Name: Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 56 s
Description: Öğrenin, primer fare ve insan T hücrelerinde Ca²⁺ mikro alanlarını floresan mikroskopi ile görüntüleme yöntemini. Bu protokol, bağışıklık hücrelerindeki kalsiyum sinyal yollarını incelemek için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>T hücrelerinde Ca2+ mikro alanları tespit etmek için yüksek çözünürlüklü görüntüleme tekniği

<ol><li>Wolf, I. M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontrunners+of+T+cell+activation%3A+Initial%2C+localized+Ca2%2B+signals+mediated+by+NAADP+and+the+type+1+ryanodine+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Frontrunners of T cell activation: Initial, localized Ca2+ signals mediated by NAADP and the type 1 ryanodine receptor.</a> Sci Signal. 8 (398), 102(2015).</li>
<li>Taguchi, T., Mukai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+signalling+and+membrane+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity signalling and membrane trafficking.</a> Curr Opin Cell Biol. 59, 1-7 (2019).</li>
<li>Trebak, M., Kinet, J. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in T cells.</a> Nat Rev Immunol. 19 (3), 154-169 (2019).</li>
<li>Diercks, B. -P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ORAI1%2C+STIM1%2F2%2C+and+RYR1+shape+subsecond+Ca2%2B+microdomains+upon+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">ORAI1, STIM1/2, and RYR1 shape subsecond Ca2+ microdomains upon T cell activation.</a> Sci Signal. 11, 0358(2018).</li>
<li>Cheng, H., Lederer, W. J., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+sparks%3A+Elementary+events+underlying+excitation-contraction+coupling+in+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Calcium sparks: Elementary events underlying excitation-contraction coupling in heart muscle.</a> Science. 262 (5134), 740-744 (1993).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+in+lymphocyte+activation+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling in lymphocyte activation and disease.</a> Nat Rev Immunol. 7 (9), 690-702 (2007).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).</li>
<li>Kummerow, C., Junker, C., Kruse, K., Rieger, H., Quintana, A., Hoth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunological+synapse+controls+local+and+global+calcium+signals+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Rev%22%5BJournal%5D)">The immunological synapse controls local and global calcium signals in T lymphocytes.</a> Immunol Rev. 231 (1), 132-147 (2009).</li>
<li>Brock, V. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X4+and+P2X7+are+essential+players+in+basal+T+cell+activity+and+Ca2%2B+signaling+milliseconds+after+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">P2X4 and P2X7 are essential players in basal T cell activity and Ca2+ signaling milliseconds after T cell activation.</a> Sci Adv. 8 (5), 9770(2022).</li>
<li>Weiß, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+to+laminin-1+and+collagen+IV+induces+the+formation+of+Ca2%2B+microdomains+that+sensitize+mouse+T+cells+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Adhesion to laminin-1 and collagen IV induces the formation of Ca2+ microdomains that sensitize mouse T cells for activation.</a> Sci Signal. 16 (790), 9405(2023).</li>
<li>Diercks, B. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+Ca2%2B+microdomains+for+the+adaptive+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">The importance of Ca2+ microdomains for the adaptive immune response.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1871 (5), 119710(2024).</li>
<li>Woelk, L. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DARTS%3A+an+open-source+Python+pipeline+for+Ca2%2B+microdomain+analysis+in+live+cell+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">DARTS: an open-source Python pipeline for Ca2+ microdomain analysis in live cell imaging data.</a> Front Immunol. 14, 1299435(2024).</li>
<li>Diercks, B. -P., Werner, R., Schetelig, D., Wolf, I. M. A., Guse, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+calcium+imaging+method+for+local+calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">High-resolution calcium imaging method for local calcium signaling.</a> Methods Mol Biol. 1929, 27-39 (2019).</li>
<li>Python. Python. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.python.org/downloads/">https://www.python.org/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Anaconda. Anaconda. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html">https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html</a> (2024).</li>
<li>git. git. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git">https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS">https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS</a> (2024).</li>
<li>DARTS. DARTS GitHub Repository. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/">https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/</a> (2024).</li>
<li>Oracle. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/">https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/</a> (2024).</li>
<li>Time-Dependent Entropy Deconvolution. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters">https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</a> (2024).</li>
<li>Gu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+NADPH+oxidases+DUOX1+and+DUOX2+synthesize+NAADP+and+are+necessary+for+Ca2%2B+signaling+during+T+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Dual NADPH oxidases DUOX1 and DUOX2 synthesize NAADP and are necessary for Ca2+ signaling during T cell activation.</a> Sci Signal. 14 (709), 3800(2021).</li>
<li>Roggenkamp, H. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HN1L%2FJPT2%3A+A+signaling+protein+that+connects+NAADP+generation+to+Ca2%2B+microdomain+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">HN1L/JPT2: A signaling protein that connects NAADP generation to Ca2+ microdomain formation.</a> Sci Signal. 14 (675), 5647(2021).</li>
<li>Heßling, L. D., Troost-Kind, B., Weiß, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NAADP-binding+proteins+-+Linking+NAADP+signaling+to+cancer+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophy.+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">NAADP-binding proteins - Linking NAADP signaling to cancer and immunity.</a> Biochim Biophy. Acta Mol Cell Res. 1870 (7), 119531(2023).</li>
<li>Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+targeted+single-channel+optical+recording+reveals+multiple+Orai1+gating+states+and+oscillations+in+calcium+influx%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (2), 440-445 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>&alpha;-CD3</td><td>BD Pharmingen</td><td>553058</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-CD28</td><td>BD Pharmingen</td><td>553295</td><td></td></tr><tr><td>Anaconda</td><td>Anaconda</td><td>https://docs.anaconda.com/free/anaconda/install/index.html&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>Biofil</td><td>CSS-013-070</td><td>70 & m çaplı</td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Invitrogen</td><td>A49865</td><td></td></tr><tr><td>Kapak fişleri</td><td>Paul Marienfeld GmbH</td><td>101202</td><td></td></tr><tr><td>DARTS</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/IPMI-ICNS-UKE/DARTS&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Fosfat tamponlu tuzlu su</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EasySep CD4 + T hücre İzolasyon Kiti</td><td>Kök Hücre</td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Manyetik Multistand</td><td>Kök Hücre</td><td>18010</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4-</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>Fura Red-</td><td>Invitrogen</td><td>F3020</td><td></td></tr><tr><td>Gibco RPMI 1640 orta</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td></td><td></td>11875093</tr><tr><td>Daldırma yağı</td><td>https://git-scm.com/book/en/v2/Getting-Started-Installing-Git</td><td></td> Git GitHub Leica 11513859 <td></td></tr><tr><td>Yenidoğan buzağı serumu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4637</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Oracle Oracle https://www.oracle.com/de/java/technologies/downloads/&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptamisin</td><td>Gibco, Thermo Fisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-lizin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Protein G manyetik boncuklar</td><td>Merck</td><td>LSKMAGG02</td><td>10 ve mikro; M çap</td></tr><tr><td>Python</td><td></td><td>Python https://www.python.org/downloads/&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Silisyum gresi (bazilon)</td><td>Bayer</td><td>291-1220</td><td></td></tr><tr><td>Zamana Bağlı Entropi Dekonvolüsyon</td><td>GitHub</td><td>https://ipmi-icns-uke.github.io/TDEntropyDeconvolution/General/2-usage.html#input-parameters</td><td></td></tr><tr><td>Tween</td><td>q-biogene</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr></tbody></table>

