Name: Piroptozun Flow Sitometri ile İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T14:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 14 s
Description: Öğrenin, kuş hücrelerindeki piroptozu akış sitometresi ile nasıl tespit edeceğinizi. Çift boyama yöntemiyle chGSDME-NT ve propidyum iyodür kullanarak enfeksiyöz bursal hastalık kaynaklı hücre ölümünü analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nazik yardımı için Dr. Jue Liu'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma, Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (No. 2022YFD1800300), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 32130105) ve Modern Tarımsal Sanayi Teknolojisi Araştırma Sistemi için Tahsis Edilmiş Fon (No. CARS-40), Çin.

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Numune hücrelerinin hazırlanması
<ol><li>Kültür DF-1 (ölümsüz tavuk embriyosu fibroblastları) hücreleri, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile altı oyuklu plakalarda (kuyucuk başına 5 x 10,5 hücre) 38 ° C'de% 5 CO2 inkübatörinde% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, serum içeren hücre kültürü ortamını atın, hücreleri üç kez fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın ve ardından her oyuğa 2 mL serumsuz hücre kültürü ortamı ekleyin.</li>
	<li>Her bir oyuğa IBDV virüs solüsyonunu (hesaplanmış MOI içeren) ekleyin ve virüs solüsyonununkine eşit DMEM hacmini ekleyerek sahte enfekte olmuş bir kontrol ayarlayın.</li>
	<li>1 saat virüs adsorpsiyonundan sonra, kültür ortamını atın, hücreleri PBS ile üç kez yıkayın, her oyuğa% 2 FBS ile takviye edilmiş 2 mL DMEM ekleyin ve 24 saat boyunca hücre kültürlerine devam edin.</li>
	<li>IBDV enfeksiyonundan 24 saat sonra, 1 dakika boyunca tripsin tedavisi (oyuk başına 500 μL) uygulayın ve ardından% 10 FBS (kuyu başına 2 mL) ile takviye edilmiş DMEM ile nötralize edin. Daha sonra, akış sitometrisi için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak üzere hücrelerin hasat edilmesi gerekir.</li>
	<li>Hücreleri 400 x g'da 2-8 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.</li>
	<li>Hücre peletini PBS'de yeniden süspanse edin ve tüpleri 3 saniye boyunca hafifçe girdaplayın.</li>
	<li>Hücreleri adım 1.6'da tarif edildiği gibi santrifüjleyin (2-8 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g ).</li>
	<li>Hücrelerin yıkanmasını adım 1.7 ve adım 1.8'de açıklandığı gibi tekrarlayın.</li>
	<li>Mikroskop altında bir hemositometre kullanarak hücre sayımı yapın. Daha sonra, hücreleri uygun bir hacimde akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse edin (böylece nihai hücre konsantrasyonu 1 x 107 hücre / mL olur). Süspansiyonları nazikçe girdaplayın.</li>
