Name: DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Keşfedin, oransal FRET analizi ile DNaz aktivitesini hassas bir şekilde tespit etmeyi ve pH, sıcaklık gibi deney koşullarının enzim aktivitesi üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı değerlendirmeyi.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol><li>A guide to ratiometric fluorescence. , AZoM. 
 <a target="_blank" href="https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081">https://www.azom.com/article.aspx?ArticleID=16081</a> (2018).</li>
<li>Müller, S. M., Galliardt, H., Schneider, J., Barisas, B. G., Seidel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+F%C3%B6rster+resonance+energy+transfer+by+monitoring+sensitized+emission+in+living+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantification of Förster resonance energy transfer by monitoring sensitized emission in living plant cells.</a> Front Plant Sci. 4, 413(2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+fluorescence+spectroscopy%22">Principles of fluorescence spectroscopy</a>. , Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Chai, H., Tang, Y., Guo, Z., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+electrochemical+switch+for+circulating+tumor+DNA+through+recycling+activation+of+blocked+DNAzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Ratiometric electrochemical switch for circulating tumor DNA through recycling activation of blocked DNAzymes.</a> Anal Chem. 94 (6), 2779-2784 (2022).</li>
<li>Liu, G., Ma, X., Tang, Y., Miao, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ratiometric+fluorescence+method+for+ctDNA+analysis+based+on+the+construction+of+a+DNA+four-way+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Ratiometric fluorescence method for ctDNA analysis based on the construction of a DNA four-way junction.</a> Analyst. 145 (4), 1174-1178 (2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoblinker%3A+Brownian+motion+powered+bio-nanomachine+for+FRET+detection+of+phagocytic+phase+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Nanoblinker: Brownian motion powered bio-nanomachine for FRET detection of phagocytic phase of apoptosis.</a> PLoS One. 9 (9), e108734(2014).</li>
<li>Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Express+FRET+labeling+and+analysis+of+phagocytic+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Express FRET labeling and analysis of phagocytic clearance.</a> Methods Mol Biol. 1644, 3-11 (2017).</li>
<li>Domingo, B., Sabariegos, R., Picazo, F., Llopis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+FRET+standards+by+steady-state+fluorescence+and+lifetime+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">Imaging FRET standards by steady-state fluorescence and lifetime methods.</a> Microsc Res Tech. 70 (12), 1010-1021 (2007).</li>
<li>Lee, M. H., Kim, J. S., Sessler, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule-based+ratiometric+fluorescence+probes+for+cations%2C+anions%2C+and+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Small molecule-based ratiometric fluorescence probes for cations, anions, and biomolecules.</a> Chem Soc Rev. 44 (13), 4185-4191 (2015).</li>
<li>Torriglia, A., Leprêtre, C., Padrón-Barthe, L., Chahory, S., Martin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+L-DNase+II+activation+and+function+as+a+molecular+switch+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of L-DNase II activation and function as a molecular switch in apoptosis.</a> Biochem Pharmacol. 76 (11), 1490-1502 (2008).</li>
<li>Padron-Barthe, L., Leprêtre, C., Martin, E., Counis, M. F., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+modification+of+serpins+transforms+leukocyte+elastase+inhibitor+into+an+endonuclease+involved+in+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conformational modification of serpins transforms leukocyte elastase inhibitor into an endonuclease involved in apoptosis.</a> Mol Cell Biol. 27 (11), 4028-4036 (2007).</li>
<li>Torriglia, A., Martin, E., Jaadane, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hidden+side+of+SERPINB1%2Fleukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The hidden side of SERPINB1/leukocyte elastase inhibitor.</a> Semin Cell Dev Biol. 62, 178-186 (2017).</li>
<li>Torriglia, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((L-DNase+II%2C+a+molecule+that+links+proteases+and+endonucleases+in+apoptosis%2C+derives+from+the+ubiquitous+serpin+leukocyte+elastase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">L-DNase II, a molecule that links proteases and endonucleases in apoptosis, derives from the ubiquitous serpin leukocyte elastase inhibitor.</a> Mol Cell Biol. 18 (6), 3612-3619 (1998).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. (32), e1485(2009).</li>
<li>Lauková, L., Konečná, B., Janovičová, Ľ, Vlková, B., Celec, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxyribonucleases+and+their+applications+in+biomedicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deoxyribonucleases and their applications in biomedicine.</a> Biomolecules. 10 (7), 1036(2020).</li>
<li>Minchew, C. L., Didenko, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+detection+of+nucleolytic+and+proteolytic+markers+of+lysosomal+cell+death%3A+DNase+II-type+breaks+and+cathepsin+D%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual detection of nucleolytic and proteolytic markers of lysosomal cell death: DNase II-type breaks and cathepsin D.</a> Methods Mol Biol. 1554, 229-236 (2017).</li>
<li>Nucleases (DNases and RNases). , Sigma-Aldrich. 
 <a target="_blank" href="https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases">https://www.sigmaaldrich.com/US/en/products/protein-biology/proteins-and enzymes/nucleases</a> (2025).</li>
<li>Altairac, S., Zeggai, S., Perani, P., Courtois, Y., Torriglia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+induced+by+Na%2B%2FH%2B+antiport+inhibition+activates+the+LEI%2FL-DNase+II+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Apoptosis induced by Na+/H+ antiport inhibition activates the LEI/L-DNase II pathway.</a> Cell Death Differ. 10 (5), 548-557 (2003).</li>
<li>Li, J. J., Geyer, R., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+molecular+beacons+as+a+sensitive+fluorescence+assay+for+enzymatic+cleavage+of+single-stranded+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Using molecular beacons as a sensitive fluorescence assay for enzymatic cleavage of single-stranded DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (11), E52(2000).</li>
<li>Ma, C., Tang, Z., Huo, X., Yang, X., Li, W., Tan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+monitoring+of+double-stranded+DNA+cleavage+using+molecular+beacons%5BTitle%5D)+AND+%22Talanta%22%5BJournal%5D)">Real-time monitoring of double-stranded DNA cleavage using molecular beacons.</a> Talanta. 76 (2), 458-461 (2008).</li>
</ol>

