Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

T hücreleri, vücudumuzu bulaşıcı hastalıklardan ve kanserden koruyan bağışıklık hücreleridir. Timus, T hücreleri üreten ve gelişmekte olan T hücrelerini vücudun kendi bileşenlerine göre seçen bir organdır. Timusun vücudumuza koruyucu olan ve yine de vücuda toleranslı olan T hücrelerini nasıl ürettiği ve seçtiği ile ilgileniyoruz.

Laboratuvarımız, timusta T hücrelerinin üretiminde ve seçiminde anahtar rol oynayan timik epitel hücrelerinin analizine katkıda bulunmuştur. Timik epitel hücrelerinin tek hücre düzeyinde analizi, T hücresi gelişimi ve seçiminin moleküler mekanizmasını daha iyi anlamamıza yardımcı olmuştur. Timik epitel hücreleri, karmaşık yapılarla oldukça çeşitlidir ve bu da izolasyonlarını zorlaştırır.

Tek hücreli süspansiyonları izole etmek için mevcut teknoloji sınırlıdır ve iyileştirilmesi gerekmektedir. Buna rağmen, timik epitel hücrelerinin tek hücre izolasyonu, gelişimleri ve işlevlerinde yer alan moleküler mekanizmaları anlamamızı geliştirir. Çalışmamızın bağışıklık hücresi oluşumu ve yenilenmesinin anlaşılmasına katkıda bulunacağını umuyoruz.

İnsan sağlığını geliştirmek için önemli bir mihenk taşı olarak hizmet edeceğine inanıyoruz. Timusu fareden topladıktan sonra, buz üzerinde 60 milimetrelik plastik bir tabağa 10 milimolar HEPES içeren beş mililitre RPMI 1640'a koyun. Diseksiyon mikroskobu altında, kan, timus olmayan ve yağ dokularını çıkarmak için kavisli ince uçlu cımbız kullanın.

Timusu diseksiyon makası ile küçük parçalar halinde kesin. Timus parçalarını, mililitre başına üç mililitre bir miligram Kollajenaz ve Dispas içeren 15 mililitrelik bir tüpe ve %2 FBS içeren RPMI 1640'ta mililitre DNaz başına bir birim içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Tüpü 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede bir su banyosunda inkübe edin.

Daha sonra süspansiyonu üç mililitrelik bir plastik transfer pipeti kullanarak karıştırın ve yaklaşık 30 dakika veya doku parçaları görülmeyene kadar inkübe etmeye devam edin. % 1 FBS içeren HBSS'ye beş mililitre beş milimolar EDTA ekleyin. Hücre süspansiyonunu 60 mikronluk bir naylon ağdan 50 mililitrelik yeni bir tüpe süzün.

Süspansiyonu 350G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve peleti 10 mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin. Yenidoğan bir fareden timusu aldıktan sonra, kan, timus dışı ve yağ dokularını çıkarmak için kavisli ince uçlu cımbız kullanın.

Timusu 10 milimolar HEPES içeren 0,2 mililitre RPMI 1640 içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın. 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, ortamı atın, ardından mililitre başına 0,5 mililitre 0,5 miligram Kollajenaz ve Dispas ve %2 FBS içeren RPMI 1640'ta mililitre Dnase başına bir birim ekleyin. Tüpü 37 santigrat derecede bir ısı bloğunda inkübe edin.

Kuluçka sırasında, bir mililitrelik bir pipet kullanarak hafifçe karıştırın. 10 dakika sonra,% 1 FBS içeren HBSS'ye 0,5 mililitre beş milimolar EDTA ekleyin. Hücre süspansiyonunu 60 mikronluk bir naylon ağdan 15 mililitrelik yeni bir konik tüpe süzün.

Tüpe 10 milimolar HEPES içeren dokuz mililitre RPMI 1640 ekleyin. Hücre süspansiyonunu 350G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve peleti bir ila üç mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.

Başlamak için, beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpte 6 yenidoğan veya doğum sonrası fare timus hücresinin gücüne 16 kez 10 ekleyin. Hücre süspansiyonunu 350G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre peletini FACS tamponunda 10 mikrolitre anti-FC reseptör monoklonal antikor çalışma konsantrasyonunda yeniden süspanse edin.

Tüpü beş dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. FACS tamponuna 40 mikrolitre anti-CD45 monoklonal antikor, anti-EpCAM monoklonal antikor, anti-Ly-51 monoklonal antikor ve UEA-1 ekleyin. Bir tüpün içeriğini karıştırın ve 45 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, iki mililitre FACS tamponu ekleyin. Hücre süspansiyonunu 350G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin ve peleti bir mikrolitre Hayalet Boya menekşe 510 çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bir tüpün içeriğini karıştırın ve 30 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Şimdi iki mililitre FACS tamponu ekleyin ve hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bir mililitre% 2 paraform aldehit ile sabitlemeden önce hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Tüpe 3,5 mililitre PBS ekleyin. Hücre süspansiyonunu 700G'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüjleyin ve hücreleri bir mililitre hücre içi fiksasyon ve geçirgenlik tamponu ile geçirgen hale getirin.

Bir tüpün içeriğini karıştırın ve 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin ve bir mililitre geçirgenlik tamponu ekleyin. Yine, anti-beta5t antikoru veya anti-CCL21 antikorunun çalışma konsantrasyonlarının her birine 100 mikrolitre eklemeden önce süspansiyonu santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. Bir mililitre geçirgenlik tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 700G'de dört santigrat derecede sekiz dakika santrifüjleyin. Şimdi 100 mikrolitre anti-tavşan IgG çalışma konsantrasyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

Geçirgenlik tamponu ekledikten sonra, hücre süspansiyonunu santrifüjleyin. Hücre peletini 200 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın. Akış sitometrik analizinden önce hücre süspansiyonunu 60 mikron naylon ağdan süzün.

Sıfırıncı günlük farelerden ve iki haftalık farelerden alınan Kollajenaz ve Dispas sindirilmiş timus hücrelerinin akış sitometrik profilleri, partikül sinyallerin %90'ından fazlasının canlı hücreleri temsil ettiğini gösterdi. Canlı hücrelerin floresan sinyalleri CD45 ve EpCAM ile temsil edildi. Yenidoğan evrelerinde, cTEC'ler mTEC'lerden daha sıktı, ancak doğum sonrası, düşük cTEC serbestleşme etkinliği nedeniyle mTEC'ler baskındı.

Hücrelerin fiksasyonu ve geçirgenliği, TEC'ler içindeki hücre içi moleküllerin saptanmasını sağlar. Beta5t ekspresyonu cTEC'lerin çoğunda tespit edildi, ancak mTEC'lerde tespit edilmedi. CCL21, mTEC'lerin bir kısmında tespit edildi, ancak cTEC'lerde tespit edilmedi.

Karşılaştırıldığında, hava, mTEC'lerin bir alt popülasyonunda ifade edildi.