</ol>2. Akış sitometrisi için hücre boyama
<ol><li>Adım 1.10'dan itibaren 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüplere (12 mm × 75 mm) 100 μL tek hücreli süspansiyon ekleyin. Anti-chGSDME-NT / CT antikor boyaması için sahte ve IBDV ile enfekte olmuş hücreleri hazırlayın ve izotip kontrolü olarak normal fare IgG'yi kullanın. Bu arada, IBDV ile enfekte olmuş hücrelerle boş kontrol ve tek lekeli tüpler hazırlayın.</li>
	<li>IBDV ile enfekte olmuş ve sahte kontrol tüplerine sırasıyla Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT McAb, anti-chGSDME-CT McAb veya normal fare IgG'den (izotip kontrolü olarak) 1 μg ekleyin. Daha sonra, tüpleri 3 saniye boyunca hafifçe girdaplayın.</li>
	<li>Lekeli hücreleri 2-8 ° C'de veya karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Tüpleri her 10 dakikada bir nazikçe girdaplayın.</li>
	<li>Hücreleri 1 mL akış sitometrisi boyama tamponu ile 400 x g'da santrifüjleme ile 2-8 ° C'de 5 dakika boyunca yıkayın. Süpernatanı bir pipet kullanarak atın.</li>
	<li>Hücrelerin yıkanmasını adım 2.4'te açıklandığı gibi tekrarlayın.</li>
	<li>Peletleri 100 μL akış sitometrisi boyama tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
	<li>IBDV ile enfekte olmuş grubun ve sahte enfekte olmuş grubun hücrelerini ve ayrıca PI-tek lekeli tüpleri, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 10 μg / mL PI ile boyayın, ardından akış sitometrisi testi için 400 μL akış sitometrisi boyama tamponu ekleyin.</li>
</ol>3. Akış sitometrisi testinin yapılması
<ol><li>Cihazı başlatmak ve yazılımı başlatmak için akış sitometresini açın.</li>
	<li>Akış sitometresinin voltaj ve kompanzasyon parametrelerini ayarlamak için boş kontrol tüpünü ve ardından tek lekeli tüpleri çalıştırarak başlayın. PI ve Alexa Fluor 647 floroforlarını tespit etmek için sırasıyla 635 nm'de yayılan FL3 ve FL4 floresan kanallarını kullanın.</li>
	<li>Tüm parametreleri yapılandırdıktan sonra, tüm örnekleri sırayla çalıştırın.</li>
</ol>4. Akış sitometrisi verilerinin analizi
<ol><li>FL647 kanal histogramındaki her bir numunenin Alexa Fluor 4 boyamasını analiz edin.</li>
	<li>Her numunedeki çift pozitif hücrelerin oranını değerlendirmek için, FL3/FL4'ün dört kadranlı nokta grafiğini kullanın.</li>
	<li>İzotip kontrollü IgG/PI çift lekeli numunelere dayalı pozitif eşikler ayarlayın ve çift pozitif hücrelerin oranının %1'in altında kalmasını sağlayın. Bu yaklaşım, tüm örneklerdeki çift pozitif hücrelerin oranının ölçülmesini kolaylaştırır.</li>
</ol>

Enfeksiyöz Bursal Hastalık Virüsü ile Enfekte DF-1 Hücrelerinde Piroptozun Ölçülmesi

<ol><li>He, W. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermin+D+is+an+executor+of+pyroptosis+and+is+required+for+interleukin-1%CE%B2+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Gasdermin D is an executor of pyroptosis and is required for interleukin-1β secretion.</a> Cell Res. 25 (12), 1285-1298 (2015).</li>
<li>Kayagaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspase-11+cleaves+Gasdermin+D+for+non-canonical+inflammasome+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Caspase-11 cleaves Gasdermin D for non-canonical inflammasome signalling.</a> Nature. 526 (7575), 666-671 (2015).</li>
<li>Shi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+GSDMD+by+inflammatory+caspases+determines+pyroptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of GSDMD by inflammatory caspases determines pyroptotic cell death.</a> Nature. 526 (7575), 660-665 (2015).</li>
<li>Angosto-Bazarra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+analyses+of+the+Dasdermin+family+suggest+conserved+roles+in+infection+response+despite+loss+of+pore-forming+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolutionary analyses of the Dasdermin family suggest conserved roles in infection response despite loss of pore-forming functionality.</a> BMC Biol. 20 (1), 9(2022).</li>
<li>De Schutter, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Punching+holes+in+cellular+membranes%3A+Biology+and+evolution+of+gasdermins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Punching holes in cellular membranes: Biology and evolution of gasdermins.</a> Trends Cell Biol. 31 (6), 500-513 (2021).</li>
<li>Kovacs, S. B., Miao, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gasdermins%3A+Effectors+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gasdermins: Effectors of pyroptosis.</a> Trends Cell Biol. 27 (9), 673-684 (2017).</li>
<li>Jiang, S., Gu, H., Zhao, Y., Sun, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Teleost+gasdermin+E+is+cleaved+by+caspase+1%2C+3%2C+and+7+and+induces+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Teleost gasdermin E is cleaved by caspase 1, 3, and 7 and induces pyroptosis.</a> J Immunol. 203 (5), 1369-1382 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duck+gasdermin+E+is+a+substrate+of+caspase-3%2F-7+and+an+executioner+of+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Duck gasdermin E is a substrate of caspase-3/-7 and an executioner of pyroptosis.</a> Front Immunol. 13, 1078526(2022).</li>
<li>Müller, H., Islam, M. R., Raue, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Research+on+infectious+bursal+disease-the+past%2C+the+present+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Research on infectious bursal disease-the past, the present and the future.</a> Vet Microbiol. 97 (1), 153-165 (2003).</li>
<li>Müller, H., Scholtissek, C., Becht, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+of+infectious+bursal+disease+virus+consists+of+two+segments+of+double-stranded+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The genome of infectious bursal disease virus consists of two segments of double-stranded RNA.</a> J Virol. 31 (3), 584-589 (1979).</li>
<li>Cubas-Gaona, L. L., Diaz-Beneitez, E., Ciscar, M., Rodríguez, J. F., Rodríguez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exacerbated+apoptosis+of+cells+infected+with+infectious+bursal+disease+virus+upon+exposure+to+interferon+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Exacerbated apoptosis of cells infected with infectious bursal disease virus upon exposure to interferon alpha.</a> J Virol. 92 (11), (2018).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+chicken+microRNA-16-5p+expression+in+DF-1+cells+following+infection+with+infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+enhances+IBDV-induced+apoptosis+and+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of chicken microRNA-16-5p expression in DF-1 cells following infection with infectious bursal disease virus (IBDV) enhances IBDV-induced apoptosis and viral replication.</a> J Virol. 94 (2), e01724(2020).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+for+voltage-dependent+anion+channel+2+in+infectious+bursal+disease+virus-induced+apoptosis+in+host+cells+via+interaction+with+VP5%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Critical role for voltage-dependent anion channel 2 in infectious bursal disease virus-induced apoptosis in host cells via interaction with VP5.</a> J Virol. 86 (3), 1328-1338 (2012).</li>
<li>Rodríguez-Lecompte, J. C., Niño-Fong, R., Lopez, A., Frederick Markham, R. J., Kibenge, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+bursal+disease+virus+%28IBDV%29+induces+apoptosis+in+chicken+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Immunol+Microbiol+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Infectious bursal disease virus (IBDV) induces apoptosis in chicken B cells.</a> Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 28 (4), 321-337 (2005).</li>
<li>Wang, S., Liu, Y., Zhang, L., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+monitoring+cancer+cell+pyroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods for monitoring cancer cell pyroptosis.</a> Cancer Biol Med. 19 (4), 398-414 (2021).</li>
<li>Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+changes+during+programmed+cell+deaths%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane changes during programmed cell deaths.</a> Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyroptosis+is+driven+by+non-selective+gasdermin-d+pore+and+its+morphology+is+different+from+mlkl+channel-mediated+necroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Pyroptosis is driven by non-selective gasdermin-d pore and its morphology is different from mlkl channel-mediated necroptosis.</a> Cell Research. 26 (9), 1007-1020 (2016).</li>
</ol>

