Name: Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 47 s
Description: Keşfedin mikroakışkan cihazlar kullanarak fizyolojik koşullar altında trombosit fonksiyonunu değerlendirme yöntemini. Bu yaklaşım, transfüzyon tıbbında hemostatik resüsitasyon ve trombosit disfonksiyonu çalışmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm araştırmalar kurumsal yönergelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Pittsburgh Üniversitesi İnsan Araştırmaları Koruma Ofisi'nden onay alındı ve sağlıklı insan gönüllülerden bilgilendirilmiş onam alındı.
1. Mikroakışkan cihaz hazırlığı
<ol>
	<li>Cihazın PDMS kısmını imal etmek için, bilgisayarlı sayısal kontrol (CNC) mikro işleme yoluyla pirinç kullanarak bir ana kalıp hazırlayın. NOT: Kanal boyutlarına bağlı olarak, bir ana kalıp oluşturmak için fotolitografi teknikleri kullanılabilir. Bu protokolde kullanılan cihaz, yaklaşık 480 μm genişliğinde, cihaz giriş ve çıkışında 140 μm yüksekliğinde ve cihaz darlığında 40 μm yüksekliğinde, stenotik bölgeye / bölgeden yaklaşık 0,3 mm'lik bir rampa uzunluğuna sahip sekiz paralel mikro işlenmiş kanal içerir. Kanal uzunlukları yaklaşık 6 mm'dir.</li>
	<li>Elde edilen bir ana kalıpla, Silikon Elastomer Tabanı (elastomer kitinden elde edilen) bir tartım kabına dökün. Sıvı PDMS'yi dayanıklı ve esnek bir katıya dönüştürmek için silikon polimer zincirlerinin çapraz bağlanmasını kolaylaştıran Silikon Kürleme Maddesini (elastomer kitinden elde edilir) 10:1 oranında (baz madde) ekleyin ve karışımı iyice karıştırın.</li>
	<li>Kalıbı bir Petri kabına yerleştirin ve kürlenmemiş PDMS'yi kalıba dökün. Kabarcıkları çıkarmak için Petri kabını 30 dakika boyunca bir vakumlu desikatörün içine yerleştirin.</li>
	<li>PDMS'yi 90 dakika boyunca 70 °C'ye ayarlanmış bir fırına yerleştirerek ana kalıpta kürlemeyi bitirin.</li>
	<li>PDMS kürlemesi tamamlandıktan sonra, bir tıraş bıçağı veya neşter kullanarak mikroakışkan dökümü kesin. Kanalların kenarlarına delikler açın (her iki tarafta 1,5 mm çapında).</li>
	<li>Laboratuvar bandı kullanarak, bir cam slaytın yüzeyini ve mikroakışkan kalıbın kazınmış tarafını temizleyin. Kalan kalıntıları temizlemek için gerektiği kadar basınçlı hava kullanın.</li>
	<li>Cam sürgüyü ve mikroakışkan dökümü, kazınmış tarafı yukarı bakacak şekilde bir Plazma Temizleyiciye yerleştirin. Vakum pompasını çalıştırın, hazneyi kapatın ve plazma temizleyiciyi yüksek ayara getirin. Sürgüyü ve PDMS'yi plazma temizleyicide 30 saniye bekletin, ardından plazma temizleyiciyi kapatın ve vakumu çıkarın.</li>
	<li>Plazma temizleyicide yukarı bakan kenarları hafifçe bastırarak plazma ile temizlenmiş döküm ve cam sürgüyü birbirine bağlayın. Ardından, mikroakışkan cihazı 10 dakika boyunca 70 °C'de bir fırına/ocak gözüne yerleştirin. NOT: Döküm ve cam sürgüyü birbirine yapıştırırken çok fazla basınç uygulamayın çünkü bu, kanal morfolojisinde bir kayba neden olabilir.</li>
	<li>Sterilize etmek için her odayı 10-30 μL p etanol ile durulayın ve mikroakışkan cihazın 70 °C'lik bir sıcak plaka üzerinde kurumasını bekleyin. NOT: Cihazlar en az 24 saat önceden yapılmalıdır, ancak haftalar ila aylar öncesinden yapılabilir. Cihazlar hava geçirmez bir kapta veya kapalı Petri kabında oda sıcaklığında saklanmalıdır.</li>
