Name: 3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: Öğrenin, 3D heterosferoid kültürler kullanarak tümör hücre istilasını in vitro analiz etme yöntemini. Bu protokol, kanser ve non-neoplastik hücre etkileşimlerini araştırmak için gelişmiş bir platform sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP 20/10544-1 ve 20/10664-7) tarafından desteklenmiştir. Bazı görüntüler BioRender.com kullanılarak oluşturulmuştur.

Birincil insan hücrelerinin kullanımı, Araraquara Diş Hekimliği Fakültesi - UNESP'nin Kurumsal İnsan Araştırmaları Etik Komitesi (CAAE 57895822.0.0000.5416) tarafından onaylanmıştır. Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. 3D hücre kültürü için hücrelerin hazırlanması
NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar bir laminer akış başlığı içinde gerçekleştirilmelidir.
<ol><li>Heterosferoidi oluşturacak hücrelerin tek hücreli süspansiyonlarını elde edin. NOT: Bu deneyde, OSCC hücre hattı (SCC9), fibroblastlar (dil kanseri biyopsilerinden elde edilen primer kanserle ilişkili fibroblast) ve monositlerden (sağlıklı donörlerden elde edilen primer monositler) oluşan sferoidler (bkz. adım 2) ürettik. Deneysel ilgi alanlarına göre hücre türünü seçin.</li>
	<li>Bir hemositometre ve tripan mavisi boyama kullanarak hücre sayısını ve canlılığını kontrol edin. NOT: Bu protokoldeki hücre oranı 5: 3: 2'dir (5.000 neoplastik: 3.000 fibroblast: 2.000 monosit), sferoid başına toplam 10.000 hücredir. Deneysel ilgi alanlarına göre oranı ve toplam hücre sayısını optimize edin.</li>
	<li>1.5 mL'lik tüplerdeki hücreleri, her hücre tipine uygun takviye edilmemiş ortamla ayrı ayrı seyreltin (ör., neoplastik hücreler için - DMEM / F12; fibroblastlar için - DMEM; monositler için - RPMI) oyuk başına 5.000 neoplastik hücre, oyuk başına 3.000 fibroblast ve oyuk başına 2.000 monosit veya mililitre başına 500.000 hücre. NOT: Deney için yeterli sayıda hücre sağlamak için, boyama ve santrifüjleme adımları sırasındaki olası kayıpları göz önünde bulundurarak gereken toplamdan daha fazlasını kullanın.</li>
	<li>Birkaç nesil boyunca canlı hücrelerde kalan farklı floresan hayati lekeler kullanarak farklı hücre tiplerini ayrı ayrı etiketleyin. Ortam içeren hücrelere optimize edilmiş floresan boya konsantrasyonları ekleyin (örneğin, neoplastik: CFSE - yeşil boya; fibroblast: CMTPX - kırmızı boya; monosit, Menekşe BMQC - mavi boya) ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edin. NOT: Kullanılacak konfokal mikroskobun özelliklerine göre spektral örtüşmeyi önlemek için farklı uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip floresan probları seçin.</li>
	<li>Bir hücre peleti oluşturmak için hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin. Ortamı 200 μL'lik bir pipet kullanarak aspire edin ve 1 mL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Bir hücre peleti oluşturmak için 5 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin ve kullanılan hücre tipine / hücre hattına göre 1 mL ek kültür ortamındaki toplam hücre sayısını yeniden askıya alın (ör., neoplastik - 100 μg / mL streptomisin, 100 IU / mL penisilin,% 10 (hacim) FBS ve 400 μg / mL hidrokortizon; fibroblast ve monositler - 100 μg / mL streptomisin, 100 IU / mL penisilin,% 10 (hacim) FBS). Mikroskopta floresan yoğunluğunu kontrol edin ve tripan mavisi boyama ile hücreleri sayın.</li>
</ol>2. 3D hücre kültürü
NOT: Bu çalışma, heterosferoidler oluşturmak için biyo-baskı manyetik alan yöntemi11'i kullanmıştır. Burada hücreler, biyouyumlu manyetik nanopartiküller kullanılarak manyetize edilir ve hafif manyetik kuvvetlere maruz bırakılır. Nanopartiküllerin hücrelere oranını hücre tipine göre optimize edin. Küresel kültürlerin oluşturulması için alternatif yöntemler de kullanılabilir. Bu bölümdeki adımları laminer bir akış başlığında gerçekleştirin.
