Name: Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 4 s
Description: Öğrenin, yetişkin farelerden retinal pigment epitel hücrelerini izole etmek ve kültüre almak için basit ve hızlı bir yöntemi. Bu protokol, yüksek saflıkta RPE kültürleri elde ederek retinal hastalıkların araştırılmasına olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu yayında bildirilen araştırmalar NIH Grants R01EY018341 and R01EY019250 (CSS), NIH Grant F31EY035156 (AH) ve P30 EY011373 tarafından desteklenmiştir. Fon sağlayan kuruluşun bu araştırmanın tasarımında veya yürütülmesinde hiçbir rolü yoktu.

Bu çalışmada hayvan deneklerin kullanımı, Case Western Reserve Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS), kalsiyum içermez, magnezyum içermez, fenol kırmızısı içermez 10 mM HEPES tampon çözeltisi ile takviye ederek yıkama tamponu ortamı hazırlayın. Kullanana kadar çözeltiyi 4 ° C'de tutun.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium'unu 4.5 g/L glikoz, 1.25x GlutaMAX Takviyesi (stok konsantrasyonu 100x veya 200 mM; nihai konsantrasyon 2.5 mM L-glutamin), %10 fetal sığır serumu, %1 penisilin/streptomisin ve 1x MEM Esansiyel Olmayan Amino Asit Çözeltisi (100x) ile destekleyerek RPE ortamını hazırlayın. Kullanmadan önce, ortamı bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.</li>
</ol>2. Fare gözü çıkarma
<ol><li>IACUC onaylı bir ötenazi yöntemi kullanarak, tercihen 3 ila 14 haftalık yaşları arasında değişen fareyi ötenazi yapın (20 g fare başına 0.1 mL'de bir Ketamin / ksilazin kokteyli kullanılarak anestezi altında servikal çıkık [87.5 mg / kg Ketamin ve 12.5 mg / kg Ksilazin] bu çalışmada kullanılan yöntemdi). NOT: Genç farelerden toplanan gözler, zamanla artan retina pigmenti epitel hücresi verimini kolaylaştıracak ve ardışık geçişler için kapasiteyi artıracaktır.</li>
	<li>Fareyi, göz yukarı bakacak şekilde yan yatırın.</li>
	<li>İşaret parmağını ve başparmağını sırasıyla gözün üstüne ve altına yerleştirin. Göz küresinin dışarı çıkmasını sağlamak için gözü çevreleyen kemik yapısına hafifçe baskı uygulayın.</li>
	<li>Hafifçe açılmış makasın ucunu gözün altına sokun ve göz yuvasından ayrılana kadar bileği gözden 90° uzağa nazikçe döndürün. NOT: Gözü veya optik siniri kesmek için makası kapatmayın, çünkü bu, vizör lastiğinin diseksiyonunu daha zor hale getirecektir.</li>
	<li>Buz üzerinde tutulan bir yıkama tamponu ortamına aktarmadan önce gözü hemen %70 etanole yerleştirin ve en fazla 5 saniye boyunca yuvarlayın.</li>
	<li>Diseksiyon mikroskobu altında, her seferinde bir gözü yıkama tamponu ve ıslatılmış gazlı bez şeritleri ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın.</li>
	<li>Optik siniri cımbızla tutarak gözü stabilize edin. 3.00 mm 45° cerrahi bıçak veya 0.009" tıraş bıçağı kullanarak ora serrata seviyesinde nazikçe bir kesi yapın.</li>