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Bu makale, enfekte olmuş hücrelerin Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT McAb ve PI ile ikili boyanması yoluyla elde edilen akış sitometrisi kullanılarak piroptozu incelemek için etkili bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, piroptozu apoptoz ve nekroz gibi diğer hücre ölümü türlerinden ayırt etmek için çeşitli hücre tiplerine de uygulanabilir.
Memelilerde 1,2,3 esas olarak Gasdermin (GSDM) D ile indüklenen plazma zarı gözenek oluşumuna bağlı olan inflamatuar bir programlanmış hücre ölümü türü olan piroptoz, geleneksel olarak LDH salınımı 6,15, morfolojik özellikler16 ve Western Blot veya IFA testleri 17 ile GSDM-NT / GSDM-CT fragmanlarının tespiti gibi yöntemlerle değerlendirilmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin hiçbiri piroptotik hücrelerin yüzdesini doğru bir şekilde ölçmez. Bu çalışma, GSDM-NT fragmanları tarafından oluşturulan piroptotik hücrelerdeki karakteristik plazma zarı gözeneklerinden, bunların belirlenmesi için akış sitometrisine dayalı bir strateji geliştirmek için yararlanmaktadır.
Hücreler chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 ve PI ile çift boyandığında ve daha sonra FL3 ve FL4 floresan kanallarında akış sitometrisi ile analiz edildiğinde, piroptoz aynı anda iki parametre ile ayırt edilebilirdi: chGSDME-NT-Alexa Fluor 647 boyama, bölünmüş chGSDME'nin N-terminal fragmanı tarafından plazma zarı gözenek oluşumunu gösterir ve PI boyaması plazma zarı yırtılmasını gösterir. Veriler, IBDV ile enfekte olmuş hücrelerdeki chGSDME-NT / PI çift pozitif hücrelerin oranının (yaklaşık% 33), sahte enfekte kontrollerden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu göstermektedir (P < 0.001).
Deneysel yöntem, doğruluğu ve güvenilirliği sağlamak için çeşitli hususlar gerektirir. İlk olarak, akış analizi için kullanılan her numune tüpü, akış analizinin hassasiyetini korumak için en az 1 x 106 hücre içermelidir. Protokoldeki çoklu yıkama adımları göz önüne alındığında, her bir tüpteki ilk hücre sayısının adım 2.1'de buna göre, örneğin 2 x 106 hücreye çıkarılması tavsiye edilir. Hücre bütünlüğünün istenmeyen şekilde bozulmasını önlemek için hücre yıkama ve aktarma işlemlerini çok dikkatli bir şekilde ele almak çok önemlidir. Ek olarak, hücre yoğunluğunun, antikor konsantrasyonunun ve işlem süresinin tümünün optimum parametre ayarlarını etkileyebileceğini unutmayın. Bu nedenle, akış sitometresinin parametrelerini ve ayarlarını belirli deneysel koşullara göre ayarlamak gerekir. Bu çalışmada kullanılan parametreler şu şekildedir: FSC AmpGain 1.40 olarak ayarlandı ve SSC voltajı 490 V olarak ayarlandı. FSC / SSC grafiğindeki kapı, sonraki FL3 / 4 kanallı analiz için tüm hücre popülasyonlarını kapsayacak şekilde ayarlandı. Floresan voltajları FL3 kanalı (PI) için 600 V ve FL4 kanalı (Alexa Fluor 647) için 600 V olarak ayarlandı. FL4 ve FL3 kanalları arasında kompanzasyon %38,0 olarak ayarlandı. Akış hızı 200 olay/sn olarak ayarlandı ve olay eşiği 10.000 olarak ayarlandı.
Yeni yaklaşımın yardımıyla, tavuklarda patojenik enfeksiyonlara karşı konakçı yanıtında GSDME aracılı piroptozun rolünün ve altta yatan mekanizmaların bu şekilde anlaşılması önemli ölçüde ilerlemiştir. Spesifik antikorların kullanılmasıyla, gözenek oluşturan chGSDME-NT'yi akış sitometrisi yoluyla inceleyebildik, piroptotik hücreleri diğerlerinden ayırt edebildik ve piroptoz geçiren hücrelerin oranının belirlenmesini kolaylaştırdık. Sonuç olarak, bu yöntem, piroptotik hücrelerin saptanmasında Western Blot veya IFA testlerine göre belirgin bir avantaj sunar.
Bununla birlikte, bu protokolün sınırlaması, IBDV ile enfekte olmuş hücrelerde tavuk GSDME'nin N-terminal fragmanının, piroptozu incelemek için deneysel bir model olarak kullanılmasında yatmaktadır. Bununla birlikte, bu çalışma, piroptozu belirlemek için akış sitometrisinin ilk başarılı kullanımını işaret etmektedir.
Özetle, piroptozu incelemek için burada açıklanan akış sitometrisi yöntemi, hem memelilerde hem de kuşlarda piroptozun arkasındaki mekanizmaları anlamamızı ilerletmek için büyük bir potansiyele sahiptir. Bu yöntem, yaşam bilimlerinde hücre ölümü araştırmalarına katkıda bulunan etkili bir araç olarak durmaktadır.