primer t hücrelerinde İlk ca2+ mikro alanlarının görüntülenmesi

Imaging Initial Ca2+ Microdomains in Primary T Cells

Bu protokolde, grubumuz 1,13 tarafından yapılan önceki çalışmalara dayalı olarak birincil fare T hücrelerindeki ilk Ca2+ mikro alanlarını görüntülemek ve analiz etmek için güncellenmiş bir yöntem belirledik. Bu yaklaşım, ORAI1, STIM1 ve STIM2 gibi CRAC kanallarının yanı sıra RyR1 gibi hücre içi Ca2+ salım kanallarının erken Ca2+ sinyal olaylarında4 katılımının çözülmesinde etkili olmuştur.
Bunu yapmak için, uyarılmamış birincil fare Orai1-/-, Stim1-/-, Stim2-/- ve Ryr1-/- görüntüleyerek spontan Ca2+ mikro alan oluşumunu araştırdık ve bunları WT birincil fare T hücreleri ile karşılaştırdık. Ca2+ mikro alan oluşumunun analizi, sinyal başlangıç hızını, Ca2+ genliğini ve konfokal düzlem başına sinyal sayısını kapsıyordu. Özellikle, Stim2-/- T hücreleri hariç, tüm KO T hücreleri, WT hücrelerine kıyasla lokal Ca2 + sinyallerinde önemli bir azalma ve azalmış bazal serbest sitozolik Ca2 + konsantrasyonu göstermiştir. Bu, Ca2+ mikro alanlarının oluşumunun ORAI1, STIM1 ve RyR14'ün etkileşimiyle karmaşık bir şekilde bağlantılı olduğu sonucuna varmamıza neden oldu. Ek olarak, plazma membranında spontan Ca2+ mikro alanlarını başarıyla tanımladık ve karakterize ettik. Bu Ca2+ mikro alanları, 290 nm ± 12 nm'lik bir Ca2+ genliği ile karakterize edildi. Ca2+ sinyalleri için renk kodlu bir yaklaşımın kullanılması, hücre boyunca Ca2+ mikro alanlarının görselleştirilmesine izin verdi. Sonuçlar ayrıca, milisaniyeler içinde görülebilen Ca2+ mikro alanlarının hızlı başlangıcını ve bu yöntemin birkaç milisaniye uzunluğunda Ca2+ sinyallerini algılama yeteneğini vurguladı4. Bu spontan Ca2+ mikro alanları daha sonra, yalnızca SOCE'ye değil, aynı zamanda FAK/PLC-γ/IP3 sinyal kaskad10 ve P2X49'un katılımı yoluyla da hareket eden, yapışmaya bağlı Ca2+ mikro alanları (ADCM) olarak tanımlandı. Ayrıca, bu teknik, çift oksidaz 1 ve 2'nin (DUOX1/2) NAADP üreten enzimler21 ve HN1L/JPT222'nin yeni keşfedilen NAADP bağlayıcı proteinlerden23 biri olarak doğrulanmasında temeldi.
Şekil 2, WT'nin yanı sıra P2x4-/- ve P2x4-/- farelerden boncuk teması üzerine birincil CD4+ T hücrelerindeki Ca 2+ mikro alanlarının temsili örneklerini göstermektedir. Hücreler Ca2+ boyaları Fluo-4 ve Fura Red ile yüklendi ve 25 ms'lik (40 kare / s) bir edinme hızında görüntülendi. T hücresi sinaps oluşumunu taklit etmek için, hücreler anti-CD3 / anti-CD28 kaplı boncuklarla uyarıldı. İlk Ca2+ mikro alan oluşumu, DARTS boru hattı kullanılarak boncuk temasından 1 saniye önce ve 15 saniye sonrasına kadar analiz edildi. Boncuk teması üzerine, WT hücresi, boncuk temas bölgesinde stimülasyondan sonraki ilk saniyede hızlı Ca2+ mikro alan oluşumu gösterdi (Şekil 2A). Bu Ca2+ mikro alanları, boncuk temasından sonraki 15 saniye içinde hücre boyunca daha da genişledi. WT hücresinin aksine, P2x4-/- ve P2x7-/- hücreleri (Şekil 2B), boncuk stimülasyonu üzerine azalmış Ca2 + mikroalan oluşumunun yanı sıra boncuk temasından önce P2x4-/- daha düşük bir bazal seviye gösterdi. Bu temsili bulgular, Brock ve ark.9 tarafından daha önce yayınlanan sonuçlarla uyumludur ve P2x4-/- ve P2x7-/- hücrelerinde 15 saniyenin üzerinde boncuk temasından hemen sonra WT T hücrelerinde Ca 2+ mikro alan oluşumunu ve çerçeve başına daha düşük sinyalleri gösterir. Ayrıca, P2x4-/- hücrelerindeki genlik önemli ölçüde azaldı ve yapışmaya bağlı Ca2 + mikro alanlarında purinerjik sinyallemenin rolünü daha da belirledi.