	<li>Vannas makası kullanarak, makası nazikçe kesiğe sokun ve ön segment ve vitreus çıkarılıp atılana kadar ora serrata'nın çevresini kesin.</li>
	<li>RPE tabakasını rahatsız etmemeye dikkat ederek, gergin forseps kullanarak retinayı vizör lastiğinden nazikçe soyun. NOT: Retinanın çıkarılmasını kolaylaştırmak için, bir transfer pipetini yıkama tamponu ortamıyla doldurun ve retinayı nazikçe kaldırmak için vizör lastiğinin kenarlarına dikkatlice uygulayın.</li>
	<li>Son olarak, makas kullanarak optik siniri ve fazla bağ dokusunu vizör lastiğinden çıkarın. Vizör lastiğini delmemeye dikkat edin.</li>
</ol>3. Birincil RPE'nin izolasyonu
<ol><li>Vizör lastiğini 1 mL %0.25 tripsin + %0.02 EDTA içeren 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. NOT: Kültürlenebilir RPE'nin verimini artırmak için bir Tripsin-EDTA alikotuna iki vizör lastiği eklenebilir.</li>
	<li>Mikrosantrifüj tüplerini 37 °C'ye ayarlanmış bir su banyosuna aktarın ve 10 dakika inkübe edin. Her 2 dakikada bir, tüpleri su banyosundan çıkarın ve tüpün altını tezgahın üzerine 40 kez sıkıca vurun.</li>
	<li>10 dakika sonra, bir P1000 veya 2 mL serolojik pipet kullanarak en fazla 3 kez yukarı ve aşağı pipetleyerek vizör lastiğini mekanik olarak nazikçe bozun. NOT: Büyük sayfalar düzgün şekilde yapışmayacağı için RPE sayfalarının parçalanması çok önemlidir.</li>
	<li>Ayrılmış RPE tabakalarını, ancak vizör lastiğini değil, 15 mL'lik konik bir tüpte 0.5 mL fetal sığır serumu (FBS) üzerine katmanlayarak tripsini hemen nötralize edin.</li>
	<li>Ayrıca, 3 mL RPE ortamını FBS ve RPE tabakalarının katmanları üzerine damla damla katmanlayarak tripsini seyreltin.</li>
	<li>RPE'yi 340 x g'da 3 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı atın ve hücreleri 24 oyuklu bir plaka (1.9 cm2 / oyuk) veya 48 oyuklu bir plaka (0.75 cm2 / oyuk) için uygun miktarda RPE ortamında yeniden süspanse edin. NOT: RPE, yapışmayı artırmak için hücre dışı matris proteinleri, özellikle laminin, kollajen IV veya fibronektin ile kaplanmış kuyucuk plakaları üzerine kaplanabilir11. RPE ayrıca 1 mL RPE ortamında yeniden süspanse edilebilir ve saf RPE hücrelerini daha fazla izole etmek için %40'lık bir yoğunluk ayırma gradyanı üzerine katmanlanabilir. Ek olarak, plakayı 3-5 dakika boyunca 340 x g'da döndürmek hücre yapışmasınıartırabilir 13.</li>
	<li>37 ° C'de% 5 CO2'de inkübe edin.</li>
</ol>4. RPE'nin Kültürlenmesi
<ol><li>İzole RPE'yi en az 3 gün boyunca bozmayın. 72 saat sonra, eski ortamı yavaşça çıkarın ve yeni, önceden ısıtılmış ortamla değiştirin.</li>
	<li>İlk 3 günden sonra her 48 saatte bir ortamı değiştirin.</li>
	<li>Hücreler birleştiğinde,% 0.25 tripsin +% 0.02 EDTA kullanarak hücreleri geçirin ve% 2'ye düşürün NOT: Primer RPE'nin daha önce 5-7 geçişten sonra farklılaşmaya başladığı ve altıgen şeklini ve pigmentasyonunu kaybetmeye başlayacağıbildirilmiştir 14.</li>
</ol>