Piroptoz, esas olarak memelilerdeGasdermin (GSDM) D ile plazma zarı gözeneklerinin oluşumuna bağlı olan inflamatuar bir programlanmış hücre ölümü türüdür 1,2,3. Tavuklarda GSDMD'ningenetik eksikliği nedeniyle 4,5, tavuklarda piroptoz mekanizması belirsizliğini korumaktadır. Gasdermin ailesi, GSDMA, GSDMB, GSDMC, GSDMD, GSDME ve DFNB59 3,6 dahil olmak üzere korunmuş proteinleri içerir. Çalışmalar, teleost balıklarından ve ördeklerden elde edilen GSDME'nin, piroptotik hücre ölümünü indüklemek için kaspaz-1/3/7 veya kaspaz-3/7 ile parçalandığını bildirmiştir 7,8. Bununla birlikte, tavuklarda patojenik enfeksiyonlara karşı konakçı yanıtında GSDME aracılı piroptozun rolü hala açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir.
Enfeksiyöz bursal hastalık (İBH), İBH9'un neden olduğu akut, oldukça bulaşıcı ve immünsüpresif bir kanatlı hastalığıdır. Zarfsız iki segmentli çift sarmallı (ds) bir RNA virüsü olan IBDV, Birnaviridaeailesi 10'daki Avibirnavirus cinsine aittir. Başkaları ve laboratuvarımız tarafından yapılan önceki çalışmalar, İBH enfeksiyonunun konakçı hücrelerde farklı yolaklar yoluyla hücre ölümüne neden olduğunu göstermiştir 11,12,13,14. Önceki bulgular, İBH enfeksiyonunun litik hücre ölümünün bir göstergesi olanlaktat dehidrojenaz (LDH) salınımını tetiklediğini göstermiştir 6,15, bu da İBH enfeksiyonunun konakçı hücrelerde litik hücre ölümüne neden olduğunu düşündürmektedir. Ayrıca, veriler, IBDV ile enfekte hücrelerin, plazma zarından üflenen büyük kabarcıklarla hücre şişmesi ve propidyum iyodür (PI) boyama pozitifi dahil olmak üzere piroptotik hücre ölümünün morfolojik özelliklerini sergilediğini göstermektedir, bu da IBDV enfeksiyonunun hücrelerde piroptozu indüklediğini düşündürmektedir.
Parçalanmış GSDM'nin (GSDM-NT) N-terminal fragmanı tarafından piroptotik hücrelerde membran gözeneklerinin oluşumunun piroptozisin ayırt edici bir özelliği olduğu göz önüne alındığında, teorik olarak, piroptotik hücreler, spesifik antikorlar kullanılarak hücre zarı üzerindeki GSDM-NT'yi inceleyerek akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Kuş piroptotik hücrelerinde, tavuk Gasdermin E'nin (chGSDME-NT) N-terminal fragmanı, propidyum iyodürün (PI) DNA'dan geçmesine ve bağlanmasına izin veren zar gözenekleri oluşturur. Bu nedenle, piroptotik hücrelerin oranı akış sitometrisi kullanılarak tespit edilebilir, böylece piroptozu apoptoz ve nekroz gibi diğer hücre ölümü biçimlerinden ayırt eder. Bununla birlikte, piroptotik hücrelerin akış sitometrisi ile incelenmesi için yöntem bildirilmemiştir. Bu çalışmada, DF-1 hücreleri İBH ile enfekte edildi ve chGSDME-NT fragmanına (membrana bağlı) ve PI boyamasına karşı monoklonal antikorlar (MCAB) kullanılarak piroptotik hücrelerin incelenmesi için akış sitometrisi yapıldı. Şaşırtıcı bir şekilde, piroptotik hücreler akış sitometrisi ile etkili bir şekilde tespit edildi. Ayrıca, piroptotik hücrelerin oranı ölçülebilir. Bu bulgular piroptozu belirlemek için güçlü ve etkili bir yol sağlar.
Bu makale, IBDV ile enfekte hücrelerde piroptozu, anti-chGSDME-NT, McAb ve PI boyama kullanılarak akış sitometrisi ile incelemek için bir yöntemi açıklamaktadır. Bu yöntem aynı zamanda diğer patojenle enfekte olmuş hücrelere de genişletilebilir ve piroptozlu çeşitli hücre tiplerini incelemek için uygulanabilir ve onları diğer hücre ölümü formlarından ayırt edebilir.