<ol><li>20.000 hücreye 1 μL nanopartikül oranında manyetik nanopartiküller ekleyin ve 10 kez karıştırarak iyice yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücreleri 400 x g, oda sıcaklığında 5 dakika santrifüjleyin ve 10 kez karıştırarak tekrar askıya alın. Bu santrifüjleme/yeniden süspansiyon döngüsünü iki kez daha tekrarlayın. NOT: Mıknatıslanmış hücreler kahverengimsi renkli bir topak oluşturacaktır.</li>
	<li>Son santrifüjleme döngüsünü tamamladıktan sonra, ortamı aspire edin ve hücreleri oyuk başına 34 μL'de (34 μL / 5.000 neoplastik hücre; 34 μL / 3.000 fibroblast hücresi; 34 μL / 2.000 monosit hücresi) neoplastik hücreler için takviye edilmiş kültür ortamının (100 μg / mL streptomisin, 100 IU / mL penisilin ve% 5 (hacim) FBS içeren DMEM / F12). NOT: Kuyu boyutuna göre hacmi hesaplayın. Bu protokol, kuyu başına toplam 100 μL ortam olan 96 oyuklu plaka kullandı.</li>
	<li>Tüm hücreleri birlikte kültürleme için yeni bir tüpe karıştırın ve ardından yeniden askıya alın.</li>
	<li>100 μL ko-kültürlenmiş hücreleri, ultra düşük bir bağlantı plakasının her bir oyuğuna aktarın.</li>
	<li>Agregasyonu ve küresel oluşumu indüklemek için küresel tahrik manyetik alanını plakanın altına yerleştirin ve 3 saat boyunca inkübatöre (%5 CO2, 37 ° C) yerleştirin. NOT: Manyetik alana maruz kalma süresi, küresel boyuta veya bileşime göre değişebilir.</li>
	<li>Manyetik alanı çıkarın ve hücre dışı matris proteinlerinin ve hücreden hücreye/hücreden matrise etkileşimlerin üretilmesine izin vermek için plakayı en az 24 saat inkübatöre (%5 CO2, 37 ° C) yerleştirin.</li>
</ol>3. Hücre dışı matris kaplı mikro gözenekli zarın hazırlanması
NOT: Bu bölümdeki adımları laminer akış başlığında gerçekleştirin.
<ol><li>200 μL'lik bir uç kullanarak 24 oyuklu mikro gözenekli bir zarın merkezine ticari olarak temin edilebilen 50 μL hücre dışı matris ekleyin. NOT: Hücre dışı matrisi ıslak buz üzerinde tutun. Matrisi üstüne yerleştirirken mikro gözenekli zara dokunmayın.</li>
	<li>Steril bir iğne kullanarak kabarcıkları çıkarın ve matrisin tüm membran yüzeyini kapladığından emin olun.</li>
	<li>Hücre dışı matrisin jel oluşumuna izin vermek için zarı 1 saat inkübatöre (37 ° C) yerleştirin.</li>
</ol>4. İstila testi
NOT: Bu bölümdeki adımları laminer akış başlığında gerçekleştirin.
<ol><li>Kemoatraktan olarak mikro gözenekli zarın alt odasına fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 500 μL DMEM / F12 kültür ortamı ekleyin.</li>
	<li>Ortamı oluşturulan sferoidlerden dikkatlice çıkarın ve heterosferoidin üzerine nazikçe 50 μL/kuyu taze takviye edilmemiş DMEM/F12 ortamı ekleyin. NOT: Bu adım, biyo-baskı manyetik alan yöntemi için bir tutma sürücüsü kullanılarak gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>200 μL'lik düşük tutma ucunun kenarını steril bir makasla kesin. NOT: Ucun boyutu, sferoidin boyutuna bağlı olacaktır.</li>
	<li>Düşük tutma ucu ile küresel ve 50 μL ortamı toplayın. NOT: Sferoidin ayrılmasını önlemek için bu adımı yavaş ve dikkatli bir şekilde gerçekleştirin.</li>
	<li>Küreyi nazikçe hücre dışı matrisin üzerine yerleştirin. NOT: Jöleli hücre dışı matrise dokunmayın.</li>
	<li>Toplam 200 μL hacme ulaşmak için dikkatlice 150 μL takviye edilmemiş DMEM/F12 ortamını damla damla ekleyin.</li>
	<li>Plakayı 48 saat boyunca inkübatöre (% 5 CO2, 37 ° C) yerleştirin. NOT: Kuluçka süresi, hücre hattına veya protokole bağlı olarak değişebilir.</li>
</ol>5. Görüntü edinme
<ol><li>Görüntüleme için konfokal bir mikroskop kullanın.</li>