Oransal floresan yaklaşımı, yalnızca tek bir sinyalin 1,2 yoğunluğuna güvenmek yerine floresan sinyallerinin oranlarını kullanan analitik bir yöntemdir. Oranları kullanmanın avantajı, dahili kalibrasyon sağlamaları ve numune ve prob konsantrasyonlarındaki değişiklikler, cihaz parametreleri vb. gibi birçok rastgele faktörü telafi etmeleridir. Bu, floresan probların doğruluğunu ve hassasiyetini artırır.
Förster rezonans enerji transferi (FRET) problarının özel bağlamında, "ratiometric" terimi, ölçümün FRET donör ve alıcı florofor çiftinden gelen iki emisyon sinyalinin oranına dayandığı gerçeğini ifade eder. Hedef analitin aktivitesini ölçmek için, oransal FRET probları, alıcı/verici emisyon yoğunluklarının oranını (veya bazı durumlarda ters çevrilmiş verici/alıcı oranını) kullanır. Oran doğrudan FRET verimliliği ile ilgilidir. Arka plan gürültüsünü en aza indiren ve aydınlatma koşullarındaki ve prob konsantrasyonundaki değişiklikleri hesaba katan kendi kendini normalleştiren bir mekanizma sağlar3.
Oransal yöntemin son zamanlardaki ilginç uygulamaları arasında, dolaşımdaki tümör DNA'sının (ctDNA) saptanması için oransal elektrokimyasal biyosensörlerde4,5, apoptozun fagositik fazının FRET tespiti için Brown hareketle çalışan biyo-nanomakinelerde kullanılması ve FRET etiketlemesi ve fagositik klerens7'nin analizi yer almaktadır. Bu çalışmada açıklanan oransal FRET yaklaşımı, DNaz aktivitesinin kantitatif değerlendirmesi için yararlıdır. Tahlil ölçümleri, FRET çifti emisyonlarının oranlarına dayanmaktadır. Küçük ve yavaş DNA bölünmesini bile tespit etme kabiliyeti nedeniyle, tahlil özellikle daha uzun gözlem süreleri gerektiren zayıf nükleolitik aktivitenin araştırılması ve farklı pH seviyelerinde deneyler için çok uygundur.
Burada, ratiometrik FRET testinin bazı spesifik avantajları, zayıf bir nükleaz-lökosit elastaz inhibitörünün (LEI) DNaz aktivitesini incelemek için uygulanmasıyla gösterilmektedir. Rapor, adım adım talimatlar içeren ayrıntılı bir protokol ve oransal veri analizinin bir açıklamasını içerir.
Oransal FRET probu açıklaması
Oransal FRET probu, FAM-TAM'ın (Floresein-Tetrametilrodamin) donör-alıcı FRET çiftini taşıyan, kendi kendini tamamlayan bir 38-mer DNA oligosudur. Sırası 5'-AAGGGT(TAM) CCTGCTGCAGGACCCTTAACGCATTATGCGT(FAM)T-3' şeklindedir. Kendiliğinden hibridize olan 38-mer, iki floroforunu birbirinden 23.8 şkonumlandıran 23 ve 15 nükleotidlik iki bağlantılı saç tokası içeren zımba şeklinde bir konformasyon varsayar. Bu, bu çift için Förster yarıçapından önemli ölçüde daha yakındır, R0 = 55 Å8. Bu tür bir konumlandırma, vericiden alıcıya çok yüksek bir enerji transferi verimliliğine karşılık gelir7: EFRET = 0.993477. Sonuç olarak, FAM uyarma dalga boyunda (488 nm) aydınlatıldığında, FRET probu, alıcı TAM'ın (580 nm) emisyon dalga boyunda floresan yayarken, FAM emisyonu (525 nm) bastırılır.
Şekil 1A , sıkı eğrilikten kaynaklanan sterik engel nedeniyle her iki saç tokası tepesinde küçük halkalar ile probun UNAFold tarafından tahmin edilen ikincil yapısını göstermektedir. FRET probu ile DNA kırılması tespitinin şeması Şekil 1B'de sunulmuştur. Oligoprobun bir DNaz tarafından kırılmasının FRET çiftini ayırdığını gösterir. Bu ayırma, probdaki her iki floroforun emisyon spektrumlarında ciddi değişiklikler üretir. Şekil 1C , bölünmeden önce ve sonra prob emisyon spektrumlarını sunar ve DNase II prob bölünmesinden sonra FRET çiftinin bölünmesinin 525 nm'de (ID 525 nm) donör emisyonunu artırdığını ve aynı anda 580 nm'de (IA 580 nm) alıcı emisyonunu azalttığını gösterir. Şekil 1D , emisyon spektrumlarına karşılık gelen PAGE jel ve FRET oranlarını göstermektedir. DNase II prob bölünmesi, 12-16-mer FAM (yeşil) ve 20-24-mer TAM (kırmızı) fragmanlarına karşılık gelen iki geniş bant üretti, bu da saç tokaları arasındaki bağlantı alanının yakınında T23'ün her iki tarafında 38-mer'in rastgele kesildiğini gösteriyor.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5.jpg"> 
