildirilen ölçümler, mevcut çalışmamızda elde edilen pH değerlerine oldukça benzerdi (Şekil 2B, C). Tekniğimiz belki de tek katmanlı bir mimaride, biyofilm profillemede olduğu gibi daha dikey bir kurulumla uygulanabilir, ancak bu, elektrotlara44 zarar verme riski oluşturabilir. Gelecekteki çalışmalar, hücre gelişimi ile ilişkili değişiklikleri değerlendirmek için birkaç gün boyunca sıralı pH ölçümlerini de içerebilir. Orta büyüklükteki organoidler genellikle sondalamadan sonra iyileşip iyileştiğinden, kültürlerin sterilitesi korunabildiği sürece bir organoid teorik olarak birden çok kez problanabilir. Organoid modellerdeki pH dinamikleri hakkındaki anlayışımızı geliştirirken, içindeki karmaşık ve tarihsel olarak erişilemeyen 3B mikro ortamın hassas haritalanması için uzamsal çözünürlük bir öncelik olmalıdır.
Özetle, bu protokol, bir mikromanipülatör ve bir stereomikroskop üzerine monte edilmiş pH mikroelektrotları kullanılarak yüksek uzay-zamansal çözünürlüğe sahip doğru pH ölçümleri için ayrıntılı bir yöntem sağlar. Bu yöntem, insan yetişkin kök hücre türevli organoidlerle doğrulanmıştır ve belirgin bir lümene sahip en az 200 μm çapındaki epitelyal organoidler için uygundur. Alternatif mikroelektrotlar seçilerek, bu yöntemin diğer organoid türlerine ve NO veyaO2 gibi alternatif bileşiklerin ölçümüne kolayca uyarlanabileceğini tahmin ediyoruz.

