Kardiyovasküler Biyobelirteç Keşfi için Plazma Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu, Karakterizasyonu ve Proteomik Analizi

Biyobelirteç olarak dolaşan hücre dışı veziküller, biyobelirteç araştırmalarında muazzam potansiyele sahip nispeten yeni bir alandır. Protokolümüz, bir acil servis ortamında hücre dışı vezikül bağlı biyobelirteç keşfi ve tespitini uygulamak için uygulamalı bir yaklaşım sağlamayı amaçlamaktadır. Ortaya çıkan kanıtlar, hücre dışı veziküllerde ve dolaşımda bulunan moleküler kargonun, çoklu hastalık bağlamlarında ilgilenilen proteinleri ve RNA'yı içerdiğini göstermiştir.

Birkaç yeni hücre dışı vezikül, kapalı biyobelirteçler, çeşitli kardiyovasküler hastalık antitelerinin tanı ve prognozu ile ilişkilendirilmiştir. Dolaşımdaki hücre dışı vezikül biyobelirteç keşfi alanındaki en büyük zorluklar, hücre dışı veziküllerin korunması ve EV salım dinamiklerine bağlı olarak plazma edinimidir. Bu nedenle, özellikle proteomik gibi geniş ölçekli analiz yöntemleri uygulanırken, EV bozulmasını önlemek ve tekrarlanabilir sonuçları korumak için klinik rutine gömülü katı bir protokol gereklidir.

Dolaşımdaki EV içinde yer alan protein biyobelirteçlerinin keşfi, büyük ölçüde semptom başlangıcına göre ilk kan alma zamanına ve doğal EV bozunmasına bağlı olarak numune saklama süresine bağlıdır. Bu protokol, bir acil servisin klinik iş akışına entegre edilmek üzere plazma EV izolasyonu ve proteomik analize giriş için uygulamalı bir protokol sunar. Gelecek araştırmamız, dekompanse kalp yetmezliği, aritmi veya taşikardi kardiyomiyopatisi olan hastaların yanı sıra baypas ameliyatı geçiren hastaların boylamsal çalışmaları da dahil olmak üzere farklı hasta gruplarını metodolojimize entegre etmeye odaklanacaktır.

Bu protokolü kullanarak, yukarıda bahsedilen patolojilerin tanı ve prognostiğine katkıda bulunan yeni EV'ye bağlı biyobelirteçleri tanımlamayı amaçlıyoruz. İnsan kan plazmasını santrifüjlemeye başlamak için, kırılmadan sabit açılı rotorlu bir ultra santrifüj kullanarak. Enkaz ve apoptotik cisim yerleştikten sonra, süpernatanı yeni bir tüpe aktarın ve hücre dışı vezikülleri izole etmek için kırılmadan dört santigrat derecede iki saat boyunca 100.000 G'de ultra santrifüjleyin.

Ultrasantrifüjlemeden sonra tüpü dikkatlice çıkarın. Elektronik bir pipet kullanarak, süpernatanı nazikçe aspire edin ve yaklaşık bir mililitre hücre dışı vezikül tükenmiş plazma bırakın. Hücre dışı vezikül peletini bozmadan kalan plazmayı dikkatlice pipetlemek için 1000 mikrolitrelik bir pipete geçin.

Plazma kalmadığından emin olmak için pipetleme sırasında tüpü kademeli olarak eğin ve peleti PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, izleme sırasında çerçeve başına 10 ila 100 nanopartikül arasında bir nihai sayım aralığı elde etmek için hücre dışı vezikül stok çözeltisini buz gibi soğuk PBS ile farklı oranlarda seyreltin. NTA cihazını açın ve bağlı bilgisayarda ilgili yazılımı başlatın.

Hazneyi lazer tabutuna yerleştirin ve etkinleştirmek için kamerayı başlat'a tıklayın. Bir şırıngaya bir mililitre PBS çekin ve ön tüpe bağlayın. Boru sistemini iyice yıkayın ve haznede hava kabarcığı kalmadığından emin olun.

Herhangi bir hava kabarcığı veya kirletici parçacık tespit etmek için kamerayı izleyin. Şimdi hazırlanan hücre dışı vezikül çalışma seyreltmesini bir mililitrelik bir şırıngaya çekin ve hazneye enjekte edin. Ekran kazancını monitörün parlaklığına uyacak şekilde ayarlamak için yakalama ve işleme sekmelerine gidin.

Ekrandaki nanopartikül farklılaşmasını geliştirmek için kamera seviyesini değiştirin. Parçacıkları arka plan gürültüsünden ayırt etmek için işlem sekmesinde uygun bir algılama eşiği ayarlayın. Nanopartiküller ekranda keskin görünene kadar cihazın her iki yanındaki odak tekerleğini kullanarak kamerayı odaklayın.

Donanım ayarlarında tüm ölçümler için 22 santigrat derece sabit bir sıcaklık ayarladıktan sonra, ölçümü başlatmak için çalıştır düğmesine tıklayın. Her örnek çalıştırması için her biri 30 saniyelik en az üç video kaydedin. Numune seyreltme faktörünü girmek için değiştir'e tıklayın ve son olarak sonuçları kaydetmek için dışa aktar'a tıklayın.

Nanopartikül izleme analizi kullanılarak, hücre dışı veziküller tanımlandı ve kek ve harekete dayalı olarak görselleştirildi. Analiz, sağlıklı bireylerden alınan plazmada mililitre başına 10 parçacığın gücü olan ortalama 1.2 çarpı 10 partikül konsantrasyonunu ortaya çıkardı ve hücre dışı veziküllerin varlığını gösterdi. Plazma hücre dışı veziküllerin ortalama boyutu, tipik hücre dışı vezikül boyutlarıyla tutarlı olarak 184.7 nanometrede ölçüldü.