Name: Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T12:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Keşfedin, serebellar organotipik kültürler kullanarak Purkinje hücrelerinde DNA hasar yanıtını inceleyin. Bu yöntem, ataksi-telanjiektazi hastalığında nöron dejenerasyonunun moleküler mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Serebellar Purkinje Hücreleri: Organotipik Kültürlerde DNA Hasar Yanıtı

<table><tbody><tr><td><güçlü > Reaktif ve Ekipman< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>150 x 30 cm Petri kabı</td><td>Corning Inc.</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>35 x 10 mm Petri kabı</td><td>Corning Inc.</td><td>3294</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270725-1L</td><td></td></tr><tr><td>Yapıştırıcı mikroskop slaytları</td><td>Marienfeld</td><td>48187</td><td>76 x 26 x 1 mm</td></tr><tr><td>Doğrayıcı için bıçaklar</td><td>TED PELLA</td><td>Model TC752-1</td><td>&nbsp; Son Stil Tıraş Bıçakları</td></tr><tr><td>BME</td><td>GIBCO</td><td>41010-026 500ml.&nbsp;</td><td>L-Glut yok</td></tr><tr><td>Hücre kültürü,</td><td>Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>D-Glikoz</td><td>Biyolojik Hint'i ekler.</td><td>02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, fenol kırmızısı olmayan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-1138-500L</td><td>Hayır Ca+,</td></tr> <tr><td>fenol kırmızısı</td><td>Sartorius</td> ile Mg + <td>HBSS yok 02-015-1A</td><td></td></tr><tr><td>At serumu&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>26050088</td><td>ısıyla etkisiz hale getirilmiş</td></tr><tr><td>İris forseps</td><td>CellPath</td><td>GZX-0100-00A</td><td>130mm künt tırtıklı</td></tr><tr><td>İris spatula</td><td>FST</td><td>10092-12</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>41010026</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>322412-1L</td><td></td></tr><tr><td>Metanol ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GRIGENE içermeyen Montaj Ortamı</td><td>. Ltd, İsrail</td><td>K239320A</td><td></td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>856177-250MG</td><td>Paraquat diklorür (Metil violojen)</td></tr><tr><td>PARG-Poli(ADP-Riboz) Glikohidrolaz inhibitörü</td><td>Tocris Bioscience, Birleşik Krallık</td><td>PDD 00017273</td><td>ışığa duyarlı&nbsp;</td></tr><tr><td>Fosfat tamponu</td><td>Biyolojik Hint.</td><td>02-018-1A</td><td></td></tr><tr><td>Makas, cilt dokusu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Altı kuyulu plakalar</td><td>Corning dahil</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Yedek Doğrama Diskleri&nbsp;</td><td>TED PELLA</td><td>Model 10180-01</td><td></td></tr><tr><td>Doku doğrayıcı</td><td>McIlwain</td><td>Model TC752</td><td>10180-220</td></tr><tr><td>Cımbız, sivri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>uçlu İdrar kapları</td><güçlü>Antikorlar<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 eşek anti Tavşan IgG</td><td>&nbsp; Invitrogen</td><td>A21206</td><td>1:500; ikincil AB; İkincil seyreltme tamponu; &nbsp; Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon</td></tr><tr><td>Anti glial fibriler asidik protien</td><td>Milliphore</td><td>MAB3402</td><td>1:1500; birincil ab; engelleme; Ana bilgisayar: fare</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant&nbsp;</td><td>CB300</td><td>1:2000; birincil ab; engelleme; ev sahibi: tavşan&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-calbindin-D-28K</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td>1:2000; birincil ab; engelleme&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-pan-ADP-riboz reaktifi</td><td>Millifor</td><td>MABE1016</td><td>1:800; birincil ab; engelleme; oda sıcaklığında 2 saat inkübasyon</td></tr><tr><td>DAPI (4 ',6-Diamidin-2'-fenilindol dihidroklorür)</td> <td>Hücre sinyali</td><td>4084</td><td>1:1000; ikincil seyreltme tamponu; oda sıcaklığında 20 dakika inkübasyon</td></tr></tbody></table>

serebellar organotipik kültürler kullanılarak purkinje hücrelerinde dna hasar yanıtının görüntülenmesi