Organoidler - kök hücrelerden türetilen minyatür çok hücreli yapılar - insan fizyolojisini inceleme yeteneğimizde devrim yarattı ve düzenleyici ortamlarda bile hayvan modellerinin yerini almaya başladı1. 2009 yılında Sato ve arkadaşları tarafından bağırsak organoidlerinin ilk tanımından bu yana, organoid teknolojisi son derece popüler hale geldi2. Çok sayıda çalışma, organoid modellerin hücresel bileşimini ve işlevini ayrıntılı olarak karakterize etmiştir 3,4,5,6. Bununla birlikte, bu 3D çok hücreli yapıların luminal alanı büyük ölçüde tanımsız kalmaktadır 7,8. Lümen, polarize epitel hücrelerinin apikal kısımları ile çevrili mukozal dokulardan türetilen organoidlerin merkezi boşluğudur. Hücresel sekresyon ve emilim ağırlıklı olarak apikal epitel yüzeyinde meydana geldiğinden, organoidlerin luminal mikro çevresi bu önemli fizyolojik süreçler tarafından kontrol edilir. Şu anda kullanılan organoid modeller, hücre sinyal modellerinde, genel gövdede, metabolit konsantrasyon gradyanlarında ve çevresel koşullarda farklılıklar göstermektedir9. Bu nedenle organoid luminal fizyolojiyi anlamak, organ fonksiyonunun ve patolojisinin doğru modellenmesi için gereklidir. Ne yazık ki, lümenin göreceli olarak erişilemezliği, 3D organoidlerde luminal fizyolojinin fonksiyonel analizlerini önemli ölçüde engellemektedir10.
PH profillerini inceleme yeteneği, lümende yaklaşık 1-3 arasında değişen, 11,12,13 epitelinde nötre yakın olana kadar vücuttaki en dik proton gradyanına sahip olmasıyla ünlü midede özellikle önemlidir. Gastrik pH gradyanının mikro ölçekte sürdürülmesi ve organoid modellerin gastrik mukus tabakası boyunca bu dinamik ortamın özetlenmesindeki önemi hakkındaki anlayışımızda önemli bir boşluk bulunmaktadır. Organoid pH analizi için geleneksel yaklaşımlar, floresan veya kolorimetrik indikatörler olabilen pH'a duyarlı boyaların kullanımını içermektedir. McCracken ve ark. histamin tedavisine yanıt olarak luminal pH'daki bir düşüşü analiz etmek için organoidlere SNARF-5F-bir oransal pH indikatörünün luminal enjeksiyonunu kullandı. Bu tür boyalar, pH'ın gerçek zamanlı, invaziv olmayan izlenmesine izin verecek şekilde kültür ortamına dahil edilebilir. pH'a duyarlı boyalar, ölçümlerde düşük güvenilirlik ve doğruluğa katkıda bulunan karmaşık kalibrasyon adımları gerektirmekle kalmaz, aynı zamanda bu tür boyalar, ilgilenilen mikro ortam14,15 içindeki tam pH aralığını temsil etmeyebilecek belirli algılama aralıkları içinde çalışma eğilimindedir. Bununla birlikte, doğrulayıcı deneyler için gösterge boyalarının kullanılması makul kabul edilebilir. Floresan optod bazlı, pH algılama yaklaşımlarını kullanan optik nanosensörler de geliştirilmiştir; Bununla birlikte, bu tür algılama teknikleri mikroskobik görüntüleme gerektirir ve ayrıca fotoağartma, fototoksisite ve görüntüleme yanlılığına karşı hassastır16,17. Ek olarak, Brooks ve ark. üzerine organoidlerin kaplanabileceği mikroelektrotlar içeren 3D baskılı çok kuyulu plakalar18. Ancak bu yaklaşım, doğrudan organoid lümen içinde ölçümlere izin vermez.
Elektrot bazlı pH ölçümleri, diğer yöntemlere kıyasla daha fazla doğruluk sağlayabilir ve gerçek zamanlı pH izleme sağlayabilir. Ek olarak, mikromanipülatörlere monte edilen pH elektrotları, elektrot ucunun hassas konumu hassas bir şekilde kontrol edilebildiğinden, pH ölçümlerinin üstün uzamsal çözünürlüğüne izin verir. Bu, organoid modellerin analizlerinde mümkün olan en yüksek esnekliği ve tekrarlanabilirliği sağlar. Burada kullanılan elektrotlar, ince bir platin teli çevreleyen seçici pH camından protonların difüzyonuna dayalı olarak çalışan minyatür pH mikroelektrotlarıdır. Mikroelektrot, harici bir Ag-AgCl referans elektroduna bağlanır ve daha sonra yüksek empedanslı bir milivolt metreye bağlanır. Aynı çözeltiye daldırıldığında iki elektrot ucu arasındaki elektrik potansiyeli, çözeltinin19 pH'ını yansıtacaktır. Bu tür mikroprofil oluşturma sistemleri, biyofilmlerin20,21, planktonik alglerin22, insan balgam örneklerinin23 ve hatta mezenkimal kök hücre sferoidlerinin24 metabolik analizinde kullanılmıştır. Hem laboratuvarımız hem de Murphy ve ark. daha önce organoidlerin lümen boşluklarındaki oksijen konsantrasyonlarını değerlendirmek için mikromanipülatör kontrollü O2 mikroelektrotları kullanmışlardır. Murphy ve ark. bu yöntemi matematiksel modelleme ile eşleştirerek sferoidleri içinde bir oksijen gradyanı ortaya çıkardı. Grubumuz, çevredeki hücre dışı matriks25 ile karşılaştırıldığında, doku kaynaklı mide organoidlerinde azalmış luminal oksijen seviyeleri bulabildi.
Burada, karmaşık luminal mikro çevrelerinin daha iyi fizyolojik olarak anlaşılmasını sağlayacak küresel gastrointestinal sistem organoidlerinde luminal pH'ın manuel mikroelektrot profili için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz. Bu tekniğin, mikro ölçekte pH seviyelerinin gerçek zamanlı, yüksek çözünürlüklü ölçümleri yoluyla organoid fizyolojisinin araştırılmasına yeni bir boyut katacağını tahmin ediyoruz. Ayrıca, aşağıdaki protokol, çeşitli organoid model türlerindeO2, N2O, H2, NO, H2S, redoks ve sıcaklık analizi için kolayca uyarlanabilir. Fizyolojik profilleme, in vivo ortamları daha iyi taklit etmek için organoid kültür koşullarını optimize etmek için değerli bir araç olarak hizmet eder, böylece biyomedikal araştırmalarda organoid modellerin alaka düzeyini ve faydasını artırır.