	<li>Mikroskobu, kullanılan hayati floresan boyaların uyarma ve emisyon özelliklerine göre ayarlayın (örneğin, CFSE boyası, 488 nm lazer ve 520 nm algılama dalga boyu; fibroblast: CMTPX boyası, 561 nm lazer ve 610 nm algılama dalga boyu; monosit, Violet BMQC boyası, 405 nm lazer ve 516 nm algılama dalga boyu).</li>
	<li>Plakayı mikroskop tablasına yükleyin.</li>
	<li>10x büyütmede parlak alanı kullanarak sferoidleri/hücreleri bulun.</li>
	<li>Yakınlaştırmayı 40x büyütmeye ayarlayın.</li>
	<li>Her floresan kanalı için lazer gücünü ve dedektör kazancını ayarlayın.</li>
	<li>Parlak alanı kullanarak membran gözeneklerini bularak Z-Stack başlangıç noktasını membran odak düzlemi olarak belirleyin.</li>
	<li>Parlak alan da dahil olmak üzere her kanal için z ekseni boyunca zarın altında üç görüntü ve zarın üzerinde beş ila sekiz görüntü yakalayın. Z ekseninde toplam 90-120 μm derinliği kapsayan görüntüler arasında 10 μm aralıklar olduğundan emin olun.</li>
	<li>Görüntüleri oluşturduktan sonra projeyi .czi uzantılı bir dosya olarak kaydedin.</li>
</ol>6. Görüntü çıkarma
NOT: Görüntü yazılımının kullanımı aşağıda açıklanmıştır.
<ol><li>Görüntü düzenleme yazılımını kullanarak .czi dosyasını açın (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Sağ üst köşedeki İşleniyor'a tıklayın, ardından Tek'i seçin. Ardından, Yöntem'e tıklayın ve Görüntü Dışa Aktarma'yı seçin.</li>
	<li>Giriş'in altında dosyayı seçin.</li>
	<li>Parametreler düğmesine tıklayın, ardından aşağıdaki ayarları seçin: Dosya türü (Etiketli Görüntü Dosyası Biçimi - . TIFF), Sıkıştırma (LZM), Yeniden Boyutlandır (0), Görüntü Eğrisi ve Kanal Rengi Uygula, Tek Tek Kanal Görüntüleri, Kanal Adlarını Kullan, Alt Kümeleri Tanımla (Kanal, tüm kanalları seç), Z-Konumu (tümünü çıkar), Bölge (Tam), Döşemeler (Seçili döşemeleri dışa aktar) ve Dışa Aktar (hedef dosyayı seçin). NOT: Birleştirilmiş kanal görüntülerini ayıklamak için aşağıdaki ayarları seçin: Dosya türü (Etiketli Görüntü Dosyası Biçimi - . TIFF), Sıkıştırma (LZM), Yeniden Boyutlandır (0), Görüntü Eğrisi ve Kanal Rengi Uygula, Birleştirilmiş Kanal Görüntüsü, Kanal Adlarını Kullan, Alt Kümeleri Tanımla (Kanal, kaplanacak belirli kanalları seçin), Z-Konumu (tümünü çıkar), Bölge (Tam), Döşemeler (Seçili döşemeleri dışa aktar) ve Dışa Aktar (hedef dosyayı seçin).</li>
	<li>Sağ üst köşede bulunan Uygula simgesine tıklayın. NOT: Bu adım, görüntüleri farklı kanallardan aynı anda dışa aktaracaktır.</li>
</ol>7. Görüntü analizi
NOT: Özgür yazılımın kullanımı bu adımda açıklanmıştır.
<ol><li>Sol üst köşedeki Dosya'ya tıklayın, Aç'ı seçin, resmi seçin ve ardından Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Analiz Et'e tıklayın, ardından Ölçümleri Ayarla'ya tıklayın ve Alan, Entegre Yoğunluk ve Ekran Etiketi'ni seçin. Tamam'a tıklayın.</li>
	<li>Analiz Et'e ve ardından Ölç'e tıklayın. NOT: Tüm görüntülerin alanının aynı olduğundan emin olun. "Entegre Yoğunluk" iki değer görüntüler: (1) Ham Entegre Yoğunluk (RawIntDen): Görüntüdeki tüm piksel değerlerinin toplamı; (2) Entegre yoğunluk (IntDen): ortalama gri değer ve alanın çarpımı. Görüntü RGB renginde olduğundan ve tüm görüntülerin alanı aynı olduğundan, floresan ölçüm değeri olarak RawIntDen kullanmayı düşünün. Görüntüler arasındaki floresan değerlerindeki (yoğunluk ve miktar) farklılıklar, hücre istilası ve proliferasyon yoğunluğundaki değişiklikleri gösterebilir. Farklı hücre tiplerinin ko-kültürlerini kullanarak hücre dışı matriksteki mikro gözenekli zara doğru invazyon modelini normalleştirmenin başka bir yöntemi, RawIntDen değerlerinin oranını hesaplamaktır: Oran RawIntDen =<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67114/67114eq01.jpg" style="margin: auto;"> 1 oranı, söz konusu belirli hücre tipi için hücrelerin en yüksek istilası/lokalizasyonu ile z ekseni boyunca görüntüyü/konumu temsil eder.</li>
</ol>

