Name: Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T13:40:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Keşfedin maya yüzey ekranı ile protein mühendisliği yöntemini; antijen bağlayan varyantları zenginleştirmek için akış sitometri görselleştirmesi ve seçim koşullarının hassas kontrolü sağlanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Maya Yüzey Görüntüleme Teknikleri ile Protein Fonksiyonlarının Optimize Edilmesi

Maya yüzey gösterimi, protein mühendisliği alanındaki en önemli teknolojilerden biridir. Geliştirilmiş afinite veya stabilite gibi istenen özelliklere sahip protein varyantlarının seçilmesini sağlar. İlk olarak 1997'detanıtılan 1, faj ekranı 2,3, ribozom ekranı4 ve memeli hücresi ekranı 5,6,7'nin yanı sıra en yaygın kullanılan görüntüleme teknolojilerinden biridir. İlgilenilen protein (POI), proteinleri tutturmak için kaynaştırılarak maya hücrelerinin yüzeyinde görüntülenir. Bir dizi farklı çapa proteini mevcuttur ve en yaygın olarak POI, maya aglütininin çiftleşme proteini Aga2p 1,8'in C-terminaline kaynaştırılır. Ek olarak, POI tipik olarak, floresan etiketli antikorlar ve akış sitometrisi kullanılarak ekran seviyesinin tespit edilmesini sağlayan bir hemaglutinin etiketi (HA-etiketi) ve c-myc etiketi gibi iki etiketle çevrilidir (Şekil 1A). Tipik maya seçimi kampanyaları, manyetik boncuk seçimleri ve akış sitometrik sıralamasının bir kombinasyonunu içerir. Boncuk seçimleri, büyük hücre sayılarının işlenmesini ve hedef antijene bağlanan protein varyantlarının zenginleşmesini sağlar, çünkü antijen yüklü boncuklarla çok değerlikli etkileşimler avidite etkilerine yol açar ve bu nedenle düşük afiniteli varyantların kaybını önler (Şekil 1B). Akış sitometrik analizi ve seçimi, görüntülenen POI varyantlarının etiketli antijene bağlanmasını görselleştirme avantajı sunar. Sonuç olarak, bağlayıcı popülasyonlar sıralanabilir ve yetiştirilebilir, bu da birkaç sıralama turu boyunca istenen özelliklere sahip protein varyantlarının zenginleşmesine yol açar. Ayrıca, çeşitliliği ve dolayısıyla proteinin afinitesine ve/veya stabilitesine katkıda bulunan ek mutasyonlar bulma olasılığını daha da artırmak için ek rastgele mutajenez turları gerçekleştirilebilir.
Maya yüzey gösterimi, (a) oksidatif protein katlanmasının yanı sıra ökaryotik post-translasyonel modifikasyonları (N-glikosilasyon gibi) sağlayan ökaryotik ekspresyon mekanizması, (b) proteini çevreleyen iki peptit etiketinin tespiti nedeniyle ekspresyon normalizasyonu, (c) akış sitometrisi ile seçim ilerlemesinin görsel olarak incelenmesi (örneğin, bağlanma hücrelerinin yüzdesi ve bağlanma yoğunluğu) ve (d) tek tek protein mutantlarını analiz etme olasılığı gibi belirli avantajlar sunar. maya (örneğin, termostabilitenin yanı sıra afinitenin analiz edilmesi), zahmetli protein ekspresyonu ve saflaştırılmasına zaman kazandıran bir alternatif sunar9. Aslında, maya yüzeyinde görüntülenen proteinlerin hem afiniteleri (KDdeğerleri) hem de stabiliteleri (T50 değerleri), biyofiziksel yöntemler ve çözünür proteinler 9,10,11,12 kullanılarak elde edilen verilerle iyi korelasyonlar göstermiştir. Maya yüzey gösterimi, antikor fragmanları 13,14,15,16, 10. tip III fibronektin alanı 17,18, rcSso7d 19,20 veya knottinler21 gibi çeşitli proteinlerin mühendisliği için kullanılmıştır.. Benzer şekilde, randomize pozisyonları ve amino asit kodon kullanımını değiştirerek maya kütüphanesi tasarımlarını optimize etmek için kapsamlı araştırmalar yapılmıştır 17,22,23. Maya yüzey gösteriminin stabilite mühendisliği 14,15,24,25, afinite 18,26,27, enzimatik aktivite 28,29,30,31 ve protein ekspresyonu32 için başarılı olduğu kanıtlanmıştır. Ek olarak, küçük bir molekülün varlığında veya yokluğunda koşullu bağlanma gibi daha karmaşık uygulamalar, maya yüzey ekranı20 kullanılarak gerçekleştirildi.
Bu protokolde, küçük molekül A112020'nin varlığında antijen insan retinol bağlayıcı protein 4'e (hRBP4) karşı seçilen G4 kütüphanesi (10. tip III fibronektin alanı, Fn3'e dayalı) örneği ile maya yüzeyi gösterimli bir seçim kampanyası için tüm temel adımları açıklıyoruz. Bu seçim, moleküler bir anahtar olarak kullanılabilecek küçük bir moleküle bağlı olan bir protein-protein etkileşimi elde etmek için gerçekleştirildi. Dikkat çekici bir şekilde, maya yüzey gösterimi ile alternatif yaklaşımlar mümkün olsa da, tipik maya seçimleri genellikle daha önce herhangi bir bağlanma afinitesi olmadan bir hedef antijene bağlanmayı hedefler. Bir maya kütüphanesinin yetiştirilmesini, boncuk seçimlerini, akış sitometrik sıralamasını ve hataya açık PCR (epPCR) ile afinite olgunlaşmasını içeren bir maya seçimi kampanyasının tüm adımlarını kapsıyoruz. Bu nedenle, bu protokol önceki maya yüzeyi görüntüleme protokollerini33,34 tamamlar ve herhangi bir maya kütüphanesi ve tercih edilen hedef antijen ile maya yüzeyi görüntüleme seçimleri (Şekil 1) için bir temel olarak kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig1v5.jpg"> 