<table><tbody><tr><td>3 M KCl</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Yalpalamayan-Serolojik Pipet, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kağıt/Plastik, Torba, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229091B</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Yalpalamayan-Serolojik Pipet, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kağıt/Plastik, Çanta, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229092B</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Santrifüj Tüpü - Köpük Raf, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229412</td><td></td></tr><tr><td>24 Kuyulu Doku Kültürü Plakası, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229124</td><td></td></tr><tr><td>25 mL Yalpalamayan Serolojik Pipet, Ayrı Ayrı Sarılmış, Kağıt/Plastik, Torba, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229093B</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Tabak | No. 1.5 Lamel | 20 mm Cam Çapı | Kaplamasız</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-20-C</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Santrifüj Tüpü - Köpük Raf, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>%70 Etanol</td><td>BP82031GAL</td><td>BP82031GAL</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m Hücre Süzgeci, Ayrı Ayrı Sarılmış, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229483&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1.000 ve mikro; L Uzatılmış Uzunluk Düşük Tutma Pipet Uçları, Raflı, Steril</td><td>CellTreat</td><td>229037</td><td></td></tr><tr><td>Amfoterisin B (Fungizone) Çözeltisi</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SV30078.01</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabini</td><td>Nuaire&nbsp;</td><td>NU-425-600</td><td>Sınıf II Tip A / B3</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini Fisher</td><td>Biyoreaktifleri</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>Hücre geri kazanım çözeltisi</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Hücre ayrışma çözeltisi</td></tr><tr><td>DMEM / F-12 (Gelişmiş DMEM)</td> <td>Gibco</td><td>12-491-015</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Kartal Ortamının Modifikasyonu (DMEM)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15017CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>HyClone Laboratories, Inc</td><td>SH30088</td><td></td></tr><tr><td>G418 Sülfat</td><td>Corning</td><td>30-234-CR</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat</td><td>IBI Bilimsel</td><td>IB02030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Serbest Asit</td><td>Cytiva</td><td>SH30237.01</td><td></td></tr><tr><td>HP Pavillion 2'si 1 arada 14" Dizüstü Bilgisayar Intel Core i3</td><td>HP</td><td>M03840-001</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144C-212</td><td></td></tr><tr><td>Kuluçka</td><td>Makinesi Fisher Scientific</td><td>11676604</td><td></td></tr><tr><td>iPhone 12 kamera</td><td>Apple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamin</td><td>Cytiva</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Büyük Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Hassas Görev Silecekleri, 1 Katlı</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>M 205 FA Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning</td><td>CB-40234 MC-40234</td><td></td> <td>354234 Matrigel Membran Matrisi</td></tr><tr><td></td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metil kırmızı</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MM33 Mikromanipülatör</td><td>Marzhauser Wetzlar</td><td>61-42-113-0000</td><td>Sağ elini kullanan</td></tr><tr><td>MS-15 Motorlu Sahne</td><td>Unisense</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject-II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td>nanolitre otomatik enjektör</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15-140-148</td><td></td></tr><tr><td>pH Mikroelektrotlar</td><td>Unisense</td><td>50-109158, 25-203452, 25-205272, 25-111626, 25-109160</td><td>SensorTrace yazılımı Apple bilgisayarlarla uyumlu değildir</td></tr><tr><td>Referans Elektrot</td><td>Unisense</td><td>REF-RM-001652</td><td>SensorTrace yazılımı aşağıdakilerle uyumlu değildir Apple bilgisayarlar</td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris Bioscience</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Akıllı Telefon Kamera Adaptörü</td><td>Gosky</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Teknik Özellikler Laboratuvar Standı LS</td><td>Unisense</td><td>LS-009238</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA %0.025, fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25-200-056</td><td></td></tr><tr><td>UniAmp Unisense</td><td></td><td>11632</td><td></td></tr><tr><td>United Biosystems Inc&nbsp; MİNİ HÜCRE SIYIRICILAR 200 / PK</td><td>Fisher</td><td>MCS-200</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 dihidroklorür</td><td>Tocris Bioscience</td><td>12-541-0</td><td></td></tr> <tr><td>& mikro; Sensör Kalibrasyon Kiti</td><td>Unisense/ Mettler Toledo</td><td>51-305-070, 51-302-069</td><td>pH 4.01 ve 9.21, 20 mL paketler</td></tr></tbody></table>