Kanser Biyolojisinde 3 Boyutlu Modeller: Heterosferoidlerde İnvazyon Dinamiği

<ol><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+metastasis%3A+Mechanistic+insights+and+clinical+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Tumor metastasis: Mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3, 362-374 (2003).</li>
<li>Friedl, P., Alexander, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+invasion+and+the+microenvironment%3A+Plasticity+and+reciprocity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer invasion and the microenvironment: Plasticity and reciprocity.</a> Cell. 147 (5), 992-1009 (2011).</li>
<li>Wu, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+cancer+cell+invasion%3A+Patterns+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Transl+Oncol%22%5BJournal%5D)">Plasticity of cancer cell invasion: Patterns and mechanisms.</a> Transl Oncol. 14 (1), 100899(2021).</li>
<li>Pijuan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration%2C+invasion%2C+and+adhesion+assays%3A+From+cell+imaging+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 1-16 (2019).</li>
<li>Nagy, ÁG., Székács, I., Bonyár, A., Horvath, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+automatic+monitoring+of+cancer+cell+invasion+into+an+epithelial+monolayer+using+label-free+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Simple and automatic monitoring of cancer cell invasion into an epithelial monolayer using label-free holographic microscopy.</a> Sci Rep. 12 (1), 1-13 (2022).</li>
<li>Kramer, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 752 (1), 10-24 (2013).</li>
<li>Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+migration+and+invasion+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro cell migration and invasion assays.</a> J Vis Exp. (88), e51046(2014).</li>
<li>Kapałczyńska, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+cultures+-+A+comparison+of+different%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell cultures - A comparison of different.</a> Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2016).</li>
<li>Cacciamali, A., Villa, R., Dotti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+cultures%3A+Evolution+of+an+ancient+tool+for+new+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">3D cell cultures: Evolution of an ancient tool for new applications.</a> Front Physiol. 13, 1-15 (2022).</li>
<li>Trindade, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+3D+cell+culture+State+of+the+art+and+current+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Magnetic 3D cell culture State of the art and current advances.</a> Life Sci. 286, 1-8 (2021).</li>
<li>Han, S. J., Kwon, S., Kim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Challenges+of+applying+multicellular+tumor+spheroids+in+preclinical+phase%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Challenges of applying multicellular tumor spheroids in preclinical phase.</a> Cancer Cell Int. 21 (1), 1-19 (2021).</li>
<li>Lin, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cancer+cell+invasion+and+T-cell+cytotoxicity+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Monitoring cancer cell invasion and T-cell cytotoxicity in 3D culture.</a> J Vis Exp. (160), e61392(2021).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Üç boyutlu sferoid kültürleri, hücre biyolojisinin çeşitli yönlerini araştırmak için güçlü bir yaklaşımdır. Bu çalışmada, tümör mikroçevresini taklit eden heterosferoidler kullanılarak neoplastik hücre invazyonunun değerlendirilmesi için çok katmanlı ve daha dinamik bir yaklaşım sunan bir protokol sunulmuştur. Bu yöntem, neoplastik olmayan stromal hücrelerin varlığında ko-lokalizasyon ve invazyon paternlerinin değerlendirilmesine izin verir.
Dikkate alınması gereken bazı kritik adımlar vardır....