Kültürlenmiş Primer Murin RPE'nin Karakterizasyonu ve Morfolojik Dinamiği

<ol><li>Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retinal+pigment+epithelium+in+visual+function%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The retinal pigment epithelium in visual function.</a> Physiol Rev. 85 (3), 845-881 (2005).</li>
<li>Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakkaraju%2C+A+%22Prog+Retin+Eye+Res%22">Prog Retin Eye Res</a>. 100846, (2020).</li>
<li>Lambros, M. L., Plafker, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+the+Nrf2+anti-oxidant+transcription+factor+in+age-related+macular+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and the Nrf2 anti-oxidant transcription factor in age-related macular degeneration.</a> Adv Exp Med Biol. 854, 67-72 (2016).</li>
<li>Ferrari, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa%3A+genes+and+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa: genes and disease mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Xia, T., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+diabetic+retinopathy+on+the+barrier+functions+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of diabetic retinopathy on the barrier functions of the retinal pigment epithelium.</a> Vision Res. 139, 72-81 (2017).</li>
<li>Edwards, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+rat+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro%22%5BJournal%5D)">Culture of rat retinal pigment epithelium.</a> In Vitro. 13 (5), 301-304 (1977).</li>
<li>Mayerson, P. L., Hall, M. O., Clark, V., Abrams, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+rat+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation and culture of rat retinal pigment epithelial cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 26 (11), 1599-1609 (1985).</li>
<li>Chang, C. W., Roque, R. S., Defoe, D. M., Caldwell, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+for+isolation+and+culture+of+pigment+epithelial+cells+from+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">An improved method for isolation and culture of pigment epithelial cells from rat retina.</a> Curr Eye Res. 10 (11), 1081-1086 (1991).</li>
<li>Wang, N., Koutz, C. A., Anderson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation of retinal pigment epithelial cells from adult rats.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (1), 101-107 (1993).</li>
<li>Sakagami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+isolation+of+retinal+pigment+epithelial+cells+from+rat+eyeballs%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Res%22%5BJournal%5D)">A rapid method for isolation of retinal pigment epithelial cells from rat eyeballs.</a> Ophthalmic Res. 27 (5), 262-267 (1995).</li>
<li>Heller, J. P., Kwok, J. C., Vecino, E., Martin, K. R., Fawcett, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+isolation+and+culture+of+adult+rat+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+cells+to+study+retinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A method for the isolation and culture of adult rat retinal pigment epithelial (RPE) cells to study retinal diseases.</a> Front Cell Neurosci. 9, 449(2015).</li>
<li>Shen, J., He, J., Wang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+primary+mouse+retinal+pigment+epithelial+%28RPE%29+cells+with+Rho-Kinase+and+TGFbetaR-1%2FALK5+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Sci+Monit%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of primary mouse retinal pigment epithelial (RPE) cells with Rho-Kinase and TGFbetaR-1/ALK5 inhibitor.</a> Med Sci Monit. 23, 6132-6136 (2017).</li>
<li>Hood, E. M. S., Curcio, C., Lipinski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+cryosectioning+of+primary+porcine+retinal+pigment+epithelium+on+transwell+cell+culture+inserts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and cryosectioning of primary porcine retinal pigment epithelium on transwell cell culture inserts.</a> STAR Protoc. 3 (4), 101758(2022).</li>
<li>Naylor, A., Hopkins, A., Hudson, N., Campbell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+Junctions+of+the+outer+blood+retina+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Tight Junctions of the outer blood retina barrier.</a> Int J Mol Sci. 21 (1), 211(2019).</li>
<li>Ban, B., Rizzolo, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+culture+model+of+development+reveals+multiple+properties+of+RPE+tight+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">A culture model of development reveals multiple properties of RPE tight junctions.</a> Mol Vis. 3, 18(1997).</li>
<li>Fernandez-Godino, R., Garland, D. L., Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture+and+characterization+of+primary+mouse+RPE+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture and characterization of primary mouse RPE cells.</a> Nat Protoc. 11 (7), 1206-1218 (2016).</li>
<li>Yang, S., Zhou, J., Dengwen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functions+and+diseases+of+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Functions and diseases of the retinal pigment epithelium.</a> Front Pharmacol. 12, 727870(2021).</li>
</ol>

İlgili finansal veya finansal olmayan açıklama yoktur.

Bu yazıda, murin retinal pigment epitelinin izolasyonu ve kültürü için basitleştirilmiş bir protokol özetledik. Yetişkin farelerin gözlerinden izole edilen RPE hücreleri, RPE'ye özgü bir belirteç olan RPE65 ve hücreler arası bir bağlantı belirteci olan ZO-1'i eksprese etti. Ek olarak, kültürlenmiş hücreler kültürde pigmentli, altıgen tabakalar halinde gelişti.
Kemirgenlerde RPE'nin izolasyonu için çeşitli yöntemler daha önce yayınlanmıştır 6,7,8,9,10,11,12. Birçok protokol, teknik beceri gerektiren ve RPE hasarı veya hücre ölümü riskini artıranBruch zarından RPE katmanlarını soyar 6,7,9,11,12,16. Bu nedenle, bu protokol, kültürde RPE tabakalarının bütünlüğünü korumak ve hayatta kalmayı teşvik etmek için mekanik ayrışma yerine RPE tabakasının enzimatik ayrılmasını kullanır. Bu yöntem, sıkı bağlantı proteinlerinin ekspresyonunu koruyan yüksek pigmentli ve altıgen şekilli hücrelerle RPE morfolojisini koruyan bir kültürde fare RPE'si verir. Ek olarak, bu protokol, geçirgen membran ekleri, ek hücre dışı matris kaplama proteinleri veya özel doku ayrışma reaktifleri gibi diğer protokollerde kullanılan karmaşık reaktiflerin veya malzemelerin kullanımından yoksundur. Bunun yerine, bu protokol, RPE tabakasını Bruch zarından ayırmak için doku ajitasyonu ile kombinasyon halinde %0.25 Tripsin-EDTA kullanarak basit enzimatik sindirim kullanır. Bu protokol 3 ila 14 haftalık farelerde başarıyla gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, genç farelerde başarılı bir şekilde birleşik bir kültür elde etmek için daha fazla göze ihtiyaç duyulabilir.
Bu protokolün yürütülmesi sırasında çeşitli zorluklar ortaya çıkabilir. Ora serrata'nın etrafını hassas bir şekilde kesmek ve RPE tabakasını bozmadan retinayı dikkatlice çıkarmak için teknik beceri gereklidir. Skleranın çevresini keserken retina bozulabilir ve bu da RPE canlılığını değiştirebilir. Bu tekniğin iyileştirilmesi ancak tekrarlayan, sürekli uygulama ile gerçekleştirilebilir. Ek olarak, RPE tabakaları çıkarıldıktan sonra retina tabakasına bağlı kalabilir. Aşırı RPE kaybını önlemek için, retinanın kenarlarını vizör lastiğinden nazikçe kaldırmak için yıkama tamponu ortamıyla doldurulmuş bir şırınga veya transfer pipeti kullanarak retina dekolmanını uyarın. Hyaluronidaz inkübasyonu da dekolmanıkolaylaştırabilir 16. RPE'nin Bruch zarından ve koroidden düzgün bir şekilde ayrılmaması durumunda, su banyosunda tripsin ile inkübasyon süresini artırın. Ek olarak, taze tripsinin alikotlarını -20 ° C'de dondurun ve optimum enzimatik aktiviteyi korumak için kullanmadan önce doğrudan çözdürün. İzolasyondan sonra RPE'nin kuyu plakasına bağlanamaması, hücreler çok düşük bir yoğunlukta ekilirse veya RPE izolasyon işlemi sırasında hasar görürse ortaya çıkabilir. Ek olarak, protokolümüz kültür için hücre dışı matris (ECM) proteinlerinin kaplanmasını gerektirmez. Bununla birlikte, fibronektin, kollajen IV, laminin veya kollajen I gibi ECM proteinlerinin hücre bağlanmasını arttırdığı gösterilmiştir ve uyum zayıfsa dikkate alınmalıdır11.
RPE ile kültürlenmiş tek tabakaların verimini artırmak için, aynı genetik geçmişe sahip yaşa uygun farelerin en az 2-3 gözünü bir araya getirin; Hücreler, yeterince yüksek yoğunlukta tohumlanmazlarsa zamanla altıgen şekillerini ve pigmentlerini kaybedebilirler. 8 haftalıktan büyük fareler için, optimal birleşme için 24 oyuklu plaka başına 2 göz yeterli olmalıdır. Fareler 8 haftalıktan küçükse, 3-4 göz daha iyi yapışma ve birleşme ile sonuçlanacaktır. Zamanla, hücreler pigmentasyon kaybı ve uzun bir şekil elde etme ile epitelyal-mezenkimal geçişe (EMT) duyarlı olabilir. Sırasıyla Y27632 ve Repsox gibi Rho-Kinaz ve TGFβR-1 / ALK5 inhibitörlerinin eklenmesi, kültürlenmiş RPE hücrelerinin12 EMT'sini önleyebilir. İzolasyon protokolü kısa olmakla birlikte, 2-4 gözün izolasyonu için sadece 1 saat gerektirse de, birincil kültürün tam birleşmeye ulaşması 7-10 gün kadar sürebilir. Ek olarak, RPE'nin geçirilmesi sınırlıdır ve sonraki her geçişte EMT riski artar.
Retina pigment epitel hücreleri, gözdeki homeostazı korumak için kritik hücrelerdir. RPE, fotoreseptörlerin bakımına yardımcı olmak, nöral katmanların ışık hasarını önlemek ve taşımayı düzenlemek için sıkı bir epitel bariyeri görevi görmek için fagositler görevi görür17. Yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi RPE'yi doğrudan etkileyen hastalıklar iltihabı şiddetlendirebilir, apoptozu artırabilir ve hücresel bağlantıları bozarak retina dejenerasyonu ve körlük olasılığının artmasına neden olabilir17. Primer RPE'nin yetiştirilmesi, RPE'yi etkileyen oküler hastalıkların patogenezinin incelenmesini kolaylaştırır. Sonuç olarak, protokolümüz izolasyon süresini kısaltır ve yüksek saflıkta hücre kültürünü korurken gerekli teknikleri ve reaktifleri basitleştirir.

Retina pigment epiteli (RPE), fotoreseptörler ve koroid1 arasında bulunan Bruch zarını kaplayan özel bir hücre tek tabakasıdır. RPE hücreleri, retinanın düzgün çalışmasında kritik bir rol oynar. RPE hücreleri, glikoz ve A vitaminini fotoreseptörlere taşır, all-trans retinalin 11-cis retinal içine yeniden izomerizasyonu ile görüşü teşvik eder ve dökülen dış segmentlerin fagositozu yoluyla fotoreseptörün dış segmentlerini korur, subretinal boşluktan suyu uzaklaştırır, sıkı bağlantıların varlığı yoluyla dış kan-retina bariyerini oluşturur ve nörotropik büyüme faktörleri salgılar (Pigment Epitel Türetilmiş Faktör gibi, ve Temel Fibroblast Büyüme Faktörü) fotoreseptörleri destekleyen2. RPE hücrelerinin disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati dahil olmak üzere çeşitli retinopatilerin patogenezinde rol oynar 3,4,5. RPE hücrelerini kullanan in vitro çalışmalar, bu hastalıkların patogenezini daha iyi anlamamız için kritik öneme sahiptir. Primer RPE hücreleri bu çalışmalar için daha çok tercih edilir, çünkü RPE hücre hatları hazır bulunmakla birlikte, primer RPE hücrelerinin temel özelliklerinden yoksundur.
Primer RPE hücrelerinin kaynağı olarak çeşitli türler kullanılırken, fareler retinopatilerin patogenezini anlamaya yardımcı olmak için genetik modifikasyonları kullanma avantajına sahiptir. RPE hücrelerini kemirgenlerden izole etmek için daha önce tarif edilen protokoller ya yenidoğan hayvanların kullanılmasını gerektirir, uzundur, teknik beceri gerektirir ya da kültür 6,7,8,9,10,11,12 için uygun değildir. RPE hücrelerini, bu hücrelerin oldukça saf kültürlerini veren yetişkin farelerden izole etmek için basit ve hızlı bir yöntem açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>0.009 RD Tek Kenarlı Bıçaklar</td><td>Personna</td><td>941202</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'nun Modifiye Eagle's Medium (DMEM)</td> <td>Corning</td><td>10-013-CV</td>, <td>4.5 g/L glikoz, L-glutamin, sodyum piruvat ile</td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Corning</td><td>35010CV</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100x</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi</td><td>Gibco</td><td>14175095</td><td>Kalsiyum yok, magnezyum yok, fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>yok HEPES Tampon Çözeltisi (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>MEM Esansiyel Olmayan Amino Asitler, 100x</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Mikro-Unitome Bıçağı</td><td>BVI Kunduz</td><td>377546</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin Çözeltisi, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Polistiren Mikroplakalar</td><td>Falcon</td><td>08-772-1</td><td>24 kuyulu veya 48 oyuklu</td></tr><tr><td>Düzenli Fetal Sığır Serumu</td><td>Corning</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>Gibco</td><td>25200056</td><td>fenol kırmızısı</td></tr><tr><td>Vannas makas</td><td>ile Güzel Bilim Araçları</td><td>10091-12</td><td></td></tr></tbody></table>

yetişkin farelerden retinal pigment epitel hücrelerinin İzolasyonu ve kültürü için basitleştirilmiş bir yöntem

A Simplified Method for Isolation and Culture of Retinal Pigment Epithelial Cells from Adult Mice

Retina pigment epitel hücreleri (RPE), retinanın düzgün çalışması için kritik öneme sahiptir. RPE disfonksiyonu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu, retinitis pigmentosa ve diyabetik retinopati gibi önemli retina hastalıklarının patogenezinde rol oynar. RPE'nin murin yetişkin gözlerinden izolasyonu için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunuyoruz. Daha önce bildirilen yöntemlerin aksine, bu yaklaşım yetişkin farelerden yüksek saflıkta RPE'nin izolasyonunu ve kültürünü mümkün kılar. Bu basit ve hızlı yöntem, kapsamlı teknik beceri gerektirmez ve temel bilimsel araçlar ve reaktiflerle elde edilebilir. Primer RPE, 3 ila 14 haftalık C57BL/6 arka plan farelerinden gözün enükleasyonu ve ardından ön segmentin çıkarılması ile izole edilir. Enzimatik tripsinizasyon ve santrifüjleme, RPE'yi vizör lastiğinden ayırmak ve izole etmek için kullanılır. Sonuç olarak, bu yaklaşım, retina fonksiyonu ve hastalığı çalışmasında RPE'nin kullanımı için hızlı ve etkili bir protokol sunmaktadır.

Açıklanan protokol C57BL/6 arka plan farelerinde kullanılmıştır. Cinsiyet, RPE'yi kültürleme yeteneğini değiştirmiyor gibi görünmektedir. 6 haftadan küçük fareler, yaşlı farelere kıyasla sınırlı RPE tabakaları verir ve optimal birleşmeye ulaşmak için daha fazla göze ihtiyaç duyulabilir. İzolasyonu takiben, RPE hücrelerinin stabilize olması ve hücre kültürü plakasına bağlanması yaklaşık 3 gün sürer. İzolasyondan yaklaşık 24 saat sonra, anükleat gibi görünen yuvarlak, pigmentli hücreler yerleşmeye başlamış ancak plakaya tam olarak yapışmamıştır (Şekil 1A). Sonraki 48-72 saat boyunca, hücreler koyu pigmentasyonlarını ve şeffaf çekirdeklerini korurken bağlanmaya ve yayılmaya başlar (Şekil 1B,C). 5 gün sonra, RPE birleşmeyi artırmış ve altıgen şekilli polarize bir tek tabakayı anımsatan hücreden hücreye temaslar oluşturmaya başlamıştır (Şekil 1D).
İzole RPE, kültürde 6 gün sonra saflık ve sıkı bağlantı bütünlüğü açısından değerlendirildi. RPE ilk olarak RPE'ye özgü bir belirteç olan retinoid izomerohidrolaz veya retina pigment epiteli 65 kDA proteini (RPE65) varlığı açısından değerlendirildi (Şekil 2, yeşil). Ek olarak, RPE'nin pigmentli ve altıgen şekilli hücrelerden oluşan tek bir katman oluşturması için hücreden hücreye bağlantıların bozulmadan kalması gerekir. Sıkı bağlantı proteini-1 veya zonula oklüdens-1 (ZO-1), tek tek RPE hücreleri14 arasındaki sıkı bağlantıların korunması ve bütünlüğü için hayati önem taşıyan iskele proteinleridir. Birleştirilmiş izole RPE kültürleri, hücrenin çevresinde bulunan ZO-1'in boyanmasıyla gösterilen hücreler arası bağlantı proteinlerini korudu (Şekil 2, kırmızı). Bu hücreler büyük tabakalar halinde birleştiklerinde, 2 haftaya kadar aşırı büyümeden hücreden hücreye temasları sürdürürler. Önceki çalışmalar, ZO-1'in kültürde 9 güne kadar yüksek oranda eksprese edildiğini göstermiştir15. Primer RPE kültürlerinde kullanılan ek belirteçler arasında Kollajen IV, CRALBP ve OTX211 bulunur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig01.jpg"> Şekil 1. Standart polistiren 24 oyuklu plaka üzerinde kültürlenmiş fare birincil RPE'nin morfolojisi. (A) Bir C57BL / 6 faresinin her iki gözünden izole edilen ve izolasyondan hemen sonra kaplanmamış bir doku kültürü polistiren 24 oyuklu plakanın tek bir oyuğunda kültürlenen birincil RPE. (B,C) 48 saat ve 72 saat sonra, birincil RPE plakaya yapışmaya başlar ve pigmentli, iki çekirdekli hücreler oluşturur. (D) 5 gün sonra, parlak alan mikroskobu, hiperpigmente, altıgen şekilli hücrelerin birleşmeyi artırdığını ve hücreden hücreye temas oluşturmaya başladığını gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig02.jpg"> Şekil 2. RPE'ye özgü belirteç, RPE-65 ve hücreler arası bağlantı belirteci, ZO-1, izole primer murin RPE'de korunur. Üç C57BL / 6 fareden elde edilen birincil RPE, fiksasyondan önce 6 gün boyunca% 4 paraformaldehit ile kültürlendi. Hücreler 5 dakika boyunca PBS'de% 0.1 Triton-X ile geçirgenleştirildi,% 5 normal keçi serumu ile bloke edildi ve% 65 (yeşil) veya ZO-1'e (kırmızı) karşı antikorlarla inkübe edildi. Ölçek çubuğu: 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66921/66921fig03.jpg"> Şekil 3. Retina pigment epitel izolasyon protokolünün basitleştirilmiş şematik gösterimi. Göz küresini fareden çıkardıktan sonra, yıkama tamponuna geçmeden önce kısa bir süreliğine p etanole batırarak gözü sterilize edin. Yıkama tamponunda, ora serrata boyunca kesin ve ön segmenti çıkarın. Retinayı çıkarın ve vizör lastiğini Tripsin/EDTA içeren bir tüpe yerleştirin. Tüpü toplam 10 dakika boyunca her 2 dakikada bir tezgahın üzerine hafifçe vurun, süpernatanı 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve RPE peletini santrifüjleyin. Hücreleri ve plakayı 24 veya 48 oyuklu bir plakaya yeniden süspanse edin. BioRender kullanılarak oluşturulan grafikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66921/66921fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Retinal pigment epithelial cells (RPE) are critical for the proper function of the retina. RPE dysfunction is involved in the pathogenesis of important ...

a-simplified-method-for-isolation-culture-retinal-pigment-epithelial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, siliyer epitelden fare gözün retina kök hücreleri izole kültür ve klonal retina küreler oluşturacak şekilde büyümeye nasıl göstereceğiz. Izole edilmiş kök hücre küre kardinal özelliklere sahip: kendini yenileme ve multipotentiality.