	<li>Mikroakışkan cihazla deney yapmadan bir gün önce, sterilize etmek ve mikroakışkan cihazın 70 °C'lik bir ocak gözü üzerinde kurumasını sağlamak için her odayı 10-30 μL% 70 etanol ile yeniden durulayın.</li>
	<li>Odayı, belirlenmiş bir çıkıştan belirlenen girişe 1: 5 hacimsel oranda% 0.9 NaCl ile seyreltilmiş Tip 1 at fibriller kollajen reaktifi (1 mg / mL) ile kaplayın. Bir deney içinde yönlülüğün korunduğundan emin olun. Kanal içindeki kaplanmış kollajenin buharlaşmasını önlemek için cihazı ılık, nemli kapalı bir kapta saklayın.</li>
	<li>1 saat sonra, kollajen solüsyonunu temizlemek için fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın. Kaplamanın ters yönünde yıkayın. Kullanılmadığı zaman cihazı tekrar ılık, nemli, kapalı bir kapta saklayın.</li>
</ol>
2. Kan örneği hazırlama
<ol>
	<li>Damar delinmesi yoluyla sitrat tam kan örneği alın. Sitratlı tam kanı FC reseptör bloke etme solüsyonu (1:600) ile inkübe edin. NOT: Kan örnekleri, deney öncesinde ve sırasında oda sıcaklığında saklanır.</li>
	<li>Sitrasyonlu tam kanı floresan konjuge (tercih edilen bir florofor kullanarak) CD41 antikoru (1:600) ile inkübe edin. Somunlu bir külbütör üzerinde 30 dakika boyayın.</li>
	<li>Trombosit inhibisyonu için pozitif bir kontrol olarak, PBS'de% 30 w / v 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin (HP-β-CD) çözeltisinde yeniden oluşturulan bir P2Y12 reseptör antagonisti olan Ticagrelor'u ekleyin. NOT: 6,4 mM'ye kadar olan Ticagrelor stokları hazırlanmalı ve deneyden önce HP-β-CD çözeltisinde (PBS'de çözülmüş 0 HP-β-CD) Ticagrelor stoklarının daha fazla seyreltilmesi yapılabilir (1.000x stok konsantrasyonu önerilir).</li>
	<li>Trombosit inhibisyonunu gözlemlemek için sitratlı numuneyi Ticagrelor (6.4 μM'ye kadar nihai konsantrasyon) ile 30 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Kan ürününü sitrat numunesi ile karıştırıyorsanız, kan ürününü FC reseptör bloke edici solüsyon (1:600) ve floresan konjuge (sitrat numuneye ayrı ve farklı bir florofor kullanarak) CD41 antikoru (1:600) ile boyayın.<ol>
		<li>Transfüzyon yapılan ürün birimlerinin hacimsel bir eşdeğerini sitrat numunesi ile karıştırın. Örneğin, kanaması olan bir kişiye transfüzyon yapılan 2 ünite trombosit ürününü simüle etmek için (ürün başına yaklaşık 250 mL, toplam 5.000 mL kan hacmi), 100 μL kan ürününü 1.000 μL sitrat kan örneğine karıştırın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Deneyden hemen önce, kan örneğini 40 μm'lik bir filtreden steril 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne süzün.</li>
</ol>
3. Akış altında trombosit fonksiyon testi (Yöntem 1)
<ol>
	<li>Mikroskobu ve ilgili yazılımı açın.</li>
	<li>Mikroskop aşaması ile bir çekme şırınga pompası seviyesi ayarlayın. Şırınga pompasındaki ayarları yapın.<ol>
		<li>Denklem (1) ve (2)21'i kullanarak kanalın stenotik bölgesinde 3.500 s-1'lik istenen ortalama duvar kesme hızı (γ) için bir hacimsel akış hızı (Q) hesaplayın. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq01.jpg" style="margin: auto;">(1) 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67214/67214eq02v2.jpg" style="margin: auto;">(2) Burada A kanalın kesit alanı, P ıslanan çevre, λ şekil faktörü, b dikdörtgenin kısa kenarı (yükseklik) ve a dikdörtgenin uzun kenarı (genişlik) dir. NOT: 3,500 s-1 değeri, VWF kritik kesme nedeniyle seçilmiştir ve arteriyel rejim 7,22,23'tedir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroakışkan cihazı mikroskop tablasına yerleştirin. Hareketi önlemek için mikroakışkan cihazın kenarlarını sahneye bantlayın. Prizin mikroskobun arkasına baktığından emin olun.</li>