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Şekil 1, serebellar organotipik kültürlerin genel görünümünü göstermektedir. Şekil 1A'daki üst sıra, kültürde tutulan serebellar foliasyonu gösterirken, alt sıra, Calbindin D-28k (yeşil) için boyanmış PC'leri ve NeuN (kırmızı) için boyanmış nöronal çekirdekleri göstermektedir. Şekil 1B'de, PC'lerdeki astrositler (kırmızı), bir ara filament tip III proteini olan GFAP (yeşil) için boyanmıştır. Şekil 2 ve Şekil 3 , bu kültürlerin her ikisi de güçlü oksidanlar olan iki DNA'ya zarar veren ajanla muamele edilmesinden sonra gözlemlenen PAR boyamasını göstermektedir: potasyum bromat (12 saat boyunca 10 mM'lik bir nihai konsantrasyon) ve parakuat. PAR yanıtı, serebellar foliumdaki tedavi edilen PC'lerde kontrole kıyasla işaretlendi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig01.jpg"> Şekil 1: Murin serebellar organotipik kültürlerine genel bakış. (A) Üst sıra, kültürde sürdürülen serebellar yapraklanmayı göstermektedir. Alt sıra PC katmanına odaklanır. PC'ler Calbindin D-28k (yeşil) ile vurgulanır. NeuN boyaması (kırmızı), katmanlar boyunca nöronal çekirdekleri tanımlar. (B) PC'lere daha yakından bir bakış (kırmızı). GFAP (yeşil), astrositleri vurgulayan bir ara filament tip III proteindir. Ölçek çubukları = 968,8 μm (A, üst sıra), 42,1 μm (A, ikinci sıra), 72,7 μm (B, üst sıra), 18,2 μm (B, ikinci sıra). Kısaltmalar: PC = Purkinje hücreleri; GFAP = glial fibriler asidik protein; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig02.jpg"> Şekil 2: Potasyum bromat ile muamele edilmiş bir serebellar dilimde PAR boyama. Serebellar dilim, 12 saat boyunca 10 mM'lik bir nihai konsantrasyonda güçlü bir oksitleyici ajan olan potasyum bromat (KBrO3) ile muamele edildi. Ölçek çubukları = 775 μm. Kısaltmalar: PAR = poli(ADP-riboz); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67167/67167fig03.jpg"> Şekil 3: Güçlü bir süperoksit anyonu üreticisi olan paraquat'a maruz kalan serebellar dilimlerde PAR yanıtı. (A) Bir serebellar foliumun genel bir görünümü. Özellikle PC'lerde kontrolle karşılaştırıldığında sağlam PAR tepkisine dikkat edin. (B) Daha yakından bir inceleme, PC'lerde ve diğer hücre tiplerinde PAR yanıtını gösterir. Ölçek çubukları = 193.8 μm (A), 18.2 μm (B). Kısaltmalar: PAR = poli(ADP-riboz); DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67167/67167fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:border="1.5pt solid">Çözeltiler ve tamponlar</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid"></td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Çözüm  </td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Malzemeler</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Diseksiyon ortamı</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Hank'in %0.5 D-glikoz içeren dengeli tuz çözeltisi (HBSS). Mg2 + ve Ca2 + olmadan 50 mL HBSS'ye 0.5 mL P D-glikoz çözeltisi ekleyin.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">BME kültür ortamı</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Fenol kırmızısı içeren ancak L-glutamin veya HEPES içermeyen 100 mL Bazal Orta Kartal (BME), fenol kırmızısı ile 50 mL HBSS, 50 mL ısıyla inaktive edilmiş at serumu, 2 mL P D-glikoz ve 1 mL 200 mM L-glutamin ile karıştırın. Steril bir ortamda 0,22 μm'lik bir filtreden karıştırın ve süzün. 4 °C'de saklayın</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">İmmün boyama için engelleme çözümü</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0,1 M Fosfat tamponunda:% 0,5 Triton X-100,% 10 Keçi serumu ekleyin</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">İkincil antikor seyreltme tamponu</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M fosfat tamponu, %0.2 Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Yıkama tamponu</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M fosfat tamponu, %0.2 Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Sabitleyici çözüm</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Actenoe:metanol (1:1 v:v)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Geçirgenlik çözümü</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">0.1 M fosfat tamponu, %1 Triton X-100</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">DAPI çözümü</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">1x PBS'de 1 μg/mL'ye seyreltilmiş stok çözeltisi (2 mg / mL)</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Fosfat Tamponu</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">A ve B olmak üzere iki ruh hazırlayın (aşağıya bakın). 0.2 M fosfat tamponu yapmak için çözeltileri aşağıda belirtilen oranlara göre karıştırın. Daha sonra 0.1 M fosfat tamponu (çalışma çözeltisi) yapmak için 0.2M çözeltisini DDW (1: 1) ile seyreltin.</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">çözelti A (0,2 M için)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">12 g Sodyum Fosfat Monobazik Susuz (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">Çözüm B (0,2 m için)</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">14.2 g Sodyum fosfat diyabazik susuz (Na2HPO4 FW 141.96) 500 mL DDW</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0,2 M yapmak için karışık çözeltiler</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">1 L hazırlayın: 230 mL çözelti A ve 770 mL çözelti B</td>
		</tr><tr><td fo:border="1.5pt solid">0,1 M fosfat tamponu</td>
			<td colspan="3" fo:border="1.5pt solid">Karışık çözeltiyi DDW (1: 1) ile seyreltin</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Çözeltiler ve bileşimleri.

Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional ...

visualizing-dna-damage-response-purkinje-cells-using-cerebellar

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Bu video, bir fare yavrusunun beyninden serebellar organotipik dilimler elde etmek ve bu dilimleri in vitro  serebellar gelişimi taklit etmek için besinler ve büyüme faktörleriyle desteklenmiş ortamda kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.Ek olarak, spesifik serebellar dilimler bir test bileşiği ile muamele edilir ve bileşiğin nöroprotektif yeteneği bir immünofloresan boyama tekniği kullanılarak analiz edilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerinde Purkinje Hücre Sağkalımının Analizi

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Larva ve yetişkin kalpte görüntülenmesi için gerekli...

Dayak Kalp görselleştirme Drosophila</em

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Ayrıntılı bir protokol görüntüleme için DNA onarım komplekslerin gerçek zamanlı oluşumu...

Görüntüleme Uyuşmazlığı DNA Hasar Onarım ve Hücresel Yanıtları Bacillus subtilis</em

Keşfedin, serebellar organotipik kültürler kullanarak Purkinje hücrelerinde DNA hasar yanıtını inceleyin. Bu yöntem, ataksi-telanjiektazi hastalığında nöron dejenerasyonunun moleküler mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi

Daha fazla video keşfet