Şekil 1: Oransal FRET probunun yapısı ve çalışması. (A) UNAFold tarafından oluşturulan FRET probunun tahmin edilen ikincil yapısı. (B) Çalışan FRET probunun şematik gösterimi. Oransal FRET probu, 23,8 Å'lik etkili bir FRET mesafesinde bir FRET donörü (FAM) ve alıcısı (TAM) ile etiketlenmiş zımba şeklinde bir 38 mer oligonükleotiddir ve %&gt;99 FRET verimliliği sağlar. Oligoprobun bir DNaz tarafından bölünmesi, FRET çiftini ayırarak FRET'i ortadan kaldırır. (C) DNase II aracılı bölünmeden önce ve sonra FRET probunun emisyon spektrumları. Bölünmeden önce, FAM emisyonu baskılanır ve TAM emisyonu belirgindir. DNaz aracılı bölünme, FAM ve TAM'ı ayırır, FAM emisyonunu geri yükler (525 nm tepe noktası) ve TAM emisyonunu (580 nm düşüş) ortadan kaldırır. λuyarılma = 488 nm. (D) DNase II bölünmesinden önce ve sonra FRET probunun oransal ve elektroforetik değerlendirmesi. Üst panel: FRET oranları (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm), prob durumunun kantitatif bir ölçüsünü temsil eder. Kırmızı: ayrılmamış; yeşil: DNase II bölünmüş. Alt panel: Florometrik verilere karşılık gelen denatüre edici PAGE jeli. DNase II bölünmesi, FAM etiketli fragmanlar (12-16 nt, yeşil) ve TAM etiketli fragmanlar (20-24 nt, kırmızı) verir, bu da T23'ü çevreleyen saç tokaları arasındaki bağlantıya yakın bölünmeyi gösterir. Ayrılmamış kontrol sarı floresan gösterir. Merdiven: 38-mer probunun 5' ve 3' segmentlerine karşılık gelen FAM ve TAM etiketli oligonükleotidler, orijinal konumlarında floresan etiketlerle birlikte. Reaksiyon koşulları: 10 mM sodyum asetat tamponu (pH 5.2), 1 pmol/μL FRET probu, 0.0033 U/μL DNaz II, 37 °C'de 24 saat. RD/A = ID 525 nm/IA 580 nm; λuyarılma = 488 nm. UNAFold koşulları: 1 μM FRET probu, 10 mM Na+, 0 mM Mg2+, 37 °C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67134/67134fig1v5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bireysel test emisyon spektrumlarındaki değişiklikler açık olsa da, çok sayıda emisyon spektrumu arasındaki nicel karşılaştırmalar daha kullanıcı dostu ve kompakt bir nicel parametre gerektirir. Bu rol FRET oranı tarafından oynanır. Sunulan floresan yöntemi, kantitatif değerlendirmeleri için FRET çifti üyelerinin floresan emisyonlarının doğrudan (iki kanallı) oranlarına dayanan bir grup oransal yaklaşıma aittir 2,9.
Yaklaşım, FRET verimliliği ile ilgili olan ve 38-mer'in durumunu (kırık veya sağlam) kantitatif olarak karakterize eden donör/alıcı emisyonlarının oranını (RD/A = ID 525 nm / IA 580 nm) kullanır. ID / IA oranı, prob konsantrasyonu, uyarma yoğunluğu ve foto ağartma3 gibi faktörlerdeki varyasyonları doğal olarak açıklayan kendi kendini normalleştiren bir mekanizma sağlar. Yaklaşım, yalnızca oranlarının bilindiği ve sabit olduğu, aynı prob içinde bağlı verici ve alıcıya sahip FRET probları için uygundur. Bu nedenle, yaklaşımın ne alıcının ne de vericinin karışmasının doğrudan uyarılmasını dikkate alması gerekmez2. Probun sabit verici-alıcı stokiyometrisi, verici/alıcı emisyon oranlarının bu varyasyonlardan etkilenmemesini ve probun durumunu doğrudan yansıtmasını sağlar. Sonuç olarak, verici-alıcı emisyonlarının oranı, yerleşik sinyal normalizasyonu 2,3 ile kantitatif bir DNA bölünme parametresi sağlar.
Tahlil, ID / IA oranını kullanır (zıt I A / ID oranı yerine), çünkü bu oran prob bölünmesinden sonra FRET kesilmesini tanımlar ve bu nedenle, artan bölünme ile DNaz aktivitesinin artmasıyla aynı yönde değişir. Bu, her ikisi de Şekil 1C'deki spektrumlara karşılık gelen, oransal probun FRET oranını ve DNaz II tarafından bölünmesinden önce ve sonra PAGE elektroforezini gösteren Şekil 1D ile gösterilmiştir. Oransal FRET testinin rahatlığını, zaman ekonomisini ve kullanım kolaylığını göstermek için, zayıf bir nükleaz-lökosit elastaz inhibitörünün (LEI) DNaz aktivitesini ortaya çıkarmak ve incelemek için uygulanmıştır.
Zayıf nükleaz LEI
Proteaz inhibitörü LEI doğal olarak yarı kararlıdır, yani topolojik olarak dengesizdir. Bu özellik, inhibitör mekanizması için gereklidir. Hedef proteazı LEI reaktif bölge döngüsünü (RSL) parçaladığında, proteaz inhibitör molekülü ciddi bir konformasyonel değişikliğe uğrar ve proteazı mekanik olarak inaktif bir formagerer 10,11. Dikkat çekici bir şekilde, bu aynı zamanda LEI molekülünün kendisini kırar ve şişirir ve yerel kıvrımıyla kaplı şifreli bir DNaz bölgesinin maskesini çıkarır, böylece LEI'yi aktif bir endonükleaz L-DNaz II'ye (LEI'den türetilmiş DNaz II) dönüştürür11,12. Kriptik DNaz bölgesi, sülfürik asit10,13 içinde pH 2'de gece boyunca inkübe edilmesinin neden olduğu LEI'nin denatürasyonu ve kırılması ile de açığa çıkabilir. LEI'yi incelemek için bu FRET testinin kullanılması, LEI'nin gizli nükleolitik aktivitesini maskelemek için sert kimyasal denatürasyon işlemlerinin ve hedeflenen enzimatik bölünmenin kesinlikle gerekli olmadığını göstermiştir.
Ratiometrik FRET yaklaşımının sunulan uygulaması ve protokolü, normal, denatüre edilmemiş LEI'de doğal olarak mevcut olan zayıf DNaz aktivitesinin ortaya çıkarılmasını açıklamaktadır. Bölünmemiş LEI'nin içsel nükleolitik yeteneğinin keşfi ve analizi, testin farklı asidik pH seviyelerinde uzun süreli gözlemler için uygunluğu sayesinde mümkün olmuştur.