	<li>1/16" ID tüpünün (yaklaşık 30 cm uzunluğunda) bir ucunu bir dirsek konektörüne ve diğer ucunu 1/16" ID konektörlü 10 mL'lik bir şırıngaya bağlayın.</li>
	<li>Şırıngayı steril PBS ile doldurun ve şırınga pompasına bağlayın.</li>
	<li>Dirsek konektörünü cihaz çıkışına yerleştirin.</li>
	<li>Bir ucunda dirsek konektörü ve diğer ucunda açılı kesim ile yaklaşık 10 cm uzunluğunda giriş hatları hazırlayın.</li>
	<li>Giriş dirseği konektörünü cihaz girişine bağlayın.</li>
	<li>Giriş hattını açılı bir tutucu üzerindeki bir atık mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.</li>
	<li>Yaklaşık 10 μm genişliğindeki kanal boyutları için 500x objektifi kullanın ve mikroakışkan cihaz kanal kenarlarına odaklanın.</li>
	<li>Hatları PBS ile doldurun ve şırınga pompasını manuel olarak ilerleterek herhangi bir PDMS / kalıntı kanalını temizleyin. Kanal girişinin ve çıkışının yakınında kontrol ettiğinizden emin olun.</li>
	<li>Kaydedilen görüntü yakalama ayarlarını açın veya kan örneğinde kullanılan floresan CD41 antikorlarına karşılık gelen bir parlak alan kanalı ve floresan kanallarla her 1-2 saniyede bir yakalanan zaman serisi görüntüleri için bir görüntü yakalama prosedürü oluşturun.</li>
	<li>Filtrelenmiş sitrat kan örneğini alın ve deneyden hemen önce yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Numuneyi açılı mikrosantrifüj tutucusuna yerleştirin.</li>
	<li>Giriş hattını numunenin içine yerleştirin.</li>
	<li>Görüntü yakalamayı kaydetmeye başlayın.</li>
	<li>Borudaki ölü hacmi doldurmak için şırıngayı yavaşça geri çekin. Kan kanala ulaştığında, istenen kesme hızında akışa devam etmek için hemen şırınga pompasındaki oynat düğmesine basın.</li>
	<li>Gerekirse odağı ayarlayın.</li>
	<li>Trombositler mikroakışkan cihazın stenotik bölgesini tamamen tıkayana kadar veya deneysel bir son noktaya kadar (yani 10 dakika) deneyi çalıştırın.</li>
	<li>Giriş borusunun deney süresince kan örneğine daldırıldığından emin olun.</li>
	<li>Deney tamamlandıktan sonra, görüntü yakalamayı durdurun ve şırınga pompasını durdurun. Yakalanan görüntüyü kaydedin.</li>
	<li>Giriş dirseği konektörünü çıkarın ve borunun içindekileri bir atık konik içine boşaltın. Şırınga ve çıkış hatlarının içindekileri de atık konik olarak boşaltın.</li>
	<li>Sonraki numuneler için giriş ve çıkış konektörlerini ve hortumlarını gerektiği gibi değiştirin.</li>
</ol>
4. Düşük hacimli numunelerle (1 mL'nin altında) akış altında trombosit fonksiyon testi (Yöntem 2)
<ol>
	<li>1.1'den 1.4'e kadar olan adımları yukarıdaki gibi tekrarlayın.</li>
	<li>Kanalların kenarlarına 1.5 mm çapında bir çıkış ve 3 mm çapında bir giriş delin.</li>
	<li>1.6'dan 3.6'ya kadar olan adımları yukarıdaki gibi tekrarlayın.</li>
	<li>Yaklaşık 10 μm genişliğindeki kanal boyutları için 500x objektifi kullanın ve mikroakışkan cihaz kanal kenarlarına odaklanın.</li>