<table><tbody><tr><td>5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüp (12 ve kez; 75 mm)</td><td>Corning Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu Hücre Kültürü Plakası</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 antikor etiketleme kitleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A20186</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-CT McAb</td><td>SAE Biyomedikal Teknoloji Şirketi (Zhongshan, Çin)</td> <td>EU0228</td><td></td></tr><tr><td>Anti-chGSDME-NT MCAB</td><td>SAE Biyomedikal Teknoloji Şirketi (Zhongshan, Çin)</td> <td>EU0227</td><td></td></tr><tr><td>CellQuest yazılımı</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 inkübatörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3100</td><td></td></tr><tr><td>Kriyojenik Dondurma Santrifüjü</td><td>Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)&nbsp;</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>F0193-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td>FACSCalibur</td><td></td></tr><tr><td>Akış Sitometrisi Boyama Tamponu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>Hemositometre</td><td>Qiu-jing Biyokimyasal Reaktif ve Enstrüman Şirketi (Şangay, Çin)</td><td>YX-JSB52</td><td></td></tr><tr><td>IBDV Lx suşu</td><td>IBDV Lx suşu, Pekin Tarım ve Ormancılık Akademisi, Pekin, Çin'den Dr. Jue Liu tarafından nazikçe sağlandı.</td>Ters Mikroskop Chongqing Fotoelektrik Enstrüman Şirketi XDS-1B Normal Fare IgG Santa Cruz Biyoteknoloji sc-2025 Fosfat Tampon Salin (PBS)<td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>M& C&nbsp; Gen Teknolojisi</td><td>CC017</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum İyodür (PI)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA,% 0.25</td> <td>M ve C&nbsp; Gen Teknolojisi</td><td>CC008</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks Osilatörü</td><td>MIULAB</td><td>MIX-28+</td><td></td></tr></tbody></table>

piroptozun flow sitometri ile İncelenmesi

Examination of Pyroptosis by Flow Cytometry

Piroptoz, ağırlıklı olarak parçalanmış Gasdermin (GSDM) ailesi proteinlerinden üretilen N-terminali tarafından plazma zarı gözeneklerinin oluşumu tarafından yönlendirilen inflamatuar bir programlanmış hücre ölümü türüdür. Membrana bağlı GSDM-NT'nin Western Blot ile incelenmesi piroptozu değerlendirmek için en sık kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, bu yöntemi kullanarak piroptozlu hücreleri diğer hücre ölümü formlarından ayırt etmek zordur. Bu çalışmada, Enfeksiyöz Bursal Hastalık Virüsü (IBDV) ile enfekte DF-1 hücreleri, tavuk GSDME'nin N-terminal fragmanına karşı spesifik antikorlar kullanılarak akış sitometrisi ile piroptoz geçiren hücrelerin oranını ölçmek için bir model olarak kullanıldı GSDME (chGSDME-NT) ve propidyum iyodür (PI) boyama. chGSDME-NT pozitif hücreler, Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT antikorları kullanılarak akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilirdi. Ayrıca, IBDV ile enfekte olmuş hücrelerdeki chGSDME-NT / PI çift pozitif hücrelerin oranı (yaklaşık% 33), sahte enfekte kontrollerden önemli ölçüde daha yüksekti (P < 0.001). Bu bulgular, membrana bağlı chGSDME-NT'nin akım sitometri ile incelenmesinin, hücre ölümü geçiren hücreler arasında piroptotik hücrelerin belirlenmesinde etkili bir yaklaşım olduğunu göstermektedir.