Ayrıca, bu yöntem, birincil insan CD4 + T hücrelerinde ilk Ca2 + mikro alanlarını görselleştirmek için de kullanılabilir (Şekil 3). Birincil murin T hücreleri ile uyumlu olarak, boncuk temas bölgesinde ilk Ca2 + mikro alanları uyarılır. Bununla birlikte, genel Ca2 + yanıtı, murin CD4 + T hücrelerine kıyasla farklı bir zaman ölçeğinde ortaya çıkıyor gibi görünmektedir.
Yerel Ca2+ sinyallerinin manuel bir şekilde analizi, bireysel araştırmacı için oldukça zahmetli ve öznel olduğu için mümkün değildir. Bu nedenle, daha önce MATLAB Simulink'te yerel Ca 2+ mikro alanlarını analiz etmek için son işlem13 için görüntü işleme ve optimizasyon araç kutularını kullanarak bir algoritma geliştirdik.
Kısa bir süre önce, Python12 yazılım platformunu kullanarak yüksek çözünürlüklü canlı hücre görüntülemede Ca2+ mikro alan analizi için DARTS adlı yeni, açık kaynaklı, son işlem hattı geliştirdik. Burada, kullanıcının tercihine bağlı olarak farklı evrişim algoritmaları seçilebilir, morfolojik hücre şekli değişikliklerini telafi etmek için gerçekleştirilen bir hücre şekli normalizasyonu ve mikroskop ve ölçüme özgü parametreler tanımlanabilir (örneğin, ölçek, kare hızı, ölçülen süre) (Şekil 4).
Ca2+ mikro alan analizi için parametreler seçildikten sonra, boncuk temasını tanımlamak için her bir ölçüm için ikinci bir açılır pencere açılır (Şekil 5). Boncuk temasını tanımlamak için kullanıcı, kaydırıcıyı kullanarak tiff dosyasında manuel olarak gezinebilir ve boncuk temas çerçevesini tek tek seçebilir. Boncuk teması, boncuk temas yerine tıklanarak seçilir (Şekil 5, boncuk ve boncuk teması, sarı halka ve okla gösterilir) ve ayrıca hücre seçimi. Bu adım, ilgilenilen her hücre için tekrarlanmalıdır. Son olarak, otomatik görüntü işleme uygulanır ve sonuç verileri özetlenir ve bir elektronik tabloya kaydedilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig01.jpg"> Şekil 1: Görüntüleme için slayt hazırlama iş akışı. (A) İkinci bir cam kapak fişi kullanarak slayta hem BSA hem de PLL'yi ekleyin ve yayın. (B,C) Bir hazne inşa etmek için, kauçuk o-ringleri silikon gres kullanarak sürgünün üzerine yapıştırın. Haznenin uygun şekilde izole edilmesi için tüm halkanın ince bir yağ tabakası ile kaplandığından emin olun. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig02.jpg"> Şekil 2: Primer murin vahşi tip (WT) (A), P2x4-/- veya P2x7-/-(B) CD4+ T hücresinde T hücresi reseptörüne bağımlı Ca2+ mikro alanlarının temsili hücreleri. CD4 + T hücreleri negatif olarak izole edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi Fluo-4 ve Fura Red ile yüklendi. T hücreleri, DARTS boru hattı kullanılarak analiz edildi ve daha önce yayınlanmış sonuçlarla karşılaştırılabilir hücre görüntüleri elde edildi9. (A) WT birincil T hücresi, anti-CD3 / anti-CD28 kaplı boncuklarla