	<li>Şırınga pompasını manuel olarak ilerleterek ve erişim sıvısını bir laboratuvar mendiliyle emerek herhangi bir PDMS/kalıntı kanalını temizleyin. Mikroakışkan cihazın üst kısmındaki kalıntıları laboratuvar bandı ile temizleyin.</li>
	<li>3 mm'lik giriş rezervuarını PBS ile doldurmak için pompayı manuel olarak ilerletin.</li>
	<li>Kaydedilen görüntü yakalama ayarlarını açın veya kan örneğinde kullanılan floresan CD41 antikorlarına karşılık gelen bir parlak alan kanalı ve floresan kanallarla her 1-2 saniyede bir yakalanan zaman serisi görüntüleri için bir görüntü yakalama prosedürü oluşturun.</li>
	<li>Şırınga pompasında para çekmeye başlayın (manuel olarak veya ayarlanan hızda) ve PBS kanala ilerlediğinde ve rezervuardaki doldurma hattı aşağı indiğinde, pompadaki para çekme işlemini duraklatın.</li>
	<li>Fazla PBS'yi bir pipetle rezervuardan çıkarın.</li>
	<li>Görüntü yakalamayı başlatın.</li>
	<li>Kan örneğini rezervuara (yaklaşık 40 μL) pipetleyin ve hemen çekme şırıngasını başlatın. Akışın başladığından emin olun. NOT: Geri çekme için şırınga pompası motoru adım 4.8'de astarlanmamışsa, akış hemen başlamaz ve deney tekrarlanmalıdır.</li>
	<li>Deney süresince kan haznesini tekrar doldurun ve kanala hava cebi girmediğinden emin olun.</li>
	<li>Trombositler mikroakışkan cihazın stenotik bölgesini tamamen tıkayana kadar veya deneysel bir son noktaya kadar (yani 10 dakika) deneyi çalıştırın.</li>
	<li>Deney tamamlandıktan sonra görüntü yakalamayı durdurun ve şırınga pompasını durdurun. Yakalanan görüntüyü kaydedin.</li>
	<li>Pipetleme ile rezervuardaki fazla kanı alın. Çekme borusunun içeriğini atık bir konik tüpe boşaltın.</li>
	<li>Sonraki numuneler için konektörleri ve boruları gerektiği gibi değiştirin.</li>
</ol>
5. Dekontaminasyon
<ol>
	<li>% 10'luk bir çamaşır suyu çözeltisine akıtarak kan giriş ve çıkış hatlarını temizleyin.</li>
	<li>Mikroakışkan cihazdaki tüm kanallar kullanılmışsa, cihazı Sharps biyolojik olarak tehlikeli atık kabına atın. NOT: Tüm biyolojik atıklar, biyolojik tehlike atıklarına uygun şekilde atılmalıdır.</li>
</ol>
6. Görüntü analizi
<ol>
	<li>Kinetik deneylerden elde edilen görüntüleri, Dosya | İhracat/İthalat | İhracat.</li>
	<li>Aşağıdaki parametreleri seçin: dosya türü: Etiketli Görüntü Dosyası Biçimi (TIFF); sıkıştırma: LZW; Orijinal Verileri kontrol edin ve Pikseli Kaydırın; işaretini kaldırın Görüntü eğrisini ve kanal rengini uygula; Alt Kümeyi Tanımla'yı (Bölge, Dikdörtgen bölge) işaretleyin ve koşullar arasında koruma genişliği ve yüksekliği ölçümü ile kanal alanını seçin. İstediğiniz klasöre aktarın ve Klasör oluştur'u işaretleyin.</li>
	<li>Yazılımda aşağıdaki deneysel değerlere dikkat edin: kan kanala girdiğinde çerçeveyi başlatın; kare hızı (Bilgi, Zaman Serisi).</li>
	<li>Ek Dosya 1 olarak sağlanan Matlab kodunu kullanarak bir deneyde her karenin normalleştirilmiş ortalama floresan yoğunluğunu ölçün ve her deney için aşağıdaki girdileri değiştirin: deney uzunluğuna göre başlangıç karesi/bitiş karesi (deney uzunluğunun koşullar arasında korunduğundan emin olun); deney adı/klasör adı; X, Y, H ve W parametrelerini kırpma. Kodu alıcı trombosit floresan kanalı için bir kez ve ürün trombosit floresan kanalı için bir kez çalıştırın. Normalleştirilmiş MFI (sütun 2) ve normalleştirilmiş AUC değerlerini (başlangıç karesine normalleştirilmiş) raporlayın. Deney uzunluğu değerini normalleştirilmiş AUC değerinden çıkarın.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>Travma ve Transfüzyonda Trombosit Fonksiyonunu Değerlendirme Platformu