mikroelektrotlar kullanılarak Üç boyutlu gastrointestinal organoidlerde luminal ph profili oluşturma

Profiling Luminal pH in Three-Dimensional Gastrointestinal Organoids Using Microelectrodes

Gastrointestinal organoid modellerin optimizasyonu ve ayrıntılı karakterizasyonu, luminal ortamlarını analiz etmek için gelişmiş yöntemler gerektirir. Bu makale, mikromanipülatör kontrollü mikroelektrotlar aracılığıyla 3D insan mide organoidlerinin lümeni içindeki pH'ın hassas ölçümü için oldukça tekrarlanabilir bir yöntem sunmaktadır. pH mikroelektrotları ticari olarak temin edilebilir ve 25 μm çapında eğimli cam uçlardan oluşur. Ölçümler için, pH mikroelektrodu, Matrigel içinde süspanse edilmiş bir organoidin (>200 μm) lümenine ilerletilirken, bir referans elektrot kültür plakasındaki çevreleyen ortama daldırılır. 
İnsan mide vücudundan türetilen organoidlerin profilini çıkarmak için bu tür mikroelektrotları kullanarak, luminal pH'ın her kültür kuyusu içinde ~ 7.7 ± 0.037'de nispeten tutarlı olduğunu ve en az 15 dakika boyunca sürekli ölçümlerin elde edilebileceğini gösteriyoruz. Bazı büyük organoidlerde, ölçümler epitel yüzeyi ile lümen arasında bir pH gradyanı ortaya çıkardı, bu da organoidlerdeki pH ölçümlerinin yüksek uzamsal çözünürlükle elde edilebileceğini düşündürdü. Önceki bir çalışmada, organoidlerdeki luminal oksijen konsantrasyonlarını ölçmek için mikroelektrotlar başarıyla kullanıldı ve bu da organoid analizleri için bu yöntemin çok yönlülüğünü gösterdi. Özetle, bu protokol, 3D organoidler içindeki karmaşık luminal boşluğun işlevsel karakterizasyonu için önemli bir aracı tanımlar.

Asit salgılanması insan midesinin çok önemli bir işlevidir. Bununla birlikte, organoidlerde asit salgılanmasının ne ölçüde modellenebileceği hala bir tartışma konusudur6,32,33,34. Bu nedenle, mide organoidlerinde asit üretimini doğru bir şekilde ölçmek için yukarıda ayrıntıları verilen protokolü geliştirdik. Özellikle, birkaç kez geçilen standart genişleme koşulları altında kültürlenmiş, uyarılmamış yetişkin kök hücre türevli organoidler kullandık, bu da parietal hücre kaybına yol açtı35. Bu nedenle, model sistemimizde asit salgılayan parietal hücrelerin varlığı ve aktif asit salınımı beklenmemiştir.
Deneylerimiz için, cam tabanlı tabaklara ekilmiş 200 μm ile 1,000 μm arasında çaplara sahip organoidler kullandık. İlk olarak, mikroelektrotlar için iki farklı uç boyutunu test ettik: 25 μm uç çapına sahip bir pH-25 ve 50 μm uç çapına sahip bir pH-50. Şekil 2A'da gösterildiği gibi, daha büyük uçlara kıyasla daha küçük uçlarla elde edilen ölçümler arasında önemli bir fark yoktu. İlginç bir şekilde, organoidlerdeki başlangıç pH'ı ~ pH 8'de hafif alkali olma eğilimindeydi. 25 μm pH-25 ucunu kullanarak, daha sonra, her bir organoidden elde edilen üç ölçümle, aynı kültür plakası üzerinde tutulan farklı on organoid içindeki luminal pH'daki değişimi değerlendirdik (Şekil 2B). Bir plaka içinde, tek tek organoidlerin luminal pH'ı sadece hafif, anlamlı olmayan değişiklikler gösterdi (8.16 ± 0.12; p ≥0.0445-0.99) (Şekil 2B). Ayrıca, 3 ila 16 arasında değişen geçişlere sahip beş farklı organoid hattı içindeki intraluminal pH ölçümlerini karşılaştırdık (Şekil 2C). Yine, her kültürde tutarlı pH ölçümleri bulduk, ancak organoid çizgiler arasında önemli değişkenlik bulduk. Bununla birlikte, luminal pH genellikle pH 7.3 ile pH 8.2 arasında, bir büyüklük sırası içinde kaldı ve erken ve geç geçiş sayıları karşılaştırıldığında ortalama pH için belirgin bir eğilim yoktu (Şekil 2C). Daha sonra organoid lümenin pH'ının, organoid genleşme ortamının ve hücre dışı matrisin (ECM) pH'ı ile doğrudan ilişkili olup olmadığını sorduk. Ortam, organoidleri çevreleyen ECM ve organoid lümen arasındaki karşılaştırma, organoidlerin luminal pH'ı ECM'ninkinden daha düşük ve ECM pH'ı çevreleyen organoid genleşme ortamınınkinden daha düşük olan pH'da önemli farklılıklar ortaya çıkardı (Şekil 2D), organoidlerin luminal pH'ının doğrudan kültür ortamı tarafından belirlenmekten ziyade fizyolojik olarak ilgili olduğunu düşündürdü. Altı bağımsız deneyde, 7.13 ± 0.09'da nötre yakın bir ortalama luminal pH ölçtük.
Organoid lümenin daha yüksek uzamsal çözünürlükle pH ölçümlerini elde etmek için motorlu bir mikromanipülatör kullanıldı. Bu yaklaşım, mukus dolu organoid lümen29 içindeki pH veya diğer gradyanların kaydedilmesi gerekiyorsa geçerlidir. Şekil 2E , büyük organoidlerde (&gt;1.000 μm çapında) iki temsili pH ölçümü serisini göstermektedir, bu da her bir organoide giriş noktasını gösterir ve ~800 μm derinlikte biter. Profili çıkarılan iki organoid aynı çapa sahip olmadığından, ölçümler hemen karşılaştırılabilir değildir. Ne olursa olsun, epitel yüzeyi ile daha derin organoid lümen arasında Δ0.6'lık hafif bir pH gradyanına dair kanıt gösteriyoruz (Şekil 2E). Tedavi yanıtlarının gerçek zamanlı olarak ölçülmesini sağlayacak şekilde organoidlerde zaman içinde pH ölçümleri yapmanın fizibilitesini belirlemek için, intraluminal pH'ı temsili bir organoid içinde yaklaşık 20 dakika boyunca kaydettik ve okumanın ilk adaptasyon periyodundan sonra oldukça tutarlı kaldığını bulduk (Şekil 2F). Luminal pH ölçümlerini bağımsız bir yöntemle doğrulamak için, mikromanipülatöre monte edilmiş bir nanolitre otoenjektör kullanarak organoid lümene enjekte ettiğimiz pH'a duyarlı bir kolorimetrik boya (metil kırmızısı) kullandık (Şekil 2G). Boyanın sarı rengi, organoid lümenin, nötre yakın bir pH gösteren mikroelektrot ölçümleriyle tutarlı olarak &gt;6.2'lik bir pH'a sahip olduğunu doğruladı. Genel olarak, bu temsili sonuçlar, organoid kültürlerde mikroelektrot bazlı pH ölçümlerinin fizibilitesini ve tekrarlanabilirliğini göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig01.jpg"> Şekil 1: Yönteme genel bakış. (A) Profil oluşturma kurulumunun şematik diyagramı. Şekil 1A'daki mikroelektrot Unisense web sitesinden alınmıştır. 36 (B) Profil oluşturmaya hazır organoid kültürün, çevreleyen ECM'nin ve çevreleyen ortamın temsili görüntüsü (ölçek çubuğu = 5 mm). (C) Organoid problama hazırlığı için doğru mikroelektrot konumlandırma örneği (ölçek çubuğu = 500 μm). Kısaltma: ECM = hücre dışı matris. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66900/66900fig02.jpg"> Şekil 2: İnsan mide organoidlerinde mikrosensör profilinin doğrulanması. (A) 25 μm (pH-25) ve 50 μm (pH-50) mikroelektrot uçları kullanılarak orta lümen pH ölçümlerinin karşılaştırılması. Her biri tek bir temsili deneyden elde edilen 10 ayrı organoidden elde edilen veriler. (B) 10 ayrı organoid için üç tekrarlanan pH ölçümü elde edildi. Çoklu karşılaştırmalı tek yönlü ANOVA (p = 0.1229). (C) Bir pH-25 elektrodu ile elde edilen pH ölçümleri, farklı geçiş sayılarında analiz edilen beş organoid çizgisinin her birinde tutarlıdır; Boyut ve kullanılabilirliğe bağlı olarak hat başına 4-10 organoid ölçülür. Çoklu karşılaştırmalı tek yönlü ANOVA (p &lt; 0.0001). (D) Mide organoidleri ve çevresindeki Matrigel ve ortam içinde pH ölçümleri (n = 6 bağımsız deney). Gastrik epitel organoidlerine pH-25 ile nüfuz ederek elde edilen ölçümler. Her veri noktası, tek bir organoid içindeki 10 ayrı pH ölçümünün ortalamasıdır. Tek yönlü ANOVA (p &lt; 0.0001). (E) Motorlu bir mikromanipülatör kullanan iki temsili organoidin epitelden lümene pH profilleri. (F) Bir temsili organoidde zaman içinde pH stabilitesi (~ 19.8 dakika). (G) Mide organoid lümenine metil kırmızı pH indikatör boyası ve HCl'nin mikroenjeksiyonu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/66900fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="3">Donör</td>
		</tr><tr><td>Şekil</td>
			<td>Satır</td>
			<td>Pasaj</td>
			<td>Seks</td>
			<td>Yaş</td>
			<td>Etnik köken</td>
		</tr><tr><td>2bir</td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2 milyar</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1</td>
			<td>16</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>44</td>
			<td>Bilinmeyen</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>35</td>
			<td>6</td>
			<td>F</td>
			<td>40</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2C</td>
			<td>7</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2D</td>
			<td>36</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Bilinmeyen</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>37</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="3">Bilinmeyen</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>31</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>45</td>
			<td>H</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>9</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>7</td>
			<td>4</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr><tr><td>2E</td>
			<td>10</td>
			<td>15</td>
			<td>F</td>
			<td>43</td>
			<td>Bilinmeyen</td>
		</tr><tr><td>2F</td>
			<td>34</td>
			<td>3</td>
			<td>F</td>
			<td>33</td>
			<td>C</td>
		</tr><tr><td>2G Teknolojisi</td>
			<td>7</td>
			<td>5</td>
			<td>F</td>
			<td>26</td>
			<td>B</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">İnsan Gastrik Organoid Genişleme Ortamı (L-WRN)</td>
		</tr><tr><td>L-WRN şartlandırılmış ortam</td>
			<td>50%</td>
		</tr><tr><td>İleri düzey DMEM/F12</td>
			<td>37%</td>
		</tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td>
			<td>10%</td>
		</tr><tr><td>Penisilin / streptomisin</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>L-glutamin</td>
			<td>1%</td>
		</tr><tr><td>Gentamisin</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>Amfoterisin B</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>HEPES tamponu</td>
			<td>0.40%</td>
		</tr><tr><td>Y-27632 Serisi</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>SB-431542 Serisi</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2.
Ek Şekil S1: İnsan mide organoidlerinde iyon taşıyıcı ekspresyonu. Bağıl kopya sayıları 18S rRNA'ya normalize edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240425%20Supplemental%20Figure%201%20Revised.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: pH mikrosensör probu ile delinme sonrası deforme olmuş mimariye sahip insan mide organoidi. Ölçek çubuğu = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Figure%202.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Video S1: Gastrik organoid kültüründe başarısız profil oluşturma girişimi. 25 μm'lik pH mikroelektrodu, ilgilenilen organoide doğru manuel olarak ilerletilir. Açı yanlış değerlendirmesi nedeniyle başarısız bir denemeden sonra, farklı bir açı denenir ve organoidin profillenecek yapısal bütünlükten yoksun olduğu ortaya çıkar (küresel yapı sağlam değildir ve elektrotla penetrasyon üzerine deforme olur). Kullanıcı daha sonra farklı bir organoid denemek için yönlendirir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66900/240229%20Supplemental%20Video%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Mevcut protokol, intraluminal fizyolojinin uzay-zamansal karakterizasyonu için mikroelektrotlar kullanılarak insan dokusundan türetilmiş mide organoidlerinde pH ölçümlerini açıklamaktadır.