<table><tbody><tr><td>96 kuyucuklu plaka</td><td>Doğan</td><td>353219</td><td></td></tr><tr><td>DNA FRET Probu</td><td>IDT DNA'sı</td><td></td><td>5'-AAG GGT(TAM)CCT GCT GCA GGA CCC TTA ACG CAT TAT GCG T(FAM)T- 3'; FAM &ndash; Floresan-dT; &nbsp; TAM &ndash; Tetrametilrodamin-dT.&nbsp;</td></tr><tr><td>DNase II</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8764</td><td></td></tr><tr><td>EVOLT dijital SLR fotoğraf makinesi</td><td>Olympus</td><td>E500 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Güç Kaynağı ile Jel Elektroforez Aparatı</td><td>Biyo-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LEI</td><td>Novoprotein</td><td>CJ01</td><td></td></tr><tr><td>LiCOR Jel Görüntüleme Sistemi</td><td>LiCOR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz içermeyen su</td><td>Davetli</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Pre-Cast PAGE Jel</td><td>Davetli</td><td>EC68852</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Asetat Tampon Çözeltisi pH 5.2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2899-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Spektroflorometre</td><td>Çay</td><td></td><td>Saffire 2</td></tr></tbody></table>

dnaz aktivitesinin oransal floresan rezonans enerji transferi ile değerlendirilmesi