stimülasyondan 1 saniye önce ve stimülasyondan 15 saniye sonra (ölçek çubuğu 5 μm) ve ayrıca boncuk temas bölgesinde 0 s ila 0,65 s arasında bir yakınlaştırmanın 3D yüzey çizimi (ölçek çubuğu 1 μm). (B) Üst şerit: temsili P2x4-/- birincil T hücresi, boncuk stimülasyonundan 1 saniye önce ve 15 saniye sonraya kadar. Alt şerit: temsili P2x7-/- birincil T hücresi, boncuk stimülasyonundan 1 saniye önce ve boncuk stimülasyonundan 15 saniye sonraya kadar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig03.jpg"> Şekil 3: TCR stimülasyonundan sonra temsili bir birincil insan T hücresinde Ca2+ mikro alanları. Birincil insan CD4 + T hücreleri, periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) buffy paltolardan floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile izole edildi ve yukarıda tarif edildiği gibi Fluo-4 ve Fura Red ile yüklendi. Şekil, anti-CD3 kaplı boncuklarla stimülasyondan 1 saniye önce ve stimülasyondan 15 saniye sonra (ölçek çubuğu 5 μm) birincil insan T hücresini ve ayrıca boncuk temas bölgesinde 6,25 sn ila 7,5 sn arasında bir yakınlaştırmanın 3D yüzey grafiğini göstermektedir (ölçek çubuğu 1 μm). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig04.jpg"> Şekil 4: DARTS grafik kullanıcı arayüzü (GUI). GUI dört alana ayrılmıştır. Giriş/Çıkış alanında, kaynak dizin ve görüntü yapılandırması (dosya başına iki kanal veya ayrı kanallar) ve sonuç dizini dahil olmak üzere ham veriler hakkında bilgi sağlamanız gerekir. Ölçümün Özellikleri alanında, deneyin ölçek (piksel başına mikron), kare hızı ve daha sonra belirlenen başlangıç noktasına göre ölçüm aralığı gibi tüm ilgili bilgileriyle açıklanması gerekir. Daha sonra, işlem sonrası adımlardan, şekil normalleştirmeden ve gerçek analizden (mikro alan algılama ve dart tahtası veri birikimi) oluşan bir işleme boru hattı monte edilebilir. Son olarak, ayarlar bilgisayara kaydedilebilir veya bilgisayardan yüklenebilir. Analiz ayarlandıktan sonra, devam etmek için Başlat'a tıklayın. Kurulum hakkında daha fazla bilgi edinmek için https://ipmi-icns-uke.github.io/DARTS/General/Usage.html ziyaret edin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67075/67075fig05.jpg"> Şekil 5: Boncuk kontaklarının manuel tanımı. Deney sırasında hücrelere boncuklar eklenirse, ilgilenilen bir hücre ile ilk boncuk temas süresi ve temas yeri manuel olarak tanımlanmalıdır. Bu, kaydırıcı ile çerçeveler arasında kaydırarak ve t zaman noktasında bir konum (x,y) bularak yapılır. Boncuk temas bilgileri alanını otomatik olarak doldurmak için kullanıcı, boncuk temas konumunda mikroskop görüntüsünün sol yarısına tıklar. Daha sonra, bir hücreyi boncuk temasıyla ilişkilendirmek için kullanıcı, hücre içinde boncuk kontağı olan bir konuma tıklar. Bilgiler, boncuk ekle seçilerek onaylanmalıdır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67075/67075fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Primer T Hücrelerinde İlk Ca2+ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Local, sub-second Ca2+ signals, termed Ca2+ microdomains, are highly dynamic and short-lived Ca2+ signals, which result in a global [Ca2+]i elevation and ...