Fare Göz Retina Kök Hücre İzolasyonu

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Retina pigment epiteli (RPE) çok fonksiyonlu bir epitel göz olduğunu. Burada bir iletişim kuralı fare RPE türetilmiş birincil hücre kültürleri kurmak için mevcut.

Fare retina Pigment epiteli birincil hücre kültürleri

Protokol, fare nöroretinasınınorganotipik eksplantlarını açıklar Retina pigment epiteliyle (RPE) birlikte yetiştirilen, R16 tanımlı ortamda, serum ve antibiyotik içermez. Bu yöntemin in vivo deneylere kıyasla gerçekleştirilmesi nispeten basit, daha az pahalı ve zaman alıcıdır ve çok sayıda deneysel uygulamaya uyarlanabilir.

Sağlam Retina Pigment Epitel ile Organotipik Fare Retina Eksplantlarının Uzun Süreli, Serumsuz Ekimi

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu protokol, protein analizi için murin çubuk fotoreseptörlerinin hücre altı bölmelerini izole etmek için iki teknik sunar. İlk yöntem, çubuk dış segmentlerini ayırmak için canlı retina ve selüloz filtre kağıdı kullanırken, ikincisi çubuk iç ve dış segment katmanlarını soymak için liyofilize retina ve yapışkan bant kullanır.

Protein Analizi için Fare Retinasındaki Fotoreseptör Hücre Bölmelerinin İzolasyonu İçin İki Peeling Yöntemi

Bu protokol, hücre verimi, saflığı ve canlılığı için optimize edilmiş murin doğum sonrası retinal endotel hücrelerinin izolasyonu için bir yöntemi açıklar. Bu hücreler yeni nesil dizileme yaklaşımları için uygundur.

Yeni Nesil Dizileme için Murin Retinal Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu yazıda retinal pigmente epitel (RPE) hücrelerinin fare gözlerinden kademeli olarak izole edilmesi için basitleştirilmiş bir protokol anlatılmaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonunu ve diseksiyonunu, ardından RPE hücrelerinin izolasyonunu, tohumlanmasını ve kültürlenmesini içerir.

Primer Fare Retinal Pigmentli Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Retinal pigment epitel (RPE) hücrelerinin hücrelerini genç pigmentli kobayların gözlerinden izole etmek için basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Bu prosedür, gen ekspresyon analizleri de dahil olmak üzere izole RPE üzerinde moleküler biyoloji çalışmalarının izlenmesine izin verir.

Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin Guinea Pig Gözlerinden İzolasyonu

Bu el yazması, fare gözlerinden retinal glial Müller hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokolü açıklamaktadır. Protokol, fare gözlerinin enükleasyonu ve diseksiyonu ile başlar, ardından Müller hücrelerinin izolasyonu, tohumlanması ve kültürlenmesi ile devam eder.

Primer Fare Retinal Glial Müller Hücrelerinin İzolasyonu

Bu makale, neonatal Sprague-Dawley (SD) sıçanlarından primer retinal Müller hücrelerinin izole edilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Prosedür, göz kürelerinin enükleasyonunu, retina dokusunun diseksiyonunu, hücrelerin çıkarılmasını ve tanımlanmasını ve sonraki hücre kültürü için temel hususları içerir.

Sprague-Dawley (SD) Sıçanlarından Primer Retinal Müller Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Öğrenin, yetişkin farelerden retinal pigment epitel hücrelerini izole etmek ve kültüre almak için basit ve hızlı bir yöntemi. Bu protokol, yüksek saflıkta RPE kültürleri elde ederek retinal hastalıkların araştırılmasına olanak tanır.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Daha fazla video keşfet