Şekil 1: Maya yüzeyi görüntüleme prensibi ve maya yüzeyi görüntüleme seçimleri için tipik bir iş akışı. (A) POI, bir maya yüzeyi görüntüleme vektörüne klonlanır ve tipik olarak bir N-terminali HA- ve bir C-terminali c-myc-etiketi ile çevrilidir. Yapı, yüzeyde sergilenmek üzere maya çiftleşme proteini Aga2p ile kaynaştırılır. Gösterilen protein, PDB ID: 6QBA20'den tasarlanmış bağlayıcı "RS3" dür. (B) Boncuk seçimleri ve akış sitometrik sıralaması ile protein varyantlarının istenen özelliklerle zenginleştirilmesini ve ayrıca afinite olgunlaşması için epPCR'yi birleştiren maya yüzeyi görüntüleme seçimi kampanyaları için tipik bir iş akışını gösteren akış şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig1largev5.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>10-beta elektroyetkin E. coli&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C3020K</td><td></td></tr><tr><td>Agar-Agar, Kobe I</td><td>Carl Roth</td><td>5210.5</td><td></td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Carl Roth</td><td>K029.2</td><td></td></tr><tr><td>Anti-c-myc antikoru, klon 9E10, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A488 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-c-myc antikoru, klon 9E10, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>MA1-980-A647 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr> <tr><td>Anti-HA antikoru, klon 16B12, AF488</td><td>BioLegend</td><td>901509 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>Anti-HA antikoru, klon 16B12, AF647</td><td>BioLegend</td><td>682404 (Biozym)</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini, soğuk etanol fraksiyonu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik asit monohidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1909</td><td></td></tr><tr><td>D-Galaktoz</td><td>Carl Roth</td><td>4987.2</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Difco maya azot bazı</td><td>Becton Dickinson (BD)&nbsp;</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Di-Sodyum hidrojen fosfat heptahidrat</td><td>Carl Roth</td><td>X987.3</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>D-Sorbitol</td><td>Carl Roth</td><td>6213.1</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s fosfat tamponlu tuzlu su (10x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Biotin Binder</td><td>Invitrogen</td><td>11047 (Fisher Scientific)</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-2 Mıknatıslı</td><td>Thermo Fisher</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>EBY100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti 1 mm (E.coli için)</td><td>VWR</td><td>732-1135</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporasyon küveti 2 mm (maya için)</td><td>VWR</td><td>732-1136</td><td></td></tr><tr><td>Etanol mutlak</td><td>MERCK</td><td>1070172511</td><td></td></tr><tr><td>GeneMorph II Rastgele Mutajenez Kiti</td><td>Agilent Technologies</td><td>200550</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Bacto Casamino Asitler</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>223120</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>AppliChem</td><td>131339.1211</td><td></td></tr><tr><td>LE agaroz & nbsp;</td><td>Biozym 840004</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lityum asetat dihidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>Monarch DNA Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>NEB</td><td>T1020S</td><td></td></tr><tr><td>Monarch PCR & DNA Temizleme Kiti</td><td>NEB</td><td>T1030S</td><td></td></tr><tr><td>Multifuge 1S-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NheI-HF</td><td>NEB</td><td>R3131S</td><td></td></tr><tr><td>Büyüme ortamı</td><td>NEB</td><td>B9035S</td><td></td></tr><tr><td>pCTCON2</td><td>Addgene</td> <td># 41843</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin G sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His antikoru, AF488</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Penta-His antikoru, AF647</td><td>Qiagen</td><td>35370</td><td></td></tr><tr><td>Pepton ex kazein triptik olarak sindirilmiş</td><td>Carl Roth</td><td>8986.3</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491S</td><td></td></tr><tr><td>SaII-HF</td><td>NEB</td><td>R3138S</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum asetat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Carl Roth</td><td>3957.2</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dihidrojen fosfat monohidrat</td><td>Carl Roth</td><td>K300.2</td><td></td></tr><tr><td>Steritop dişli şişe üstü filtre</td><td>MERCK</td><td>S2GPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, AF488</td><td>Invitrogen</td><td>S32354 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin, AF647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357 (Thermo Fisher)</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Tri-Sodyum sitrat dihidrat</td><td>Carl Roth</td><td>4088.1</td><td></td></tr><tr><td>UV-Vis spektrofotometre</td><td>Agilent</td><td>8453</td><td></td></tr><tr><td>Maya özü, mikro granül</td><td>Carl Roth</td><td>2904.4</td><td></td></tr><tr><td>Zymoprep Maya Plazmid Miniprep II</td><td>Zymo Research</td><td>D2004&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

maya yüzey ekranı ile protein mühendisliği

Protein Engineering by Yeast Surface Display

G4 kütüphanesi, küçük moleküllü ilaç A1120'ye bağlı antijen hRBP4'e karşı seçildi. Akış sitometrik sıralama için kütüphanelerin boyanması, Yöntem 6'da açıklandığı gibi gerçekleştirildi ve uygulanan geçit stratejisi Şekil 2A'da gösterildi. Bir ilk geçit, hücre morfolojisine dayalı olarak tüm hücreleri içeriyordu ve ikinci kapı (FSC-Genişlik histogramı), tek hücreleri seçmek ve hücre agregalarını çıkarmak için uygulanan sıkı bir geçit stratejisi gösterdi. Üçüncü ve son kapı, protein varyantlarının (x ekseni) antijen bağlanmasına (y ekseni) karşı görüntüsünü gösterdi. Hem görüntüleme hem de bağlanma sinyalleri gösteren maya hücreleri sıralandı. Daha da önemlisi, sıralama kapısı, bağlanma alanlarını yüksek bağlanma sinyali ve dolayısıyla yüksek afinite ile zenginleştirmek için katı bir şekilde ayarlandı. Bu sıkı seçim, seçim kampanyası boyunca hedef antijene spesifik olarak bağlanan maya hücrelerinin görüntülenmesinde bir zenginleştirme sağladı (Şekil 2B). Daha sonraki akış sitometrik sıralama turlarında, antijen konsantrasyonu 10 kat azaltıldı (100 nM'den 10 nM'ye). Bu nedenle, genel bağlanma sinyali azaldı ve sadece yüksek afiniteye sahip bağlayıcılar hala tespit edilebilir ve sıralanabilirdi (Şekil 2C).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66994/66994fig2v5.jpg"> 
Şekil 2: Antijene (A1120 varlığında hRBP4) bağlanmak için Fn3 tabanlı G4 kütüphanesinin bir maya yüzeyi ekran seçiminden elde edilen temsili sonuçlar. (A) Maya kütüphanelerinin sınıflandırılması için genel geçit stratejisi. İlk kapı (FSC ve SSC), tüm maya hücrelerini seçmek ve saçılma olaylarını hariç tutmaktır; ikinci kapı (FSC-W'nin histogramı) hücre agregalarını uzaklaştırmayı ve yalnızca tek maya hücrelerini seçmeyi amaçlar. Üçüncü kapı, antijene bağlanmaya karşı yüzey görüntüleme seviyesini (HA- veya c-myc-tag'in tespiti) çizer (burada anti-His antikoru tarafından tespit edilen 5 μM A1120 varlığında hRBP4). Kütüphane ayrıca antijen bağlanmasının beklenmediği durumlarda sadece ikincil antikorlarla (antijensiz) boyandı. Sıralanan hücreler mavi renkle vurgulanır. (B) G4 kütüphanesinin 3 tur akış sitometrik sıralama boyunca evrimi. Bağlanma popülasyonunun zenginleşmesi her seçim turunda gözlemlenebilir. (C) Daha düşük antijen konsantrasyonlarının kullanılması, hedef antijene karşı daha yüksek afiniteye sahip protein varyantlarının seçilmesini sağlar. Antijen konsantrasyonunun (burada hRBP4) 10 kat azaltılması üzerine, daha yüksek (sıralanmış hücreler, mavi) veya daha düşük afiniteye sahip klonların varlığını gösteren farklı köşegenler ortaya çıkar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66994/66994fig2largev5.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Protein engineering enables the improvement of existing functions of a given protein or the generation of novel functions. One of the most widely used and ...

protein-engineering-by-yeast-surface-display

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Saccharomyces cerevisiae'de yönlendirilmiş evrim kampanyaları için mutant kütüphaneler oluşturmak ve taramak için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Evrim Yöntemi yönettiği<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;: Mutant Kütüphane Oluşturma ve Tarama

Burada, enzimatik modifikasyon deneyleri için maya yüzeyinde görüntülenen substratların kullanılması için bir protokol sunuyoruz. Platform, temsili bir enzimatik modifikasyon deneyi olarak tirozin fosfataz SHP-2'nin substratlarından birine karşı defosforilasyon aktivitesinin analizi kullanılarak gösterildi.

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Biz bir decellularized akciğer ekstraselüler matriks ve fonksiyonel akciğer dokusu oluşturmak için kullanılan olabilir romanı biomimetic biyoreaktör geliştirdik. Biyoreaktör matris ve kültür hücreleri ekim, kısa bir süre için in vivo olarak nakledilen zaman etkili gaz değişimi gösteren doku oluşturur.

Akciğer Mühendisliği Prosedürü

Biz 3D doku gibi agrega içinde hücreleri arasında, bağlayıcı enerji, doku yüzey gerilimi olarak ifade ölçme yöntemi açıklanmaktadır. , Akciğer, kas, ve beyin tümörleri invazivliğini ile ilişkili doku yüzey gerilimi farklar göstermiştir ve farklı hücre türleri arasındaki mekansal ilişkilerin kurulması temel belirleyicileri olmuştur.

Doku Yüzey tensiometresi Agrega Uyum ölçümü

Çok yönlü bir plazma litografi tekniği hücresel eklenti rehberlik için sabit bir yüzey desenleri oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu teknik, doğal dokuları taklit eden ve birçok farklı hücre tiplerinde eğitim için kullanılır olmuştur da dahil olmak üzere hücre ağları oluşturmak için uygulanabilir.

Plazma Litografi Yüzey Desenlendirme Hücre Ağları Oluşturma

Bir sentetik operon kodlama hem salgı cihaz ve curli liflerin yapısal monomerlerin tasarımı açıklanmaktadır. Bu amiloidleri ve yapışık polimerlerin aşırı bir bağlılık ölçülebilir bir kazanç...

Tek Sentetik Curli Operon Oluşturma tarafından Mühendislik Bağlanan Bakteriler

Biyo-uyumlu pH duyarlı sol-jel nanosensors poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) electrospun iskeleleri katılabilecektir. Üretilen kendi-rapor iskeleleri iskelesi üzerinde hücrelerin kültürlenmesi iken microenvironmental durumların in situ izlenmesi için de kullanılabilir. 3D hücresel yapı deneyi bozmadan gerçek zamanlı olarak izlenebilir edildiğinden bu durum yararlıdır.

3-Boyutlu Hücre Kültürü için Self-raporlama iskeleleri

Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.

ECM Protein Nanofiberler ve Nanoyapılar İşlenmiş Kullanılarak Yüzey başlatılan Meclisi

Burada, yüksek çözünürlüklü nano ölçekli yüzey potansiyeli haritaları oluşturmak için bir araç olarak Kelvin prob kuvveti mikroskobunun kullanımını açıklayan bir protokol sunuyoruz. Bu araç, mikroorganizmaların substrat yüzeylerine bağlanma kapasitesi üzerindeki yüzey potansiyelinin rolünü değerlendirmek için uygulandı.

Kelvin Probe Kuvvet Mikroskobu kullanılarak Bakterilerin Yüzey Potansiyel Ölçümü

Bu, bir doku mühendisliği odası içinde mikrocerrahi arteriyovenöz döngü veya akışlı bir pedikül konfigürasyonu kullanarak in vivo vaskülarize doku oluşturmak için bir kılavuzdur. Üretilen vaskülarize dokular, organ rejenerasyonu ve doku defektlerinin değiştirilmesinin yanı sıra ilaç testi ve hastalık modellemesi için de kullanılabilir.

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

Keşfedin maya yüzey ekranı ile protein mühendisliği yöntemini; antijen bağlayan varyantları zenginleştirmek için akış sitometri görselleştirmesi ve seçim koşullarının hassas kontrolü sağlanır.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Daha fazla video keşfet