Assessment of DNase Activity by Ratiometric Fluorescence Resonance Energy Transfer

Bu temsili çalışma, uzun gözlem süreleri gerektiren yavaş enzimatik reaksiyonları araştırmak için ratiometrik FRET yaklaşımının belirli avantajlarını vurgulamaktadır. Özellikle, uygulama bir oransal FRET sistemi kullanarak LEI'nin içsel DNaz faaliyetinin tespitini ve analizini göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları Şekil 2'de gösterilmiştir.
Bu yaklaşımı kullanarak, LEI'nin hafif asidik koşullar al...

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

The present protocol describes a simple and sensitive ratiometric F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) assay for the detection and quantitative ...

assessment-dnase-activity-ratiometric-fluorescence-resonance-energy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Proteaz Floresan Algılama Kit Florimetri kullanarak proteaz aktivitesi ölçümü için tasarlanmıştır. Ayrıca eser miktarda proteaz kontaminasyon tespiti için uygundur. Yöntem FITC etiketli kazein substrat özel bir formülasyon proteolitik hydroysis dayanmaktadır.

Proteaz Aktivitesi belirleme Proteaz Floresan Algılama Kit kullanın

FRET kantitatif analizi (Förster rezonans enerji transferi) sinyalleri içeren bir roman yöntemini enzim kinetiği çalışmaları için tanımlanmıştır.

Kantitatif SENP1 Proteaz Kinetik Belirlenmesi (Förster rezonans enerji transferi) Analizi FRET

Bu video, balgam örneklerinde nötrofil serin proteaz aktivitesini ölçmek için bir in vitro testi göstermektedir. Salgılanan proteaz içeren numune, bir tanıma motifi taşıyan bir floresan raportör ile inkübe edilir. Motifin proteaz tarafından bölünmesi, raportörün donörü ve alıcı floroforu tarafından bireysel floresan emisyonunu mümkün kılar ve bu da numunedeki proteaz aktivitesini gösterir.

Floresan Raportör Kullanarak Nötrofil Serin Proteaz Aktivitesini Ölçmek için İn Vitro Test

Kolorimetrik tahlillerin paketi hızla ayırt edici protein, RNA, DNA, ve potansiyel olarak heterojen biyomoleküler örneklerinde yeniden ducing şekerler için açıklanmıştır.