IBDV enfeksiyonu olan DF-1 hücrelerinin zarı üzerindeki chGSDME-NT, akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilir Piroptotik hücrelerin en önemli özelliklerinden biri, Gasdermin bölünmesinden oluşan GSDM-NT fragmanları ile membran gözenekleri oluşturmasıdır. Bu nedenle, piroptotik hücreler teorik olarak, spesifik antikorlar kullanılarak hücre zarları üzerindeki GSDM-NT'yi inceleyerek akış sitometrisi ile tespit edilebilir. Böylece DF-1 hücreleri İBH ile enfekte edildi ve piroptotik hücreler Alexa Fluor 647 işaretli anti-chGSDME-NT McAb ve PI boyaması kullanılarak akış sitometrisi ile incelendi. İBH enfeksiyonu sonrası akım sitometri ile önemli sayıda chGSDME-NT pozitif hücre tespit edildi (Şekil 1). Buna karşılık, sahte enfekte kontroller veya izotip kontrol IgG ile boyanmış hücreler, minimal Alexa Fluor 647 pozitif hücreler gösterdi. Bu bulgular, membrana bağlı chGSDME-NT'nin akış sitometrisi ile etkili ve spesifik tespitini göstermektedir. Bölünmüş chGSDME'nin (chGSDME-CT) C-terminal fragmanları, chGSDME-NT gibi plazma zarına translokasyon yapmak yerine sitoplazma içinde tutulduğundan, chGSDME-CT fragmanları, membran yüzey antijen boyaması kullanılarak akış sitometrisi ile zar zor tespit edilebilirdi, bu da piroptozun membrana bağlı chGSDME-NT fragmanları ile ilişkili olduğu gerçeğiyle uyumluydu.
DF-1 hücrelerindeki piroptoz, floresein etiketli anti-chGSDME-NT, MCAB ve PI ile hücrelerin ikili boyanması kullanılarak akış sitometrisi ile belirlenebilir Hücreler Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT McAb ve PI ile çift boyandığında, ardından FL3 ve FL4 floresan kanallarında akış sitometri analizi yapıldığında, piroptotik hücreler chGSDME-NT ve PI boyamanın pozitif olmasıyla belirlenebilir. Şekil 2A,B'de gösterildiği gibi, akış sitometri deneyleri ile IBDV enfeksiyonu olan önemli sayıda chGSDME-NT pozitif hücre tespit edildi ve IBDV ile enfekte hücrelerdeki chGSDME-NT / PI çift pozitif hücrelerin oranı (yaklaşık% 33), sahte enfekte kontrollerden önemli ölçüde daha yüksekti (P &lt; 0.001), bu da chGSDME-NT tarafından membran gözenekleri oluşumunu düşündürmektedir hücre zarlarının bozulması ile senkronizeydi, böylece bu IBDV ile enfekte olmuş hücrelerin piroptotik hücre ölümüne uğramasına neden oldu. Bu veriler, İBH enfeksiyonunun konak hücrelerde chGSDME aracılı piroptozu indüklediğini açıkça göstermektedir. PI tek pozitif hücreler ise IBDV enfeksiyonunun neden olduğu diğer hücre ölümü formlarını temsil edebilir. Bu nedenle, gözenek oluşturan chGSDME-NT'nin akış sitometrisi ile incelenmesi, piroptotik hücreleri diğer hücre ölümü formlarına maruz kalanlardan ayırt etmek için değerli bir yöntem sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig01.jpg"> Şekil 1: chGSDME-NT'ye bağlı hücrelerin akım sitometrisi ile incelenmesi. DF-1 hücreleri, 1 ° C'lik bir MOI'de sahte enfekte olmuş veya IBDV ile enfekte edilmiştir. Enfeksiyondan 24 saat sonra, hücreler Alexa Fluor 647 etiketli anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb veya izotip kontrol IgG ile toplandı ve boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. Akış sitometri testinde chGSDME-NT boyama pozitif, IBDV ile indüklenen piroptozlu membrana bağlı chGSDME-NT hücrelerini gösterdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66912/66912fig02.jpg"> Şekil 2: chGSDME-NT ve PI ile ikili boyama kullanılarak akım sitometrisi ile piroptozun incelenmesi. (A) Akış sitometrisi ile piroptotik hücrelerin nokta grafiği analizi. DF-1 hücreleri, 1 ° C'lik bir MOI'de IBDV ile enfekte edildi. Enfeksiyondan 24 saat sonra hücreler toplandı, Alexa Fluor 647 işaretli anti-chGSDME-NT / anti-chGSDME-CT McAb ve PI ile boyandı ve akış sitometrisi ile analiz edildi. (B) (A)'daki her gruptaki piroptotik hücrelerin yüzdesi çizildi ve istatistiksel olarak analiz edildi. İstatistiksel anlamlılığı analiz etmek için iki yönlü varyans analizi (ANOVA) kullanılmıştır. Veriler üç bağımsız deneyi temsil etti ve SD'± bir araç olarak sunuldu. ***P &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66912/66912fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Bu makale, tavuk GSDME (chGSDME-NT) ve propidyum iyodürün (PI) N-terminal fragmanına karşı antikorlarla ikili boyamadan sonra akış sitometrisi kullanılarak piroptotik hücrelerin tanımlanmasını açıklamaktadır.

Piroptozun Flow Sitometri ile İncelenmesi

Pyroptosis is an inflammatory type of programmed cell death predominantly driven by the formation of plasma membrane pores by the N-terminus generated ...

examination-of-pyroptosis-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem...

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Bu video, bir fare gözünde intravitreal doğumdan sonra floresan biyopartiküllerin mikroglial alımını ölçmek için akış sitometrisini göstermektedir. Akış sitometrisi, CD11b'yi eksprese eden canlı hücreleri tespit eder ve yeşil floresan sergileyen fagositik mikroglia hücrelerini, Ly6C eksprese eden monositler ve Ly6G eksprese eden nötrofiller dahil olmak üzere diğer miyeloid hücrelerden ayırır.

Akış Sitometrisi Kullanılarak İntravitreal Olarak Verilen Floresan Partiküllerin Mikroglial Alımının Ölçülmesi

Bağışıklık yetkili sıçanların plevra boşluğuna II-45 mezotelyoma hücrelerin nakledilmesi ile plevra malign mezotelyoma ortotopik sıçan modelinin üretimi sunulmuştur. Bir akış sitometrik yöntemi de tanımlanan bir 25 ul kan örneğinden, bu hayvanlarda, yedi immün hücre alt analiz etmek.

II-45 singenik Rat Mezotelyoma Modelinde Ortotopik Yerleştirilmesi ve Periferik Bağışıklık Hücre İzleme

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

doku homeostazında ve yetersiz fagositik fonksiyonunun korunması patolojisinde dahil olmuştur için mikrogliyal fagositoz kritiktir. Ancak, in vivo mikroglia fonksiyonunu değerlendirmede teknik olarak zordur. Biz tam izleme ve fizyolojik bir ortamda mikroglia fagositik potansiyelini ölçülmesi için basit ama güçlü bir teknik geliştirdiler.

Retina Mikroglial Fagositik Fonksiyonu değerlendirilmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt; A Akış Sitometri bazlı analiz kullamlarak

Akciğerin sağlık durumu, akciğer bronşiollerinde bulunan bağışıklık hücrelerinin türüne ve sayısına göre yansıtılır. Farelerin alt solunum yollarından yapışkan olmayan hücrelerin ve çözünür faktörlerin izolasyonunu ve çalışılmasını sağlayan bir bronkoalveolar lavaj tekniğini açıklıyoruz.

İnflamatuvar Hücre İnfiltrasyonunu İncelemek İçin Murin Akciğerlerin Bronkoalveoler Lavajı

NLRP3 inflammasome harekete geçirmek algılama floresans mikroskobu kullanarak ve etkin caspase-1 ve adaptörü, ASC için boyama hücresel olarak açıklanmaktadır. Laktat dehidrogenaz yayın tahlil pyroptotic lizis nüfus olarak algılamak için sunulmuştur. Bu teknikler birçok açıdan inflammasome biyoloji çalışmaya adapte edilebilir.

Inflammasome harekete geçirmek ve Pyroptotic hücre ölümü fare kemik iliği türevi makrofajlar içinde tespiti

Apoptoz, erken ve geç apoptotik biyobelirteçlerin akış sitometrik analizi ile karakterize edilebilir. Serviks kanseri hücre hattı SiHa, bir tezgah üstü akış sitometresi kullanılarak Actinomycin D ile tedaviden sonra apoptoz biyobelirteçleri için analiz edildi.

Aktinomisin D ile Tedavi Edilen SiHa Serviks Kanseri Hücrelerinde Apoptotik Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, balgamını tek bir hücre süspansiyonuna dağıtmak ve standart akış sitometrik platformlarındaki hücresel alt kümelerin daha sonra karakterizasyonu için etkili bir yöntemi açıklar.

Akış Sitometrisi ile Kalite Kontrollü Balgam Analizi

Lipid hidroperoksit içeriği, ferroptotik hücre ölümünün en yaygın kullanılan göstergesini temsil eder. Bu makale, ferroptoz indüksiyonu üzerine hücrelerdeki lipid hidroperoksit içeriğinin adım adım akış sitometrisi analizini göstermektedir.

Medulloblastomun Ferroptotik Fenotipinin Ortaya Çıkarılması

Öğrenin, kuş hücrelerindeki piroptozu akış sitometresi ile nasıl tespit edeceğinizi. Çift boyama yöntemiyle chGSDME-NT ve propidyum iyodür kullanarak enfeksiyöz bursal hastalık kaynaklı hücre ölümünü analiz edin.

Piroptozun Flow Sitometri ile İncelenmesi

Daha fazla video keşfet