Mikroelektrotlar Kullanılarak Üç Boyutlu Gastrointestinal Organoidlerde Luminal pH Profili Oluşturma

The optimization and detailed characterization of gastrointestinal organoid models require advanced methods for analyzing their luminal environments. This ...

profiling-luminal-ph-three-dimensional-gastrointestinal-organoids

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bir üç boyutlu (3-D) bir ortamda büyüyen hücreler 2-B ortamları (örneğin, şişeler ya da bulaşıklar için) hücre ekimi üzerinde belirgin bir iyileşme göstermektedir. Burada dönen duvar-damar (RWV) Biyoreaktörlerde tarafından sağlanan mikrogravite altında kültüre insan bağırsak mukozasının bir çok hücreli 3-D Organotipik modelinin gelişimini betimler.

İnsan bağırsak mukozasının bir Multisellüler Üç boyutlu Organotipik Modelinin Geliştirilmesi yerçekimi Yetiştirilen

Bu iletişim kuralı insan bağırsak organoids floresan mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı aşağıdaki farmakolojik tedavide epitel bariyer geçirgenliği ölçümü açıklar ve cep mikroskobu canlı.

Gerçek zamanlı insan bağırsak Organoids epitel bariyer geçirgenliği ölçümü

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada bağırsak apikal spesifik etkileşimlerin modellenmesine izin veren iki protokol sunuyoruz. Organoid türevli bağırsak monolayerleri ve Hava-Sıvı Arayüzü (ALI) kültürleri, hem aydınlık hem de bazolateral taraflardan erişilebilen iyi ayırt edilmiş epitellerin üretilmesini kolaylaştırırken, polarite ters bağırsak organoidleri apikal yanlarını ortaya çıkarır ve yüksek verim testlerine uygundur.

Bağırsak Organoid Modellerini Kullanarak Apikal Spesifik Etkileşimleri İncelemek için Kültür Yöntemleri

Burada, kriyokorunmuş epitel kriptlerinden domuz bağırsak 3D organoidlerini kültürlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, epitel hücrelerinin apikal tarafına erişime izin veren 3D organoidlerden türetilen hücre monokatmanları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz.

Kriyokorunmuş Epitel Kriptlerinden Domuz Yavrusu Bağırsak 3D Organoidlerinin Kültürü ve Hücre Tek Katmanlarının Oluşturulması

Murin ince bağırsak kriptlerini ve kültür bağırsak 3D organoidlerini kriptlerden izole etmek için bir protokol tarif ediyoruz. Ek olarak, bir alt epitelyal hücresel nişin yokluğunda tek bir bağırsak kök hücresinden organoidler üretmek için bir yöntem tarif ediyoruz.

Murin Bağırsak Kriptlerinden Organoidlerin 3D Kültürlenmesi ve Organoid Araştırmaları için Tek Bir Kök Hücre

Çoğu organizmada bulunan sirkadiyen ritimler, biyolojik süreçlerin zamansal organizasyonunu düzenler. 3D organoidler son zamanlarda fizyolojik olarak ilgili bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Bu protokol, organoidlerde sirkadiyen ritimleri gözlemlemek için biyolüminesan raportörlerin kullanımını açıklar ve çok hücreli sistemlerde sirkadiyen ritimlerin in vitro olarak araştırılmasını sağlar.

Organoidlerde Biyolüminesans Raportörü ile Sirkadiyen Salınımların İzlenmesi

Bu çalışma, ince ve kalın bağırsaklardan türetilen 2D tek katmanlı domuz organoidleri oluşturmak için bir protokolün ana hatlarını çizmektedir. Bu tek tabakaların büyümesi, sağlam epitel bütünlüğünü gösteren artan TEER değerleri ile işaretlenir. Ek olarak, bu tek tabakalar, forskolin uygulamasını takiben Ussing odası deneylerinde fizyolojik salgı tepkileri sergiler.

Doğal Bağırsağın Fizyolojik Özelliklerini Yansıtan İki Boyutlu Domuz Bağırsak Organoidleri

Düşük tutarlı holotomografi kullanarak organoidlerin yüksek çözünürlüklü, etiketsiz ve üç boyutlu görüntülenmesi için adım adım bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, canlı organoidlerde yapısal dinamiklerin ve ilaç yanıtlarının gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesini sağlayan organoid kültür hazırlama, görüntüleme elde etme ve hesaplamalı görüntü analizini detaylandırır.

Düşük Tutarlı Holotomografi ile Bağırsak Organoidlerinin Etiketsiz, Yüksek Çözünürlüklü 3D Görüntüleme ve Makine Öğrenmesi Analizi

Ağrılı nöropatiler (PN) olarak nosiseptif intraepidermal sinir lifleri (IENFs) değişiklikleri incelemek için, doğrudan nosiseptif IENFs gözlenen üç boyutlu morfolojik değişiklikleri incelemek olabilir protokolleri geliştirmiştir. IENFs üç boyutlu analiz PN İESL morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için bir potansiyele sahiptir.

İnsan Cilt Biyopsiler içinde Nosiseptif İntraepidermal Sinir Elyaf üç boyutlu görüntüleme

Öğrenin, mikroelektrotlar kullanarak insan mide organoidlerinde lümen içi pH ölçümü yapmayı. Bu yöntem Helicobacter pylori enfeksiyonlarında mide fizyolojisini incelemek için güvenilir bir araç sunar.

Mikroelektrotlar Kullanılarak Üç Boyutlu Gastrointestinal Organoidlerde Luminal pH Profili Oluşturma

Daha fazla video keşfet