Rapid Kolorimetrik Tahliller Nitelik Biyomoleküler Örnekleri RNA ve DNA ayırt etmek

Eksonükleazlar, genom stabilitesinin sağlanmasında kritik roller oynar. WRN eksonükleaz fonksiyonunun kaybı erken yaşlanmaya neden olur. Nükleazın substratlarını ve diğer gereksinimlerini in vitro olarak incelemek, in vivo rolünü aydınlatmaya yardımcı olabilir. Burada, nükleaz aktivitesini ölçmek için hızlı ve tekrarlanabilir floresan bazlı bir test gösteriyoruz.

İnsan Progeroid WRN Eksonükleazının Ortologu DmWRNexo'yu Karakterize Etmek için Floresan Bazlı Bir Eksonükleaz Testi ve Diğer Nükleazlara Uygulanması

Basitleştirilmiş (analog) bir okuma ile nükleik asitleri ölçmek için bir uç nokta dijital testi tanımlıyoruz. Damlacık bazlı dijital tahlillerin toplu floresansını özel enstrümantasyon yerine standart bir qPCR makinesi kullanarak ölçüyoruz ve sonuçlarımızı mikroskopi ile doğruluyoruz.

Dijital Nükleik Asit Kantifikasyon Tahliller Basit Toplu Saati

Biz iletişim kuralları için bir sentez raporu ve peptit nükleik asit (PNA) reaksiyonlar birleşmeyle arıtma artıkları değiştirilebilir. RNA dubleks değiştirilmiş PNAs tarafından tanınması karakterizasyonu için Biyokimya ve biyofizik yöntemleri açıklanmıştır.

Çift iplikçikli RNA'ların tek iplikçikli RNA'ların tarafından üzerinde fingerprinting ve seçici tanınması, kimyasal olarak peptit nükleik asitler modifiye

Bu iletişim kuralı DNA polimeraz yakın kızılötesi fluorescently etiketli DNA Jel Elektroforez ve jel görüntüleme kullanarak değişiklikleri gözlem yoluyla değiştirilmiş DNA sentezi karakterizasyonu açıklar. Akrilamid jelleri yüksek kararlılık düşsel boyutuna bağlı olarak farklı fiyatlara geçiş kısa nükleik asitler ayrılması için kullanılır.

DNA polimeraz etkinliği tahlil Akrilamid Jel Elektroforez tarafından görüntülenmiştir yakın kızılötesi floresan etiketli DNA'yı kullanarak

DNA metiltransferazlar potansiyel kanser ilaç hedefleridir. Burada, DNA metiltransferaz inhibisyonu için küçük molekülleri değerlendirmek için bir protokol sunulmaktadır. Bu tahlil, DNA metilasyonunu floresan üretimine bağlamak için bir endonükleaz kullanır ve enzim aktivitesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar.

DNA Metiltransferaz İnhibitörlerini Taramak için Sürekli Floresan Bazlı Endonükleaz Bağlantılı DNA Metilasyon Testi

DNAzyme tabanlı nanomakineler, nükleik asitlerin son derece seçici ve hassas tespiti için kullanılabilir. Bu makale, özgür yazılım kullanılarak 10-23 çekirdekli DNAzyme tabanlı nanomakinelerin tasarımı için ayrıntılı bir protokolü ve örnek olarak bir Epstein-Barr virüs parçasının tespitinde uygulanmasını açıklamaktadır.

DNAzyme 10-23 - Nükleik Asit Tanıma için Tabanlı Nanomakineler

Burada, ligaz, nükleaz ve polimeraz enzimlerinin örnekleri kullanılarak nükleik asit metabolize edici enzimlerin tahlili için bir protokol sunulmaktadır. Test, enzim davranışının karakterizasyonuna izin veren, RNA ve/veya DNA hasarlarını veya yol ara ürünlerini taklit eden dupleksler oluşturmak için birleştirilebilen floresan etiketli ve etiketsiz oligonükleotidleri kullanır.

Nükleik asit metabolize edici enzimleri test etmek için modifiye sentetik oligonükleotidlerin kullanılması

Keşfedin, oransal FRET analizi ile DNaz aktivitesini hassas bir şekilde tespit etmeyi ve pH, sıcaklık gibi deney koşullarının enzim aktivitesi üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı değerlendirmeyi.

DNaz Aktivitesinin Oransal Floresan Rezonans Enerji Transferi ile Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet