Name: Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Öğrenin fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyon hazırlama ve akış sitometri analizi yöntemlerini. Bu protokol T-hücre gelişimi ve seçilim mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Makaleyi okuduğu için Dr. Izumi Ohigashi'ye teşekkür ederiz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kanser Enstitüsü ve Kanser Araştırma Merkezi 011806 Intramural Araştırma Programı ZIA BC tarafından desteklenmiştir.

Tüm fare deneyleri, Ulusal Kanser Enstitüsü Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (ASP21-431, ASP21-432 ve EIB-076-3) onayı altında gerçekleştirilmiştir.
1. Timus hücresi süspansiyonunun hazırlanması
NOT: Fare ontogenezi, TEC'lerin timustan enzimatik serbestleşmesinin etkinliğini etkiler. Fare yaşına bağlı olarak üç yöntem aşağıdaki gibi tarif edilmiştir.
<ol>
	<li>3 haftadan eski doğum sonrası fareler için
	<ol>
		<li>Bir fareden timusu (iki timus lobu) hasat edin. Timusu buz üzerinde 60 mm'lik plastik bir tabağa 10 mM HEPES içeren 5 mL RPMI1640 koyun.</li>
		<li>Kanı, timus olmayan dokuları ve yağları diseksiyon mikroskobu altında kavisli ince uçlu cımbızla çıkarın. Timusu diseksiyon makası ile küçük parçalar halinde (yaklaşık 1-2 mm boyutunda) kesin.</li>
		<li>Timus parçalarını% 2 fetal sığır serumu (FBS) içeren RPMI1640 içinde 3 mL 1 mg / mL Kollajenaz / Dispas ve 1 U / mL DNaz çözeltisi içeren 15 mL konik bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 20 dakika inkübe edin.</li>
		<li>3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. Doku parçalarının hala görünür olması durumunda 20 dakika daha inkübe edin.</li>
		<li>3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. Doku parçalarının hala görünür olması durumunda 10 dakika daha inkübe edin.</li>
		<li>3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak hafifçe karıştırın. % 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 5 mL 5 mM EDTA ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. Hücre süspansiyonunu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
		<li>Hücre peletini 10 mL FACS tamponunda (% 1 sığır serum albümini [BSA] ve% 0.1 NaN3 içeren 1x HBSS) yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>1 ila 2 haftalık yenidoğan fareler için
	<ol>
		<li>Adım 1.1.1'i gerçekleştirin.</li>
		<li>Diseksiyon mikroskobu altında diseksiyon cımbızıyla kan ve timus olmayan dokuları çıkarın. Timusu 10 mM HEPES ile 200 μL RPMI1640 içeren 1,5 mL'lik plastik bir tüpe aktarın ve timusu diseksiyon makası ile küçük parçalar halinde (yaklaşık 1-2 mm boyutunda) kesin.</li>
		<li>Timus parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin, ardından süspansiyonu 200 μL'lik bir mikropipetle nazikçe çıkarın.</li>
		<li>Timus parçalarını% 2 FBS içeren RPMI1640 içinde 2 mL 0.5 mg / mL Kollajenaz / Dispas ve 1 U / mL DNaz çözeltisi içeren 5 mL polipropilen yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin.</li>
		<li>3 mL'lik bir plastik transfer pipeti kullanarak nazikçe karıştırın ve ardından daha fazla homojenizasyon için plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet ile karıştırın.</li>
		<li>% 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 2 mL 5 mM EDTA ekleyin. Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan ve 50 mL'lik bir konik tüpe süzün. 10 mM HEPES içeren 16 mL RPMI1640 ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 350 × g sıcaklıkta 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini 10 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Embriyonik fareler ve 1 haftaya kadar olan yenidoğan fareler için
	<ol>
		<li>Bir fareden timusu (iki timus lobu) hasat edin. Timusu 60 mm'lik plastik bir tabağa koyun ve kanı, timus olmayan dokuları ve yağları diseksiyon mikroskobu altında kavisli ince uçlu cımbızla alın.</li>
		<li>Timusu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne 10 mM HEPES içeren 0,2 mL RPMI1640 yerleştirin. Sıvıyı 200 μL'lik bir mikropipet ile atın.</li>
		<li>% 2 FBS içeren RPMI1640 0.5 mL 0.5 mg / mL Kollajenaz / Dispas ve 1 U / mL DNaz çözeltisi ekleyin. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 10 dakika inkübe edin. Plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak nazikçe karıştırın.</li>
		<li>% 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 0,5 mL 5 mM EDTA ekleyin. Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan geçirin ve 15 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. 10 mM HEPES içeren 9 mL RPMI1640 ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücre peletini 1-3 mL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatif yöntem: Liberaz sindirimi
	<ol>
		<li>1.1.1 ve 1.1.2 adımlarını gerçekleştirin.</li>
		<li>Timus parçalarının tüpün dibine yerleşmesine izin verin; daha sonra süspansiyonu 200 μL'lik bir mikropipet ile nazikçe çıkarın. Timus parçalarını 1 mL 0.5 U/mL Liberaz ve 10 mM HEPES içeren RPMI1640 1 U/mL DNaz içeren 5 mL'lik bir tüpe aktarın. Bir su banyosunda veya 37 ° C'de bir ısı bloğunda 15 dakika inkübe edin.</li>
		<li>Plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak nazikçe karıştırın. Doku parçalarının hala görünür olması durumunda 15 dakika daha inkübe edin.</li>
		<li>Plastik uçlu 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak nazikçe karıştırın. % 1 FBS içeren 1x HBSS'ye 1 mL 5 mM EDTA ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 60 μm'lik bir naylon ağdan ve 50 mL'lik yeni bir konik tüpe süzün. 10 mM HEPES içeren 18 mL RPMI1640 ekleyin.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 350 × g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 10 mL FACS tamponunda (% 1 BSA ve% 0.1 NaN3 içeren 1x HBSS) yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Hücreleri buz üzerinde saklayın ve bir hücre sayacı kullanarak hücre numaralarını belirleyin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Timus hücrelerinin antikor boyaması
<ol>
	<li>16 × 106 hücreyi 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe yerleştirin. Hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Boyama IgG'nin hücre yüzeyi Fc reseptörüne spesifik olmayan bağlanmasını bloke etmek için FACS tamponuna 10 μL anti-Fc reseptörü monoklonal antikor (mAb, klon 2.4G2) ekleyin. 4 °C'de 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Anti-CD45 mAb (hematopoietik hücreye özgü; örneğin, BV421 etiketli), anti-EpCAM mAb (epitel hücresine özgü; örneğin, PE-Cy7 etiketli), anti-Ly51 mAb (cTEC algılama; örneğin, AF647 etiketli) ve Ulex europaeus aglütinin I (UEA-1) (mTEC algılama; örneğin, AF594 etiketli) çalışma konsantrasyonlarının her birine 40 μL ekleyin. Paralel olarak, bir akış sitometresi kurmak için tek renkli lekeli hücreler ve lekesiz hücreler için tüpler hazırlayın.</li>
	<li>4 ° C'de 45 dakika inkübe edin. Her 10 dakikada bir iyice karıştırın. 2 mL FACS tamponu ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 350 × g 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>1 μL Ghost Dye Violet 510 ekleyin (sabit ve geçirgen hücrelerin akış sitometrik analizinde canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt etmek için). Seyreltilmemiş Hayalet Boya reaktifi kullanın; İyice karıştırın. 4 °C'de 30 dakika inkübe edin; Her 10 dakikada bir iyice karıştırın.</li>
	<li>2 mL FACS tamponu ekleyin. Hücreleri 350 × g 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>PBS'ye 1 mL %2 paraformaldehit (PFA) ekleyerek ve oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek hücreleri sabitleyin.</li>
	<li>Tüpe 3.5 mL PBS ekleyin ve hücreleri 700 × g sıcaklıkta 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>1 mL Hücre İçi Fiksasyon/Geçirgenleştirme Tamponu ekleyerek ve 4 ° C'de 20 dakika inkübe ederek hücreleri geçirgen hale getirin.</li>
	<li>Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Anti-beta5t antikor veya anti-CCL21 antikorunun çalışma konsantrasyonlarının her birine 100 μL veya 40 μL anti-Aire antikoru çalışma konsantrasyonları (örn., AF488 etiketli), 1x geçirgenlik tamponunda, iyice karıştırın ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin.</li>
	<li>1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Adım 2.14'ü tekrarlayın.</li>
	<li>100 μL çalışma konsantrasyonlarında tavşan önleyici IgG (örneğin, AF555 etiketli) ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>1 mL 1x geçirgenleştirme tamponu ekleyin. Hücreleri 700 × g'da 4 ° C'de 8 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücreleri 200 μL FACS Tamponunda yeniden süspanse edin ve iyice karıştırın.</li>
	<li>Akış sitometrik analizine kadar hücreleri karanlıkta 4 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Akış sitometrik analizinden önce hücreleri 60 μm naylon ağdan süzün.</li>
</ol>

Preparing Mouse Thymic Epithelial Cells for Analysis of Intracellular Molecules

<ol><li>Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+the+T+cell+repertoire%3A+what+thymocytes+see+%28and+don%27t+see%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see).</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 377-391 (2014).</li>
<li>Takahama, Y., Ohigashi, I., Baik, S., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+diversity+in+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of diversity in thymic epithelial cells.</a> Nat Rev Immunol. 17 (5), 295-305 (2017).</li>
<li>Hozumi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+indispensable+in+thymic+environment+specific+for+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is indispensable in thymic environment specific for T cell development.</a> J Exp Med. 205 (11), 2507-2513 (2008).</li>
<li>Koch, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delta-like+4+is+the+essential%2C+nonredundant+ligand+for+Notch1+during+thymic+T+cell+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Delta-like 4 is the essential, nonredundant ligand for Notch1 during thymic T cell lineage commitment.</a> J Exp Med. 205 (11), 2515-2523 (2008).</li>
<li>Murata, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+CD8%2B+T+cell+development+by+thymus-specific+proteasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes.</a> Science. 316 (5829), 1349-1353 (2007).</li>
<li>Ripen, A. M., Nitta, T., Murata, S., Tanaka, K., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+of+thymic+cortical+epithelial+cells+expressing+the+thymoproteasome+subunit+%CE%B25t%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny of thymic cortical epithelial cells expressing the thymoproteasome subunit β5t.</a> Eur J Immunol. 41 (5), 1278-1287 (2011).</li>
<li>Gommeaux, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+regulates+positive+selection+of+a+subset+of+CD4%2B+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease regulates positive selection of a subset of CD4+ thymocytes.</a> Eur J Immunol. 39 (4), 956-964 (2009).</li>
<li>Viret, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus-specific+serine+protease+contributes+to+the+diversification+of+the+functional+endogenous+CD4+T+cell+receptor+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Thymus-specific serine protease contributes to the diversification of the functional endogenous CD4 T cell receptor repertoire.</a> J Exp Med. 208 (1), 3-11 (2011).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Mathis, D., Benoist, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Aire.</a> Annu Rev Immunol. 27, 287-312 (2009).</li>
<li>Takaba, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fezf2+orchestrates+a+thymic+program+of+self-antigen+expression+for+immune+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune tolerance.</a> Cell. 163 (4), 975-987 (2015).</li>
<li>Takaba, H., Takayanagi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanisms+of+T+cell+selection+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">The mechanisms of T cell selection in the thymus.</a> Trends Immunol. 38 (11), 805-816 (2017).</li>
<li>Lammers, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehf+and+Fezf2+regulate+late+medullary+thymic+epithelial+cell+and+thymic+tuft+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ehf and Fezf2 regulate late medullary thymic epithelial cell and thymic tuft cell development.</a> Front Immunol. 14, 1277365(2024).</li>
<li>Ushio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+diverse+thymic+medullary+epithelial+cells+interplay+to+direct+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Functionally diverse thymic medullary epithelial cells interplay to direct central tolerance.</a> Cell Rep. 43 (4), 114072(2024).</li>
<li>Kozai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+CCL21+in+establishment+of+central+self-tolerance+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Essential role of CCL21 in establishment of central self-tolerance in T cells.</a> J Exp Med. 214 (7), 1925-1935 (2017).</li>
<li>Lkhagvasuren, E., Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphotoxin+%CE%B2+receptor+regulates+the+development+of+CCL21-expressing+subset+of+postnatal+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphotoxin β receptor regulates the development of CCL21-expressing subset of postnatal medullary thymic epithelial cells.</a> J Immunol. 190 (10), 5110-5117 (2013).</li>
<li>Sakata, M., Ohigashi, I., Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellularity+of+thymic+epithelial+cells+in+the+postnatal+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellularity of thymic epithelial cells in the postnatal mouse.</a> J Immunol. 200 (4), 1382-1388 (2018).</li>
<li>Hirakawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamental+parameters+of+the+developing+thymic+epithelium+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fundamental parameters of the developing thymic epithelium in the mouse.</a> Sci Rep. 8 (1), 11095(2018).</li>
<li>Venables, T., Griffith, A. V., DeAraujo, A., Petrie, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+epithelial+cell+morphology+control+thymic+organ+size+during+atrophy+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in epithelial cell morphology control thymic organ size during atrophy and regeneration.</a> Nat Commun. 10 (1), 4402(2019).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+nurse+cells+provide+microenvironment+for+secondary+T+cell+receptor+%CE%B1+rearrangement+in+cortical+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Thymic nurse cells provide microenvironment for secondary T cell receptor α rearrangement in cortical thymocytes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (50), 20572-20577 (2012).</li>
<li>Gray, D. H., Chidgey, A. P., Boyd, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thymic+stromal+cell+populations+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of thymic stromal cell populations using flow cytometry.</a> J Immunol Methods. 260 (1-2), 15-28 (2002).</li>
<li>Seach, N., Wong, K., Hammett, M., Boyd, R. L., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purified+enzymes+improve+isolation+and+characterization+of+the+adult+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Purified enzymes improve isolation and characterization of the adult thymic epithelium.</a> J Immunol Methods. 385 (1-2), 23-34 (2012).</li>
<li>Jenkinson, E. J., Anderson, G., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+T+cell+maturation+on+defined+thymic+stromal+cell+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Studies on T cell maturation on defined thymic stromal cell populations in vitro.</a> J Exp Med. 176 (3), 845-853 (1992).</li>
<li>Adkins, B., Tidmarsh, G. F., Weissman, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+thymic+cortical+epithelial+cells+developmentally+regulate+the+expression+of+a+B-lineage+transformation-associated+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Immunogenetics%22%5BJournal%5D)">Normal thymic cortical epithelial cells developmentally regulate the expression of a B-lineage transformation-associated antigen.</a> Immunogenetics. 27 (3), 180-186 (1988).</li>
<li>Farr, A. G., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+heterogeneity+in+the+murine+thymus%3A+fucose-specific+lectins+bind+medullary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Epithelial heterogeneity in the murine thymus: fucose-specific lectins bind medullary epithelial cells.</a> J Immunol. 134 (5), 2971-2977 (1985).</li>
<li>Wells, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+transient+ablation+and+single-cell+RNA-sequencing+reveals+the+development+of+medullary+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Combined transient ablation and single-cell RNA-sequencing reveals the development of medullary thymic epithelial cells.</a> eLife. 9, e60188(2020).</li>
<li>Hubert, F. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+specific+anti-Aire+antibody+reveals+aire+expression+is+restricted+to+medullary+thymic+epithelial+cells+and+not+expressed+in+periphery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">A specific anti-Aire antibody reveals aire expression is restricted to medullary thymic epithelial cells and not expressed in periphery.</a> J Immunol. 180 (6), 3824-3832 (2008).</li>
<li>Nishikawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+lineage+tracing+of+Aire-expressing+cells+reveals+a+requirement+for+Aire+in+their+maturation+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Temporal lineage tracing of Aire-expressing cells reveals a requirement for Aire in their maturation program.</a> J Immunol. 192 (6), 2585-2592 (2014).</li>
<li>Jenkinson, W. E., Rossi, S. W., Parnell, S. M., Jenkinson, E. J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR+alpha-expressing+mesenchyme+regulates+thymus+growth+and+the+availability+of+intrathymic+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">PDGFR alpha-expressing mesenchyme regulates thymus growth and the availability of intrathymic niches.</a> Blood. 109 (3), 954-960 (2007).</li>
<li>Cosway, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+thymus+medulla+specialization+for+central+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Redefining thymus medulla specialization for central tolerance.</a> J Exp Med. 214 (11), 3183-3195 (2017).</li>
<li>Farr, A. G., Eisenhardt, D. J., Anderson, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+thymic+epithelium+and+an+improved+method+for+its+propagation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine thymic epithelium and an improved method for its propagation in vitro.</a> Anat Rec. 216 (1), 85-94 (1986).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Ohigashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+conversion+of+thymocyte-attracting+cells+into+self-antigen-displaying+cells+in+embryonic+thymus+medulla+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Developmental conversion of thymocyte-attracting cells into self-antigen-displaying cells in embryonic thymus medulla epithelium.</a> eLife. 12, RP92552(2024).</li>
</ol>

Yazarların herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Dispase'li veya Dispase'siz kollajenaz, TEC'ler 4,5,9,18,21'i hazırlamak için fare timusunu sindirmek için yaygın olarak kullanılır. Kollajenaz da dahil olmak üzere bir proteaz karışımı içeren liberaz, TEC'leri17,22 hazırlamak için timusu sindirmek için de kullanılır. Kollajenaz ve Liberaz kullanımı, enzimlerin ürün grubuna bağlı olarak küçük farklılıklar ortaya çıkabilse de, fare timusundan esasen eşdeğer verim ve cTEC ve mTEC kalitesi verir. Tripsin ayrıca verimli timus sindirimi21,23 için kullanılır, ancak TEC'ler tarafından eksprese edilen EpCAM ve CD80 dahil olmak üzere birçok hücre yüzeyi molekülünün tripsin sindirimine duyarlı olduğu gösterilmiştir21. Timusun enzimatik sindirimi için, hasarlı hücrelerden DNA salınımı nedeniyle viskoziteyi azaltmak için genellikle DNaz eklenir17,21.
Timusun enzimatik sindirimi, TEC'lerin timustan serbest bırakılması için gereklidir. Timus, doku parçaları görünmez hale gelene ve hücre süspansiyonu homojen görünene kadar yeterince sindirilmelidir. Ancak aşırı enzimatik tedavi hücrelere zarar verdiği ve hücre canlılığını azalttığı için sindirim çok uzun süre bırakılmamalıdır. Her deneyde, timus sindirimi sırasında inkübasyon süresine ve pipetleme gücüne dikkat etmek önemlidir. Mevcut enzimatik çürütme teknolojisinin, Giriş'te ayrıntılı olarak açıklandığı ve daha önce 17,18,19 bildirildiği gibi, TEC'lerin yalnızca küçük bir kısmının serbest bırakılmasına izin verdiğinin farkında olmak da önemlidir.
TEC'ler total timus hücresi süspansiyonunda nadir olduğundan, total timus hücresi süspansiyonu kullanılarak TEC'lerin akış sitometrik analizi, ölçüm başına tipik olarak 8 × 106 ila 16 ila 106 hücre olmak ×üzere birçok hücrenin boyanmasını gerektirir.
Enzimle sindirilmiş timus hücrelerinden türetilen TEC'ler, anti-CD45 manyetik boncuklar22 ve/veya Percoll yoğunluk gradyanlı santrifüjleme31 kullanılarak zenginleştirilebilir. Bu zenginleştirme prosedürleri, özellikle TEC'ler daha sonra bir akış sitometrik hücre ayırıcı üzerinde saflaştırıldığında zaman tasarrufu sağlar. Ayrıca, anti-CD45 zenginleştirmesinin, CD45 eksprese eden timositler20 ile sıkı bir şekilde ilişkili olan bir TEC alt popülasyonunu ortadan kaldıracağı ve Percoll santrifüjlemesinin beklenmedik şekilde yoğun bir TEC alt popülasyonunu ortadan kaldırabileceği de belirtilmelidir.
TEC'lerin fiksasyonu ile ilgili olarak, akış sitometrik analizinde PFA tedavisinin hücreleri küçülttüğü ve ileri saçılma yoğunluğunu azalttığı bilinmektedir. %2 PFA ilavesinden hemen sonra hücrelerin nazikçe pipetlenmesi ve ardından PBS eklenmesi, aşırı hücre büzülmesini önlemeye yardımcı olabilir.
Akış sitometrik analizi için, timus içinde TEC'lerin nadiren ortaya çıktığı göz önüne alındığında, bunların tanımlanması, timositler veya splenositlerle karşılaştırıldığında farklı bir yaklaşım gerektirir. İlk sınıflandırma, timositler ve dendritik hücreler ve makrofajlar da dahil olmak üzere diğer hematopoietik hücreler üzerinde her yerde bulunan hematopoietik bir pan-belirteç olan CD45'in kullanımına dayanmaktadır. Tersine, hematopoietik kökenli olmayan TEC'ler CD45 ekspresyonundan yoksundur. Bunun yerine, TEC'ler yüzeylerinde EpCAM'i eksprese eder, dolayısıyla TEC'leri ayırt etmek için CD45-negatif ve EpCAM-pozitiften oluşan basit bir geçit stratejisine izin verir. Akış sitometrik analizimizde, bu popülasyonu tanımlayarak başlıyoruz ve daha sonra TEC'ler ve timositler arasındaki önemli boyut farklılığı ve TEC'lerin büyük boyutu ve yüksek otofloresansı göz önüne alındığında, ileri ve yan dağılım parametrelerinin uygun şekilde ölçeklendirilmesini sağlıyoruz.
Daha sonra, CD45-negatif EPCAM-pozitif popülasyonda cTEC ve mTEC belirteçlerinin değerlendirilmesine dikkat çekilir. Bu popülasyonun küçültülmüş büyüklüğü nedeniyle, bu adım cTEC'leri ve mTEC'leri telafi etmek için zorunlu hale gelir. Tamamen boyanmış bir panelin (örneğin, cTEC işaretleyici Ly51 ve mTEC işaretleyici UEA-1 ile birlikte TEC tanımlayıcı CD45 ve EpCAM) incelenmesi, saçılma ölçeklendirmesinin yeterliliğini daha da sağlar. Akış sitometrik kurulumu sırasında birincil hedefimiz, her antikor için pozitif ve negatif popülasyonları ayırt etmek etrafında döner.
Aire, beta5t ve CCL21'in birlikte boyanmasında, TEC alt kümeleri içindeki farklı popülasyonlar tanımlanır. Aire'in mTEC'ler tarafından seçici ekspresyonu göz önüne alındığında, CD45-negatif/EPCAM-pozitif/UEA-1-pozitif/Ly51-negatif hücrelerin dört renkli lekesine odaklanıyoruz. Burada, Aire için negatif kontrol oluşturmak için UEA-1-pozitif hücreler kullanılır ve Aire-pozitif hücrelerin net bir şekilde tanımlanmasını kolaylaştırır. mTEC'lerde ifade edilen CCL21 için de benzer bir yaklaşım benimsenmiştir. Tersine, yalnızca cTEC'ler tarafından ifade edilen beta5t için, beta5t için arka plan seviyelerini belirlemek için dört renkli leke içindeki Ly51-pozitif hücrelere vurgu yapılarak karşılaştırılabilir bir geçit stratejisi uygulanır. Anti-beta5t ile boyanmış numunelerin müteakip analizi, pozitif bir popülasyonun tanımlanmasını kolaylaştırır.
Anti-beta5t antikoru ve anti-CCL21 antikoru tavşan antikorlarıdır, bu nedenle bu antikorlar önceden floresan etiketlemesi yapılmadan karıştırılmamalıdır. Antikorların çalışma konsantrasyonları, antikorların seri seyreltmeleri ile boyanmış kontrol hücrelerinin (örneğin, vahşi tip ve nakavt farelerden alınan TEC'ler) akış sitometrik analizi yapılarak önceden belirlenmelidir.
Akış sitometrik analizinde, cTEC'ler ve mTEC'ler sıklıkla cTEC'ler için Ly51 veya CD205'in ve mTEC'ler için UEA1 ve CD80'in hücre yüzeyi ekspresyonu ile tanımlanır. Bununla birlikte, cTEC'lerin ve mTEC'lerin sonunda timustaki mikroanatomik lokalizasyonları ile tanımlanması gerektiği akılda tutulmalıdır. Embriyonik timusta, ortaya çıkan kanıtlar, Ly51 ve CD205'in ekspresyonunun cTEC'lerle sınırlı olmadığını, cTEC/mTEC-bipotent progenitörler ve olgunlaşmamış mTEC'ler32,33 dahil olmak üzere diğer TEC popülasyonlarına uzandığını göstermiştir. Ek olarak, cTEC'lerdeki Ly51 ekspresyonu, Şekil 1 ve Şekil 2'de de gösterildiği gibi, doğum sonrasıdönem 33'e kıyasla embriyogenez ve perinatal dönemde düşük kalır.
Sonuç olarak, TEC'lerin enzimatik olarak serbest bırakılmış tek hücreli süspansiyonunun akış sitometrik analizi, TEC'lerin serbest bırakılmasının sınırlı etkinliğine rağmen, TEC'lerin ve alt popülasyonlarının tek hücre çözünürlüğünde kantitatif analizi için güçlü bir teknik sunar. Özellikle, tek hücreli TEC süspansiyonundaki hücre içi moleküllerin akış sitometrik analizi, TEC'lerin ve bunların alt popülasyonlarının gelişimi ve işlevi için önemli olan çeşitli moleküllerin ekspresyonunu incelemek için yararlıdır.

Timus, T lenfositlerinin gelişimini ve repertuar seçimini destekleyen epitelyal bir mezenkimal organdır. Timus içindeki kortikal ve medüller mikroortamlarda, timik epitel hücreleri (TEC'ler) T hücresi gelişimini ve seçimini yönlendirmede çok önemli bir rol oynar. Timik korteksteki kortikal TEC'lerin (cTEC'ler) öncelikle erken T hücresi gelişiminin indüksiyonuna ve yeni üretilen T hücresi antijen reseptörü (TCR) eksprese eden timositlerin pozitif seçimine katkıda bulunduğu iyi kabul edilmektedir. Buna karşılık, timik medulladaki medüller TEC'ler (mTEC'ler), korteksten pozitif olarak seçilmiş timositlerin çekilmesi ve kendi kendine reaktif T hücrelerini ortadan kaldırarak ve düzenleyici T hücreleri üreterek merkezi öz toleransın kurulması için gereklidir1,2. TEC'lerin T hücresi gelişimini ve seçimini desteklemedeki bu işlevlerine, cTEC'ler ve mTEC'lerde ifade edilen çeşitli moleküller aracılık eder.
Bunlar, lenfoid progenitörlerin T hücresi soy spesifikasyonu için önemli olan Delta benzeri ligand 4'ü (DLL4) içerir)3,4, beta5t (Psmb11 olarak da bilinir, CD8 T hücrelerinin pozitif seçimi için önemlidir)5,6 ve Prss16 (timus spesifik serin proteaz veya TSSP olarak da bilinir, CD4 T hücrelerinin pozitif seçimi için önemlidir)7,8 cTEC'lerde ifade edilir ve Otoimmün düzenleyici (Aire, öz genlerin rastgele ifadesi için önemlidir)9,10, Fez ailesi çinko parmak 2 (Fezf2, Aire'den bağımsız öz genlerin rastgele ekspresyonu ve timik tutam hücrelerinin oluşumu için önemlidir)11,12,13,14ve C-C motif kemokin ligandı 21 (CCL21, medüller migrasyon ve pozitif seçilmiş timosit birikimi için önemlidir)14,15,16 mTEC'lerde ifade edilir. Akış sitometrisi, TEC'lerde fonksiyonel olarak önemli olan bu molekülleri kantitatif olarak tespit etmek için bir araç sağlar ve cTEC'lerin ve mTEC'lerin hem gelişiminin hem de işlevinin değerlendirilmesini kolaylaştırır. TEC'lerdeki moleküllerin çoğu, sitoplazma (örneğin, proteazom bileşeni beta5t) ve çekirdek (örneğin, transkripsiyonel düzenleyici Aire) gibi hücreler içinde esas olarak eksprese edildiğinden, akış sitometrisi kullanarak cTEC'lerde ve mTEC'lerde hücre içi molekülleri kantitatif olarak analiz etmek avantajlıdır.
TEC'ler timusta nadirdir. 5 haftalık bir dişi farede yaklaşık 1 × 106 cTEC ve yaklaşık 2,5 × 106 mTEC bulunurken, timik korteks yaklaşık 3 × 108 CD4+CD8+ timosit ve timik medulla yaklaşık 5 × 107 CD4+CD8- ve CD4-CD8+ timositler17 içerir. Bu nedenle, timustaki hücrelerin büyük çoğunluğu (% >99), genç yetişkin farelerde TEC'lerden ziyade timositler de dahil olmak üzere hematopoietik hücrelerdir. Ayrıca, TEC'ler, timus içindeki komşu hücreler (örneğin, timositler) ve mimari hücre dışı bileşenler (örneğin, kollajen) ile sıkı bir şekilde ilişkilidir, bu nedenle TEC'lerin hücre süspansiyonuna salınması, timusun proteaz sindirimini gerektirir. Enzimatik sindirim için geleneksel yöntemler, TEC'lerin yalnızca küçük bir kısmını verir; cTEC'ler ve mTEC'ler için sırasıyla yaklaşık %1 (1 × 104) ve %10 (2 × 105), 5 haftalık fare thymus17,18,19. Timustan TEC salınımının düşük verimliliği, muhtemelen TEC'lerin proteolitik enzimlere ve mekanik strese duyarlılığından ve TEC'lerin komşu hücrelerle, özellikle cTEC'ler ve CD4+CD8+ timositler20 arasındaki sıkı ilişkisinden kaynaklanmaktadır. Bu bağlamda, mevcut enzimatik sindirim aracılı hücre hazırlama yöntemlerine dayanan akış sitometrik analizi ve tek hücreli RNA dizileme analizi dahil olmak üzere fare TEC'lerinin tek hücreli analizinin sonuçları, TEC'lerin yalnızca küçük bir bölümünü temsil etmektedir ve bu nedenle kapsamlı olmaktan uzaktır. Bununla birlikte, TEC'lerin enzimatik alımındaki bu tür sınırlamalara rağmen, tek hücreli süspansiyondaki fare TEC'lerinin akış sitometrik analizi, cTEC'lerde ve mTEC'lerde işlevsel olarak ilgili moleküllerin kantitatif analizi için hala yararlıdır. Hücre süspansiyonunda TEC'ler, epitelyal yüzey molekülü EpCAM (CD326) için pozitif ve hematopoietik yüzey molekülü CD45 için negatif hücreler olarak tanımlanmıştır. EpCAM+CD45-TEC'ler içinde, Ly51 moleküllerinin (BP-1 ve CD249 olarak da bilinir) ve Ulex Europaeus aglütinin I (UEA1) bağlanma kapasitesinin hücre yüzeyi ekspresyon seviyeleri (esas olarak α bağlı fukoz içeren glikoproteinlere ve glikolipidlere bağlanma) cTEC'leri (Ly51yüksekUEA1düşük) ve mTEC'leri (Ly51düşükUEA1yüksek) fenotipik olarak işaretlemek için kullanılmıştır). Burada, yeni hazırlanmış fare TEC'lerinde hücre içi moleküller beta5t, CCL21 ve Aire'nin kantitatif analizine odaklanarak, fare TEC'lerinin tek hücreli süspansiyonunun konvansiyonel hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için deneysel protokollerimizi açıklıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Kollajenaz / Dispas&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td></td></tr><tr><td>Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti</td><td>eBioscience</td><td>00-5523-00</td><td></td></tr><tr><td>Hayalet Boya Menekşe 510&nbsp;</td><td>Tonbo</td><td>13-0870-T500</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-fare CD45 monoklonal antikor, Klon 30-F11</td><td>BD Horizon</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-fare Ly51 monoklonal antikor, Klon 6C3</td><td>BioLegend</td><td>108312</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-fare EpCAM / CD326 monoklonal antikor, Klon G8.8</td><td>BioLegend</td><td>118216</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Aglütinin I (UEA1)</td> <td>Vektör Laboratuvarlar</td><td>DL-1067-1</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anti-fare Aire monoklonal antikor, Klon 5H12</td><td>eBioscience</td><td>53-5934-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Psmb11 / beta5t tavşan monoklonal antikoru, Klon CPTC-PSMB11 (fare) -1</td><td>NIH NCI</td><td>CPTC-PSMB11 (fare) -1</td><td>https://proteomics.cancer.gov/antibody-portal</td></tr><tr><td>Anti-fare CCL21 / exodus 2 tavşan poliklonal antikoru</td><td>Bio-Rad</td><td>AAM27</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-tavşan IgG ağır zincir keçi rekombinant antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A27039</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD32 / CD16 &ndash; Saflaştırılmış (Fc Blok Antikoru)</td><td>Leinco Technologies</td><td>C247</td><td></td></tr><tr><td>Naylon Mesh 60 Mikron</td><td>Bileşen Kaynağı</td><td>W31436</td><td></td></tr><tr><td>Ekipman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>Isı bloğu</td><td></td></tr><tr><td>Cellometre Otomatik 2000 Hücre Canlılığı sayacı</td><td>Nexcelom</td><td>Yaşayabilir hücre sayımı</td><td></td></tr><tr><td>LSRFortessa Hücre Analiz Cihazı</td><td>BD Biosciences</td><td>Flow sitometre</td><td>Beş lazer (355, 408, 488, 595 ve 637 nm)</td></tr><tr><td>FACSDiva yazılım sürümü 9.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td>Flow sitometrik analiz</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 10.9.0</td><td>BD Biosciences</td><td>Flow sitometrik veri analizi</td><td></td></tr><tr><td>Antikor</td><td>Seyreltme oranı (Çalışma konsantrasyonu)</td> <td>Seyreltme Tamponu</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Fare CD32/CD16 &ndash; Saflaştırılmış (Fc Blok Antikoru)</td> <td>1:40</td><td>FACS Tampon</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-fare CD45 monoklonal antikor</td><td>1:25</td><td>FACS Tampon</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7 anti-fare EpCAM / CD326 monoklonal antikor</td><td>1:100</td><td>FACS Tampon</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-fare Ly51 monoklonal antikor</td><td>1:100</td><td>FACS Tampon</td><td></td></tr><tr><td>DyLight 594 Ulex Europaeus Aglütinin I (UEA1)</td><td>1:400</td><td>FACS Tamponu</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CCL21 / exodus 2 tavşan poliklonal antikoru</td><td>1:200</td><td>1x Geçirgenleştirme Tamponu</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare Psmb11 / beta5t tavşan monoklonal antikor, Klon CPTC-PSMB11 (fare) -1</td><td>1:1000</td><td>1x Geçirgenleştirme Tamponu</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 anti-tavşan IgG ağır zincirli keçi rekombinant antikoru</td><td>1:400</td><td>1x Geçirgenleştirme Tamponu</td><td></td></tr><tr><td>Tamponu</td><td>10</td> mM HEPES içeren RPMI1640 <td></td><td></td></tr> amaç<tr><td>;</td><td>%</td>2 FBS içeren hücre hazırlama <td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>için Hücre hazırlama</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS tamponu için (%1 BSA içeren 1x HBSS&nbsp; ve% 0.1 sodyum azid)</td> <td>Hücre hazırlığı ve antikor boyama</td><td></td><td></td>için</tr>% <tr><td>2 FBS içeren RPMI1640 1 mg / ml Kollajenaz / Dispas ve 1U / ml DNaz çözeltisi</td><td>Enzim sindirimi</td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>PBS'de% 2 PFA</td><td>Hücre fiksasyonu</td><td></td><td></td>için</tr><tr><td>Fiksasyon / Geçirgenleştirme Tamponu (3 kısım Fiksasyon / Geçirgenleştirme Seyreltici ile 1 kısım Fiksasyon / Geçirgenleştirme Konsantresi)</td> <td>Hücre fiksasyonu için</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x Geçirgenleştirme Tamponu (9 kısım damıtılmış su ile 1 kısım 10X konsantre)</td> <td>Hücreler arası antikor boyama için&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

Preparation of Single-Cell Suspension of Mouse Thymic Epithelial Cells and Staining of Intracellular Molecules for Flow Cytometric Analysis

Timik epitel hücreleri (TEC'ler), T hücrelerinin gelişimini ve repertuar seçimini teşvik etmede önemli bir rol oynar. Timik korteksteki kortikal TEC'ler (cTEC'ler) erken T hücresi gelişimini ve kortikal timositlerin pozitif seçimini indükler. Buna karşılık, timik medulladaki medüller TEC'ler (mTEC'ler) korteksten pozitif seçilmiş timositleri çeker ve T hücrelerinde öz tolerans oluşturur. cTEC'lerde eksprese edilen DLL4 ve beta5t'nin yanı sıra mTEC'lerde eksprese edilen Aire ve CCL21 dahil olmak üzere çeşitli moleküller, T hücresi gelişimini ve seçimini destekleyen timus fonksiyonuna katkıda bulunur. cTEC'lerde ve mTEC'lerde fonksiyonel olarak ilgili moleküllerin akış sitometrik analizi, TEC'lerin biyolojisi hakkındaki anlayışımızı geliştirmek için yararlıdır, ancak TEC'lerin tek hücreli süspansiyonlarının hazırlanması için mevcut yöntemler genç yetişkin fare timusundan TEC'lerin yalnızca küçük bir kısmını (cTEC'ler için yaklaşık %1 ve mTEC'ler için yaklaşık %10) elde edebilir. TEC'lerdeki bu fonksiyonel olarak ilgili moleküllerin çoğu hücreler içinde lokalize olduğundan, fare TEC'lerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için protokollerimizi açıklıyoruz.

Analiz, ileriye ve yana saçılma parametrelerinin yanı sıra en az altı floresan kanalının (CD45, EpCAM, Ly51, UEA1, Ghost Dye ile beta5t, CCL21 ve/veya Aire için) tespitine olanak tanıyan bir akış sitometresi gerektirir. 0 günlük ve 2 haftalık farelerden alınan, Kollajenaz/Dispase ile sindirilmiş timus hücrelerinin temsili akış sitometrisi profilleri sırasıyla Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmiştir. Her iki şekilde de, Panel A'daki nokta grafiği, toplam partikül sinyallerinin ileriye saçılma (FSC) yoğunluğunu ve Ghost Dye Violet 510 floresan yoğunluğunu göstermektedir. Ghost Dye reaktifi ile negatif boyama ve hücre boyutunu yansıtan ileriye saçılma ile değerlendirildiğinde, partikül sinyallerinin %90'ından fazlası canlı hücreleri temsil etmektedir. Panel B, canlı timus hücrelerinin, hematopoetik hücreler tarafından eksprese edilen bir molekül olan CD45 ve epitel hücreler tarafından eksprese edilen bir molekül olan EpCAM için hücre yüzeyi floresan sinyallerini göstermektedir. Küçük ancak belirgin bir hücre popülasyonu CD45- EpCAM+ olup, dolayısıyla TEC'leri temsil etmektedir.
<img alt="Akım sitometrisi analizi, EpCAM-PE-Cy7, CD45-BV421, hücre popülasyonları, cTECs, mTECs, veri görselleştirme." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: 0 günlük vahşi tip C57BL/6-arkaplanlı farelerden elde edilen Collagenase/Dispase ile sindirilmiş timus hücrelerinin temsili akım sitometrik profilleri. (A) Toplam partiküler sinyallerin ileri saçılma (forward scatter) yoğunluğu ve Ghost Dye Violet 510 floresan yoğunluğu. Kırmızı kutu, canlı hücrelerin sinyallerini göstermektedir. (B) Canlı hücrelerin (panel A'deki kırmızı kutu) CD45 ve EpCAM için floresan sinyalleri. Kırmızı kutu CD45- EpCAM+ TEC'leri göstermektedir. (C) TEC'lerdeki (panel B'deki kırmızı kutu) Ly51 ve UEA1 hücre yüzeyi boyama sinyalleri iki ana popülasyonu ortaya çıkarmaktadır: cTECs açısından zenginleşmiş Ly51high UEA1low hücreler ve mTECs açısından zenginleşmiş Ly51low UEA1high hücreler. (D-F) Panel C'de tanımlanan cTECs (üst paneller) ve mTECs (alt paneller) içinde (D) beta5t, (E) CCL21 ve (F) Aire tespiti. Gri histogramlar, (D,E) sadece ikincil antikorla boyanmış ve (F) Aire eksik farelerden alınan hücreler kullanılarak boyanmış kontrol profillerini göstermektedir. Kısaltmalar: FSC = ileri saçılma; TECs = Timik epitelyal hücreler; cTECs = kortikal TEC'ler; mTECs = medüller TEC'ler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Akış sitometrisi analizi, TEC hücre kapılaması, CD45-BV421, EpCAM-PE-Cy7, dağılım grafikleri, histogramlar." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66945/66945fig02.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 2"> 
Şekil 2: 2 haftalık vahşi tip C57BL/6 tabanlı farelerden alınan ve Kollajenaz/Dispase ile sindirilmiş timus hücrelerinin temsili akış sitometrisi profilleri. (A) Toplam partiküler sinyallerin ileri saçılım yoğunluğu ve Ghost Dye Violet 510 floresan yoğunluğu. Kırmızı kutu, canlı hücrelerin sinyallerini göstermektedir. (B) Canlı hücrelerin (panel A'daki kırmızı kutu) CD45 ve EpCAM için floresan sinyalleri. Kırmızı kutu CD45- EpCAM+ TEC'leri göstermektedir. (C) TEC'lerdeki (panel B'deki kırmızı kutu) Ly51 ve UEA1 hücre yüzey boyama sinyalleri iki ana popülasyonu ortaya çıkarmaktadır: cTEC'lerle zenginleşmiş Ly51high UEA1low hücreler ve mTEC'lerle zenginleşmiş Ly51low UEA1high hücreler. (D-F) Panel C'de tanımlandığı üzere cTEC'lerde (üst paneller) ve mTEC'lerde (alt paneller) (D) beta5t, (E) CCL21 ve (F) Aire tespiti. Gri histogramlar, yalnızca (D,E) sekonder antikor ile boyanmış ve (F) FITC işaretli izotip-eşleştirilmiş IgG ile boyanmış kontrol profillerini göstermektedir. Kısaltmalar: FSC = ileri saçılım; TECs = Timik epitelyal hücreler; cTECs = kortikal TEC'ler; mTECs = medüller TEC'ler; FITC = floresein izotiyosiyanat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66945/66945fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Panel C'de gösterilen Ly51 ve UEA1 hücre yüzeyi boyama sinyalleri, TEC'lerde iki ana popülasyon olduğunu ortaya koymaktadır; cTEC'lerle zenginleştirilmiş, Ly51 açısından nispeten yüksek ve UEA1 açısından düşük bir popülasyon ve mTEC'lerle zenginleştirilmiş, Ly51 açısından nispeten düşük ve UEA1 açısından yüksek başka bir popülasyon21,22,23,24,25. 0 günlük dönem de dahil olmak üzere embriyonik ve neonatal aşamalarda, cTEC'lerin frekansı mTEC'lerininkinden daha fazladır. Postnatal aşamalarda ise, temel olarak cTEC'lerin timustan kurtarılma verimliliğinin son derece düşük olması nedeniyle mTEC'lerin frekansı baskındır (tek hücre süspansiyonuna cTEC'lerin yaklaşık %1'i ve mTEC'lerin %10'u geri kazanılabilir)17.
Hücrelerin fikse edilmesi ve permeabilizasyonu, TEC'ler içindeki hücre içi moleküllerin tespit edilmesine olanak tanır. Panel D, beta5t ekspresyonunun cTEC'lerin çoğunluğunda tespit edildiğini ancak mTECs'lerde tespit edilmediğini göstermektedir; panel E, CCL21'in mTECs'lerin bir kısmında tespit edildiğini ancak cTECs'lerde tespit edilmediğini göstermektedir ve panel F, Aire'nin mTECs'lerin bir alt popülasyonunda eksprese edildiğini göstermektedir.
Fare TEC'lerindeki hücre içi moleküllerin ek akış sitometrik profilleri yayınlanmış makalelerde bulunabilir; beta5t6,20, CCL2114,16,26 ve Aire27,28 moleküllerinin yanı sıra keratin22,29 ve Fezf211,30 dahil olmak üzere diğer hücre içi moleküller için de mevcutlaardır.

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması için protokolleri açıklıyoruz.

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

Thymic epithelial cells (TECs) play an essential role in promoting the development and repertoire selection of T cells. Cortical TECs (cTECs) in the ...

preparation-single-cell-suspension-mouse-thymic-epithelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz T hücre gelişimini incelemek üzere bir akım sitometri tabanlı bir yöntem...

Akım Sitometri tarafından Timik Pozitif ve Negatif Seçim incelenmesi

Biz flow sitometrik negatif seçimin birincil fare tip II alveol epitel hücrelerinde (AECII) hızlı izolasyonu tarif. Bu AECII yüksek canlılığı ve saflık göstermektedir ve bu gibi otoimmün veya bulaşıcı hastalıklar gibi solunum koşullar altında rolü ile ilgili işlevsel ve klinik çalışmalar, geniş bir aralığı için uygundur.

Fonksiyonel ve Moleküler Çalışmalar Birincil murin Tip II alveol epitel hücrelerinde akım sitometri İzolasyonu

Kaynak: Hidmark, A. S.,  et al. {{}}Tek Bir Siyatik Sinirlerde ve Dorsal Kök Ganglionunda İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi. J. Vis. Uzm. {{TAG_ 27}} (2017).  Bu video, fare siyatik sinirlerinde ve dorsal kök gangliyonlarında (DRG'ler) bağışıklık hücrelerini analiz etmek için akış sitometrisinin kullanımını göstermektedir. İşlem, bağışıklık hücrelerinin florofor ve biyotin etiketli antikorlarla etiketlenmesini, hücrelerin stabilize edilmesini ve geçirgenleştirilmesini ve...

Fare Sinir Dokularındaki İmmün Hücrelerin Flow Sitometri Kullanılarak Analizi

Bu protokol, antijen yoğunluğuna tek bir hücre süspansiyonu santrifüj ve ilgi hücre popülasyonlarının son olarak manyetik ve / veya FACS ayıklama, ardından doku enzimatik sindirimi farklı adımları ile insan timus hücreleri sunan izole etmek için bir yöntem göstermektedir.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

Burada izolasyonu, tanımlanması ve fare timik epitelial hücreler üzerinde (Tecs) saflaştırılması için etkili bir yöntem tarif eder. Bu protokol, normal T-hücresi gelişimi, timus disfonksiyon ve T hücresi sulandırılacak timus fonksiyonunun çalışmaları için kullanılabilir.

İzolasyon, tanımlama ve Murin Thymic Epitel Hücreleri saflaştırılması

Cilt, karmaşık bir bağışıklık hücresi ağına ev sahipliği yapar. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek ve deride bulunan farklı lökosit popülasyonlarını akış sitometrisi ile analiz etmek için hayvanın vücudunun farklı bölgelerinden fare derisinin sindirimi için etkili bir metodoloji açıklıyoruz.

Farklı Fare Cilt Bölgelerinden sitoflüorimetrik analize için tek hücre süspansiyonları hazırlanması

Bu makale, T hücresi soylarının nesil, fenotip ve sayı kinetiğinin analizi ile timik çökelme öncüllerini karakterize etmek için in vivo ve in vitro metodolojiyi açıklamaktadır.

Timus Karakterizasyonu kullanma Fare Embriyo atalarıdır Settling<em&gt; In Vivo</em&gt; Ve<em&gt; In Vitro</em&gt; Tahliller

Bu makalede mitokondri veya canlı hücrelerde organellerin ölçmek için güçlü bir yöntem gösterilmektedir. Primer hücre kullanarak doku örnekleri, hasat gibi karma hücre nüfus bu organelleri miktar lysosome veya mitokondri özel boyalar yüzey işaretleyicileri karşı fluorescently konjuge antikorlar ile kombinasyonu sağlar çok renkli akış sitometresi.

Çok renkli akış sitometresi tabanlı Quantification mitokondri ve T hücrelerde organellerin

Burada, biz tek fare timus, lenf nodu ve dalak ileri çalışmalar için Akış Sitometresi kullanarak bu hücreler drene pankreas hücrelerden hazırlamak için bir iletişim kuralı mevcut. Ayrıca, bu iletişim kuralını kullanarak Akış Sitometresi düzenleyici T hücreleri kümelerine belirlemek için kullanıldı.

Düzenleyici T hücre alt kümeleri içinde fare timus, lenf nodu ve dalak akışı sitometresi kullanarak drene pankreas belirlenmesi

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Öğrenin fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyon hazırlama ve akış sitometri analizi yöntemlerini. Bu protokol T-hücre gelişimi ve seçilim mekanizmalarını anlamak için kritik öneme sahiptir.

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması (Video) | JoVE Journal

Fare timik epitel hücrelerinin tek hücreli süspansiyonunun hazırlanması ve akış sitometrik analizi için hücre içi moleküllerin boyanması

Daha fazla video keşfet