İstila, neoplastik hücrelerin hücre dışı matriks yoluyla çevredeki dokuya 1,2 göç ettiği bir süreçtir. Tümör ilerledikçe, neoplastik hücreler giderek daha karmaşık mikro ortamlara maruz kalır. Tümör mikroçevresi, hücre dışı matriksin çeşitli bileşenlerini ve neoplastik olmayan hücre tiplerini içerir. Fibroblastlar ve yerleşik makrofajlar dahil olmak üzere stromal hücreler, hücre dışı matriks bileşenlerini ve büyüme faktörlerini ve sitokinleri salgılayarak mikro çevreyi yeniden şekillendirir ve bu da neoplastik hücre fonksiyonlarını etkiler3. Stromal ve sızan lökosit hücreleri ayrıca neoplastik hücrelerle, birbirleriyle ve üç boyutlu bir mikro ortamda hücre dışı matrisle doğrudan etkileşime girer. Toplamda, TME bileşimi neoplastik hücre istilasının etkinliğini ve modelinietkiler 4.
Tümör mikro çevresinin karmaşık doğası, tümör dokusu içindeki hücreler arası etkileşimleri anlamak için etkili metodolojilerin uygulanmasını gerektirir. İnvazyonu değerlendirmek için kullanılan in vitro testlerin çoğu, esas olarak geleneksel 2D modellerde ve/veya tek hücre tipi kültürlerde 5,6,7,8 gerçekleştirilmiştir, bu da karmaşık invazyon sürecini aşırı basitleştirir ve doku mimarisinin olmaması, stromal bileşenler ve in vivo tekrarlanabilirlik gibi çoklu sınırlamalara sahiptir. Sferoid kültürler, tümör kütle morfolojisini taklit eden, fiziksel ve biyokimyasal özellikleri içeren hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerine izin veren bir in vitro 3D kültür modelini temsil eder9. 3D kültür modellerinin kullanımı son on yıllarda artmıştır ve tedaviye yanıt, hücre morfolojisi ve gen ekspresyonu gibi çeşitli biyolojik sonuçların 2D model 9,10 ile karşılaştırıldığında farklı olduğuna dair kanıtlar vardır.
Bu protokol, 3D sferoid hücre kültürü kullanılarak bir insan hücre dışı matrisinde in vitro invazyonu değerlendirmek için bir yöntemi göstermektedir. Ayrıca, neoplastik hücreler, fibroblastlar ve monositlerden oluşan heterosferoidleri, tümör mikroçevresini iki ilgili neoplastik olmayan hücre tipi ile taklit etmek için kullandık. Hücrelerin mikro gözenekli bir zara doğru farklı istila düzlemleri boyunca konfokal mikroskopi ile görüntülenmesi, bu sürecin daha dinamik ve çok katmanlı bir bağlamda görselleştirilmesini sağlar.

<table><tbody><tr><td>96 Kuyulu Biyobaskı Kiti</td><td>Greiner Bio-one</td><td>&nbsp; 655840</td><td>Küresel sürücü manyetik alanı. Sürücüyü tutmak. 96 kuyulu mikroplaka, hücre itici yüzey</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Hücre Proliferasyon Kiti</td><td>İnvitrojen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Kırmızı CMTPX</td><td>Invitrogen, ThermoFisher Scientific</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Menekşe BMQC Boya</td><td>İnvitrojeni, Thermo Fisher</td><td>C10094</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Myogel doi ile hücre dışı matris</td><td>: 10.1186 / s12885-015-1944-z</td><td></td><td>Miyojel (2.4 mg / mL), kollajen (0.8 mg / mL) ve takviye edilmemiş neoplastik hücre ortamından oluşan karışım;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>12657-029</td><td></td></tr><tr><td>Hidrokortizon</td><td>Sigma</td><td>H088</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Ulusal Sağlık</td><td></td> Enstitüleri <td>Yazılım</td></tr><tr><td>Nanoshuttle-PL</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657841</td><td>Manyetik nanopartikül</td></tr><tr><td>İğnesi 23 G</td><td>Medix</td><td>AHMD004</td><td>25 x 0,60 mm (23 G x 1)</td></tr><tr><td>PBS pH 7,2 (1x)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>2012-027</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (5.000 U/mL)</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Uçları</td><td>Axygen, Corning Inc.</td><td>TF-200-L-R-S</td><td>Bariyerli (filtreli) pipet ucu, 200 & L Düşük Tutma Filtresi, kısa, maksimum geri kazanım</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>31800-022</td><td></td></tr><tr><td>TransWell 24 kuyu</td><td>Costar, Corning Inc.</td><td>3422</td><td>Transwell Geçirgen Destekler 6,5 mm Uç, 24 oyuklu plaka; 0.8 ve mikro; m Polikarbonat Membran</td></tr><tr><td>Zen 3.4 (mavi baskı)</td><td>Zeiss Group</td><td></td><td>Yazılımı</td></tr></tbody></table>

3d kültürlerin İn vitro hücre İnvazyonunu analiz etmek İçin alternatif strateji

Alternative Strategy to Analyze In Vitro Cell Invasion of 3D Cultures

Küresel kültür, geleneksel iki boyutlu (2B) kültürlere kıyasla in vivo mikro ortamın gelişmiş bir replikasyonunu sağlayan bir 3B modeldir. İnvazyon, kanser biyolojisinde son derece ilgi çekici bir hücresel sonuçtur. Bu protokolde, oral skuamöz hücreli karsinom (OSCC), kanserle ilişkili fibroblastlar (CAF) ve monositlerden oluşan heterosferoidleri kullanarak in vitro kanser hücresi invazyonunu değerlendirmek için alternatif bir strateji geliştirdik. Bu heterosferoidler, kanser hücrelerinin yanı sıra iki ilgili neoplastik olmayan hücre tipi de dahil olmak üzere tümör mikroçevresini (TME) taklit etmeyi amaçlar. Her hücre tipi, sferoid oluşumundan önce farklı dalga boylarında yayılan hayati floresan belirteçlerle etiketlendi. Bir kez oluşturulduktan sonra, heterosferoidler, mikro gözenekli bir zarın üst bölmesinde insan leiomyomundan türetilmiş hücre dışı matrisin bir tabakasına ekildi. İnvazyon, konfokal mikroskopi kullanılarak z ekseninde değerlendirildi. Z ekseninde 90 μm'lik bir derinliği kapsayacak şekilde 10 μm aralıklarla karşılık gelen floresan kanallarında dijital görüntüler elde edildi. Analiz, her görüntüdeki ve floresan kanalındaki entegre floresan yoğunluğu hesaplanarak ücretsiz görüntü yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Bu yaklaşım, çok katmanlı bir bağlamda hücre istila modellerinin daha dinamik bir analizinin yanı sıra, istila sırasında farklı hücre tiplerinin mekansal birlikte lokalizasyonunun incelenmesini sağlar.

Bu çalışma, farklı hücre tiplerinden oluşan sferoidler kullanılarak in vitro hücre invazyonunu değerlendirmek için alternatif bir yöntem sunmaktadır. Hücre invazyon paternlerinin çok katmanlı bir bağlamda analiz edilmesini ve invazyon sırasında hücre ko-lokalizasyon dinamiklerinin incelenmesini sağlar (Şekil 1).
Parlak alan görüntüleri, koyu/siyah aglomeralarla tanımlanan sferoid/hücre lokalizasyonunu temsil eder (Şekil 2A). ...

İstila, kanserin gelişiminde ve ilerlemesinde önemli bir biyolojik olgudur. Bu süreç, neoplastik olmayan hücreler ve tümör mikroçevresinin bileşenleri tarafından etkilenir. Bu çalışmanın amacı, üç boyutlu (3D) kültürler kullanarak in vitro olarak tümör hücresi istilasını analiz etmek için alternatif bir yöntemi tanımlamaktır.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Spheroid culture is a 3D model that provides an improved replication of the in vivo microenvironment compared to traditional two-dimensional (2D) ...

alternative-strategy-to-analyze-in-vitro-cell-invasion-of-3d-cultures

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

Üç boyutlu hücre dışı matriks içine tümör hücresi invazyonu modelleri daha iyi...

Modelleme ve Görüntüleme 3-Boyutlu Toplu Hücre Invasion

Bu videoda, tümör hücresi istilasını incelemek için doğal bir matris kullanma tekniği açıklanmaktadır. Bu tahlilde kullanılan teknik, epitelyal-mezenkimal hücre etkileşimlerini sentetik veya yabancı bir matrise ihtiyaç duymadan 3 boyutlu bir ortamda değerlendirme yeteneği sağlar.

Tümör Hücresi İnvazyon Testi: Epitelyal-mezenkimal Hücre Etkileşimlerini Değerlendirmek için 3D İn Vitro Native Matris Tabanlı Bir Yöntem

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

Bu video makalesinde, kanser hücresi istilasını yönlendirmede hormonların, sitokinlerin ve/veya büyüme faktörlerinin rolünü incelemek için modifiye edilmiş bir in vitro yöntem açıklanmaktadır.

Bir Modifiye<em&gt; In vitro</em&gt; Invasion Deneyi Hormonlar, Açan Kanser Hücre Invasion Sitokinlerin ve / veya Büyüme Faktörleri Potansiyel Rolü belirlemek için

Çevredeki normal dokuların invazyonu, malign tümörlerin tanımlayıcı bir özelliğidir. Burada, bir dizi ileri insan kanseri modeliyle örneklenmiş doğal bir 3D biyomatrise basit, yarı otomatik bir mikro plaka istila testi sunuyoruz.

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

Bu yöntem, kanser hücresinin sferoidlerden çevredeki bir 3B matrise invazyonunu değerlendirir.  Sferoidler, asılı damla kültürü yöntemi ile üretilir ve daha sonra bazal membran malzemeleri ve tip I kollajenden oluşan bir matrise gömülür.  Spheroidlerin istilası daha sonra izlenir.

Bir Kanseri Hücre Sfero Testi 3D ortamda Invasion Değerlendirmek için

Bu iletişim kuralı hücreleri hücre microenvironment koruma sırasında bir üç boyutlu ortamda göç ve işgal yeteneklerini ölçmek için kullanılabilir bir ters dikey işgali tahlil açıklar. Bu tahlil nadir ve/veya hassas hücreler için uygundur.

Yukarı doğru hareket: Bir basit ve esnek Vitro üç boyutlu işgali tahlil iletişim kuralı

Geçerli protokol kanser hücre göç ve gerçek zamanlı olarak tek bir platformda işgali araştırma, kolayca tekrarlanabilir ve zamanı verimli bir seçenek hücre hareketlilik ve morfoloji çalışmaya sağlayan entegre bir yöntemini açıklar.

Otomatik bir canlı hücre Imager kullanarak basit geçiş/işgali iş akışı

Sunulan yaklaşım aynı anda 3D spheroid tahliller ve T-hücre sitotoksisite kanser hücresi invazyonu değerlendirir. Spheroids bir iskele-free agarose multi-microwell döküm oluşturulur. Eş-kültür ve tip I kollajen matris gömme kanser hücresi invazyonu ve T-hücre aracılı sitotoksisite izlemek için izin veren aynı cihaz içinde gerçekleştirilir.

3D Kültürde Kanser Hücre İstilası ve T-Hücre Sitotoksisitesi İzleme

Öğrenin, 3D heterosferoid kültürler kullanarak tümör hücre istilasını in vitro analiz etme yöntemini. Bu protokol, kanser ve non-neoplastik hücre etkileşimlerini araştırmak için gelişmiş bir platform sunar.

3D Kültürlerin İn Vitro Hücre İnvazyonunu Analiz Etmek İçin Alternatif Strateji

Daha fazla video keşfet