imaging-initial-ca2-microdomains-in-primary-t-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Dolayısıyla, bu işe dahil olan proteinlerin mekansal ve zamansal davranışlarını incelemek için önemli sinyal anlamak için; plazma zarının içinde ya da hücre içi konumlara ya proteinlerin kompartımanlara büyük ölçüde sinyal sonuçlarını etkileyebilecek bir düzenleyici mekanizmadır. Burada T hücrelerinde sinyal iletimi çalışmak üzere bir TIRF mikroskopi tabanlı sistemi tanımlamak, ama genel olarak uygulanabilir.

Gerçek zamanlı, TCR Eşzamanlı Görüntüleme ve İlişkili Sinyal Proteinler için TIRF Mikroskopi Tekniği

Burada, Ca2+ göstergeleri ile yüklü sağlam memeli hücrelerinde floresan mikroskobu kullanarak yerel IP3 aracılı Ca2+ olaylarını görüntüleme tekniklerini ve bu olayların tanımlanmasını ve analizini otomatikleştiren bir algoritma sunuyoruz.

Görüntüleme Yerel Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Kültürlenmiş memeli hücrelerinde sinyaller

Adaptif bağışıklık, T hücreleri ile antijen sunan hücreler arasında oluşan dinamik 'immünolojik sinapslar' tarafından kontrol edilir. Bu protokol, endotel hücrelerinin hem az çalışılmış fizyolojik APC'ler hem de yeni bir 'düzlemsel hücresel APC modeli' türü olarak araştırılması için yöntemleri tanımlar.

Görüntüleme İmmünoloji Synapse Dynamics için bir Endotel Hücre Modeli Düzlemsel

enflamasyon bölgelerinde CD4 efektör T hücrelerinin geçiş motilite yöneten mekanizma nispeten bilinmemektedir. Biz görselleştirmek ve yerinde bu hücrelerin dinamik davranışının çalışması için izin iltihaplı kulak dermiş in vitro -astarlı CD4 T hücrelerinde işlemek için non-invaziv bir yaklaşım sunuyoruz.

Iltihaplı Dermisinde içinde görüntüleme CD4 + T hücre Geçiş Göç

T hücresi immünolojik sinapsında filamentli aktinin akış hızlarını ve yönlülüğünü araştırmak için, canlı hücre süper çözünürlüklü görüntüleme, toplam iç yansıma floresansı ile birleştirilir ve uzaysal-zamansal görüntü korelasyon spektroskopisi ile ölçülür.

Yapılandırılmış Aydınlatma Mikroskopi Verilerinin uzay-zamansal Görüntü Korelasyon Spektroskopisi nicel T Hücreleri kortikal Aktin Akışı

Bu makalede bir veya daha fazla plazma ve/veya zemin durumu tükenmesi (GSD) süper çözünürlük mikroskobu memeli hücrelerinde kullanarak hücre içi zar proteinleri tespiti için bir protokol özetlenmektedir. Burada, faydaları ve görselleştirme ve proteinlerin miktar için bu tür yaklaşımlar kullanarak konuları tartışmak.

Memeli hücrelerinde devlet tükenmesi süper kararlılık düşsel yer

Bu iletişim kuralı T lenfosit photoactivatable peptid-MHC, T hücre aktivasyonu hassas kronolojik zamanmekansal kontrol etkinleştirme kullanarak etkinleştirmek için bir görüntüleme tabanlı yöntemi açıklar.

T hücre aktivasyonu Photoactivatable Agonist kullanarak kayma ve Temporal kontrolünü

Protokol düzlemsel lipid bilayers kullanarak sinaptik arabirimleri oluşturmak için birincil poliklonal insan T hücreleri yeteneklerini çalışmaya bir teknik anlatılmaktadır. İnsan birincil T hücreler lenf düğümleri ve periferik kan elde fark synapse oluşumu yeteneğini göstermek için bu tekniği kullanın.

Periferik kan ve lenf dokusu birincil insan T hücre sinaptik arabirimi değerlendirilmesi

Bu protokolün amacı, canlı hücrelerdeki yüzey reseptör dinamiklerini dört boyutlu olarak görselleştirmek için Kafes Işık Sayfası Mikroskobu'nun nasıl kullanılacağını göstermektir. Burada CD4+ primer T hücrelerindeki T hücre reseptörleri gösterilmiştir.

Yüzey T-Hücre Reseptör Dinamiklerini Dört Boyutlu Olarak Kafes Işık Sayfası Mikroskobu Kullanarak Görselleştirme

Bu protokol hem immünolojik sinaps oluşumunu hem de sonraki polarize salgı trafiğini immünolojik sinapsa doğru görüntüler. Hücresel konjugates bir süperantijen-darbeli Raji hücre (bir antijen sunan hücre olarak hareket) ve Jurkat klonu (bir efektör yardımcı T lenfosit olarak hareket) arasında kuruldu.

İnsan İmmünolojik Sinaps Görüntüleme

T hücresi sinyalizasyonunun bir ölçüsü olan kalsiyum akışı, T hücresi reseptör stimülasyonuna verilen yanıtları analiz etmenin etkili bir yoludur. Hint-1'i hücre yüzey moleküllerine yönelik antikor panelleriyle çoklamak için kullanılan bu protokol, tam spektrumlu akış sitometrisinin son derece esnek yeteneklerinden yararlanır.

Primer Murin T-hücrelerinde T-hücresi Reseptörü Kaynaklı Kalsiyum Akışının Tam Spektrumlu Akış Sitometrisi ile Analizi

Öğrenin, primer fare ve insan T hücrelerinde Ca²⁺ mikro alanlarını floresan mikroskopi ile görüntüleme yöntemini. Bu protokol, bağışıklık hücrelerindeki kalsiyum sinyal yollarını incelemek için değerli bir araç sunar.

Primer T Hücrelerinde İlk Ca²⁺ Mikro Alanlarının Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet