Name: Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Öğrenin fare retinasında tam montajlı immün boyama ve yapay zeka destekli otomatik sayım yöntemiyle retinal ganglion hücrelerini hızlı ve doğru bir şekilde nicelendirmeyi. Bu teknik glokom araştırmalarında hücre kaybını değerlendirmeyi kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Tam Montajlı Retinada İmmün Boyama ve Yapay Zeka Tabanlı RGC Sayımı

<ol><li>Quigley, H. A., Broman, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+number+of+people+with+glaucoma+worldwide+in+2010+and+2020%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The number of people with glaucoma worldwide in 2010 and 2020.</a> Br J Ophthalmol. 90 (3), 262-267 (2006).</li>
<li>Gallo Afflitto, G., Swaminathan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial-ethnic+disparities+in+concurrent+rates+of+peripapillary+%26+macular+OCT+parameters+among+a+large+glaucomatous+clinical+population%5BTitle%5D)+AND+%22Eye%22%5BJournal%5D)">Racial-ethnic disparities in concurrent rates of peripapillary & macular OCT parameters among a large glaucomatous clinical population.</a> Eye. , (2024).</li>
<li>Atkinson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+measure+of+patient+satisfaction+with+ocular+hypotensive+medications%3A+the+Treatment+Satisfaction+Survey+for+Intraocular+Pressure+%28TSS-IOP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Health+Qual+Life+Outcomes%22%5BJournal%5D)">A new measure of patient satisfaction with ocular hypotensive medications: the Treatment Satisfaction Survey for Intraocular Pressure (TSS-IOP).</a> Health Qual Life Outcomes. 1, 67(2003).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mouse-fixation+device+for+IOP+measurement+in+awake+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">A new mouse-fixation device for IOP measurement in awake mice.</a> Vision Res. 219, 108397(2024).</li>
<li>Almasieh, M., Wilson, A. M., Morquette, B., Cueva Vargas, J. L., Di Polo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+retinal+ganglion+cell+death+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of retinal ganglion cell death in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 31 (2), 152-181 (2012).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+counting+of+retinal+ganglion+cells+in+the+entire+mouse+retina+based+on+improved+YOLOv5%5BTitle%5D)+AND+%22Zool+Res%22%5BJournal%5D)">Automatic counting of retinal ganglion cells in the entire mouse retina based on improved YOLOv5.</a> Zool Res. 43 (5), 738-749 (2022).</li>
<li>Al-Khindi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Tbx5+regulates+direction-selective+retinal+ganglion+cell+development+and+image+stabilization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Tbx5 regulates direction-selective retinal ganglion cell development and image stabilization.</a> Curr Biol. 32 (19), 4286-4298 (2022).</li>
<li>Claes, M., Moons, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+ganglion+cells%3A+Global+number%2C+density+and+vulnerability+to+glaucomatous+injury+in+common+laboratory+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Retinal ganglion cells: Global number, density and vulnerability to glaucomatous injury in common laboratory mice.</a> Cells. 11 (17), 2689(2022).</li>
<li>Zhang, N., Wang, Z., Lin, P., Xing, Y., Yang, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methanol-based+whole-mount+preparation+for+the+investigation+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Methanol-based whole-mount preparation for the investigation of retinal ganglion cells.</a> J Vis Exp. (194), e65222(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1&kez; PBS</td><td>Servicebio</td><td>G4202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa594 konjuge Keçi Anti-Tavşan IgG&nbsp; (H+Lü)</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11012</td><td></td></tr><tr><td>Anti-BRN3A antikoru [EPR23257-285]</td><td>Abcam</td><td>ab245230</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Sayım yazılımı</td><td></td><td></td><td>https://github.com/MOEMIL/Intelligent-quantifying-RGCs</td></tr><tr><td>Bulut disk</td><td>Google sürücü bağlantısı</td><td></td><td>https://drive.google.com/file/d/1yOEsBvil6KEdZFa5ENQxB6&nbsp;</td></tr><tr><td>Bulut disk</td><td>Baidu bağlantısı</td><td>Çıkarma kodu: g44k</td><td>https://pan.baidu.com/s/1lccg1OVbeudsp2VtnqxWZg&nbsp;</td></tr><tr><td>Marker</td><td>Sharpie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu</td><td>Biosharp, Labgic</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Macklin</td><td>P804536</td><td></td></tr><tr><td>ProClean 300</td><td>Beyotime</td><td>ST853</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>BBI, Sangon</td><td>A610498</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioFroxx, neoFroxx</td><td>1139ML100</td><td></td></tr></tbody></table>

tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Bu protokol, titiz doku hazırlığı, hassas antikor inkübasyonu ve güvenilir otomatik hücre sayımı sağlayarak fare retinalarının tam montajlı immün boyama metodolojisini detaylandırır. Prosedür, retinal ganglion hücrelerinin (RGC'ler) sağlam bir şekilde etiketlenmesini ve nicelleştirilmesini kolaylaştırarak, çeşitli deneysel bağlamlarda hücresel popülasyonların doğru bir şekilde değerlendirilmesini sağlar. Yöntem, vahşi tip ve glokom modellenmiş farelerde RGC'leri saymak için kullanıldı ve tutarlı sonuçlar verdi. Temsili bir sonuç, 2 aylıkken normal bir yetişkin faredeki RGC sayısının yaklaşık 45.000 olduğunu göstermektedir (Şekil 6).
AI yazılımının normal ve hastalık modellerinde BRN3a etiketli RGC'leri doğru bir şekilde ölçüp ölçemeyeceğini değerlendirmek için, glokom7'nin N-metil-D-aspartat (NMDA) ile indüklenen bir fare modeli oluşturduk. Bu modelden elde edilen tam montajlı retina, anti-BRN3A ile immün olarak boyandı ve RGC'ler otomatik sayma yazılımı kullanılarak ölçüldü. Sonuç, nispeten yüksek bir arka plan lekelenmesine işaret etti (Şekil 7). Bununla birlikte, yazılım neredeyse tüm RGC'leri doğru bir şekilde tanımlayabildi. Normal bir fare retinasındaki yaklaşık 45.000-50.000 RGC'ye kıyasla, bu retinada toplam 15.231 RGC tanımlandı ve bu da ciddi dejenerasyona işaret etti. Bu nedenle, AI yazılımı, daha az optimal boyama kalitesine sahip retinalardaki RGC'leri saymak için de etkili bir şekilde kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig01.jpg"> Şekil 1: RGC hazırlığı için şematik diyagram. (A) Göz küresi çıkarılır ve 1x PBS'ye yerleştirilir. (B) Göz küresi, 3 saat boyunca buz üzerinde% 4 PFA'da sabitlenir. (C) Korneanın çıkarılması. (D) Lensin çıkarılması. (E) Vizör lastiği makas kullanılarak 4 flebe bölünür. (F) Sklera soyulur ve kalıntılar yumuşak bir fırça ile retina yüzeyinden nazikçe çıkarılır. (G) Retina, anti-BRN3A ile immün olarak etiketlenmiştir. (H) Floresan sinyaller konfokal mikroskop kullanılarak görüntülenir. (I) RGC'lerin otomatik sayımı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig02v3.jpg"> Şekil 2: Tam montajlı fare retinasının izolasyonu. (A) Fare, servikal çıkık ile ötenazi yapılır. (B) Fare düz bir yüzeye yerleştirilmiştir. (C) Göz küresi makasla dikkatlice çıkarılır. (D) Göz küresi nazikçe 1x PBS'ye yerleştirilir. (E) Göz küresi, korneanın kenarına forseps ile sabitlenir. (F) Korneanın kenarında bir iğne ile küçük bir kesi yapılır. (G) Kornea çıkarıldıktan sonra çanak şeklindeki yapı çıkarılır. (H) Lens forseps ile dikkatlice çıkarılır. (I) Retinanın zarar görmesini önlemek için korneanın kenarı boyunca sklera üzerindeki optik sinire doğru küçük bir kesi yapılır. (J) Sklera, forseps ile kesi boyunca yırtılır. (K) Retina düzleştirilir ve bir boya fırçası ile temizlenir. (L) Retina düzleştirilir ve buz gibi soğuk metanol ile hızla sabitlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig03.jpg"> Şekil 3: Tam montajlı fare retinasının immün boyama. (A) 1x PBS ile yıkandıktan sonra, retina bir bloke edici tampon ile bloke edilir. (B) Retina, gece boyunca 4 ° C'de bir primer antikor ile inkübe edilir. (C) Retina 1x PBS ile üç kez yıkanır. (D) Retina, oda sıcaklığında 2 saat boyunca ikincil bir antikor ile inkübe edilir. (E) Retina, RGC'ler yukarı bakacak şekilde bir cam slayt üzerine monte edilmiştir. (F) Görüntüler bir lazer konfokal mikroskop kullanılarak elde edilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig04.jpg"> Şekil 4: Otomatik sayma yazılımının kurulumu. (A) Adım 1, dosya yolunun "yolov5_cpu" dizinine güncellenmesini içerir. (B) Grafik arayüz başlatılır. (C) Model dosyasının C sürücüsünün kök dizinindeki varlığının doğrulanması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig05.jpg"> Şekil 5: Otomatik RGC sayma yazılımının çalışması. (A) Sayma yazılımı açılır. (B) Görüntüyü içe aktarmak için RESMİ AÇ düğmesine tıklanır. (C) Otomatik sayımı başlatmak için RUN düğmesine tıklanır. (D) Sayılan hücreler kırmızı kare bir kutu ile işaretlenir ve hücre numarası sağ üst köşede görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig06.jpg"> Şekil 6: Fare RGC'lerinin otomatik sayımı. Üst panel (solda), anti-BRN3A ile immün olarak boyanmış düz montajlı retinanın temsili sonuçlarını gösterir; üst panel (sağda), daha önce geliştirilmiş yazılımla RGC'lerin otomatik sayımını gösterir. Ölçek çubuğu: 100 μm. Üst panellerdeki iç kısımlar sırasıyla büyütülür ve alt panelde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66991/66991fig07.jpg"> Şekil 7: NMDA ile indüklenen bir glokom fare modelinde RGC sayımı. Sol panel: AI yazılımı tarafından tanınan RGC'leri gösteren tam montajlı retinaya genel bakış. Sağ panel: Retinanın kısmi bir alanının büyütülmüş görünümü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66991/66991fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

whole-mount-immunostaining-automatic-counting-mouse-retinal-ganglion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video, akış sitometrisi kullanarak murin primer retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) izole etme prosedürünü gösterir. Bu yöntem, nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel RGC'lerin kaybından kaynaklanan görme keskinliğindeki büyük düşüşü daha iyi anlamak amacıyla RGC'lerin gelecekteki çalışmalarına izin verir.

Floresanla Aktive Edilen Hücre Sıralaması Kullanılarak Murin Retinal Ganglion Hücrelerinin İzole Edilmesi

Kaynak: Lani-Louzada, R.,  et al. Kemirgenlerde cerrahi olarak indüklenen glokom için limbal vasküler pleksusun tam daire koterizasyonu. J. Vis. Uzm. (2022). Bu video, limbal vasküler pleksusun tam daire koterizasyonuna tabi tutulan kimyasal olarak sabitlenmiş sıçan retinalarından retinal ganglion hücrelerinin nicelleştirilmesini göstermektedir. İşlem, geçirgenlik, antikor boyama ve nükleer karşı boyamayı içerir, ardından yüksek göz içi basıncının retinal ganglion hücresi canlılığı üzerindeki...

Koterizasyona Bağlı Oküler Hipertansiyon Sonrası Retinal Ganglion Hücreli Somaların Miktar Tayini 

Kaynak: Wang, Z.,  et al. Transpupiller İki Fotonlu Fare Retinasının İn Vivo Görüntülemesi.  J. Vis. Uzm. (2021). Bu video, iki foton mikroskobu kullanılarak in vivo retinal görüntüleme için bir tekniği göstermektedir. Anestezi uygulanmış fareler, başlarını sabitleyerek, göz kayganlaştırıcı uygulayarak ve gözün üzerine bir lamel yerleştirerek görüntülemeye hazırlanır. Floresan proteinleri eksprese eden retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) ilk olarak hizalama için epifloresan kullanılarak...

Fare Retinasının İki Fotonlu İn Vivo Görüntülemesi

Kaynak: Laboissonniere, et. al. Retinal Ganglion Hücrelerinin Tanımlanmış Alt Kümelerinin Tek Hücreli RNA-Seq'i. J. Vis. Uzm.  (2017).  Bu video, transgenik bir fare retinasındaki retinal ganglion hücresi (RGC) alt tiplerini tanımlamak için bir floresan izleme tekniğini göstermektedir. İşlem, izole retinanın bir kayıt odasında sabitlenmesini, oksijenli perfüzyon ile hücre canlılığının korunmasını ve izleyicili bir pipet kullanılarak floresan olarak etiketlenmiş RGC'lerin hedeflenmesini içerir.

Fare Retinal Ganglion Hücre Alt Tiplerinin Floresan İzleme ile Tanımlanması

Yenidoğan fare retina bir anjiyogenez modüle farklı genler ya da uyuşturucu rolleri soruşturma izin anjiyogenez bir iyi karakterize fizyolojik modeli...

Anjiyogenez Araştırma Yenidoğan Fare Retina Tüm Dağı Immunofluorescent Boyama<em&gt; In vivo</em

İmmünohistokimya protokolleri retinada, spesifik bir proteinin lokalizasyonu incelemek için kullanılır. Kalsiyum görüntüleme teknikleri retina ganglion hücrelerinin ve bunların akson kalsiyum dinamiklerini incelemek için istihdam edilmektedir.

Wholemount Sıçan Retina Immunohistochemical ve Kalsiyum Görüntüleme Yöntemleri

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Akış Sitometresi ile Primer Sıçan Retinalı Ganglion Hücrelerinin (RGC) İzolasyonu

Bu makalede, tüm mount retinal preparatları için iyi kurulmuş ve tekrarlanabilir bir lektin lekesi testi ve proliferatif ve proliferatif olmayan retinopatilerde sıklıkla değiştirilen vasküler parametrelerin nicel ölçümü için gerekli protokoller açıklanmaktadır.

Proliferatif Olmayan ve Proliferatif Retinopatilerle Farelerin Tüm Mount Retinalarında Vasküler Parametrelerin Nicelemesi

Bu el yazması, kemirgen gözbebeklerinden slaytların histolojik olarak hazırlanması için bir protokol sunmaktadır. Önerilen yöntemle, iç retina ışık mikroskobu altında kolayca görüntülenebilir ve değerlendirilebilir. Prosedür, farelerin ve sıçanların gözbebekleri için sunulmuştur.

Retinayı değerlendirmek için sıçan ve fare gözbebeklerinin histolojik slaytlarının hazırlanması ve analizi

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin fare retinasında tam montajlı immün boyama ve yapay zeka destekli otomatik sayım yöntemiyle retinal ganglion hücrelerini hızlı ve doğru bir şekilde nicelendirmeyi. Bu teknik glokom araştırmalarında hücre kaybını değerlendirmeyi kolaylaştırır.

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Daha fazla video keşfet