<ol><li>Moore, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trauma-induced+coagulopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Trauma-induced coagulopathy.</a> Nat Rev Dis Primers. 7 (1), 1-23 (2021).</li>
<li>Vulliamy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+platelet+behavior+after+major+trauma%3A+adaptive+or+maladaptive%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Alterations in platelet behavior after major trauma: adaptive or maladaptive.</a> Platelets. 32 (3), 295-304 (2021).</li>
<li>Starr, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+injury+and+shock+driven+effects+on+ex+vivo+platelet+aggregometry%3A+A+cautionary+tale+of+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Identification of injury and shock driven effects on ex vivo platelet aggregometry: A cautionary tale of phenotyping.</a> J Trauma Acute Care Surg. 89 (1), 20-28 (2020).</li>
<li>Kutcher, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+platelet+dysfunction+after+trauma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Characterization of platelet dysfunction after trauma.</a> J Trauma Acute Care Surg. 73 (1), 13-19 (2012).</li>
<li>Yakusheva, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traumatic+vessel+injuries+initiating+hemostasis+generate+high+shear+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Traumatic vessel injuries initiating hemostasis generate high shear conditions.</a> Blood Adv. 6 (16), 4834-4846 (2022).</li>
<li>Colace, T. V., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+von+Willebrand+factor+elongation+and+fiber+formation+on+collagen+during+acute+whole+blood+exposure+to+pathological+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct observation of von Willebrand factor elongation and fiber formation on collagen during acute whole blood exposure to pathological flow.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 33 (1), 105-113 (2013).</li>
<li>Schneider, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shear-induced+unfolding+triggers+adhesion+of+von+Willebrand+factor+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Shear-induced unfolding triggers adhesion of von Willebrand factor fibers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (19), 7899-7903 (2007).</li>
<li>Savage, B., Almus-Jacobs, F., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+synergy+of+multiple+substrate-receptor+interactions+in+platelet+thrombus+formation+under+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Specific synergy of multiple substrate-receptor interactions in platelet thrombus formation under flow.</a> Cell. 94 (5), 657-666 (1998).</li>
<li>Savage, B., Saldívar, E., Ruggeri, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+platelet+adhesion+by+arrest+onto+fibrinogen+or+translocation+on+von+Willebrand+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Initiation of platelet adhesion by arrest onto fibrinogen or translocation on von Willebrand factor.</a> Cell. 84 (2), 289-297 (1996).</li>
<li>Ruggeri, Z. M., Mendolicchio, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+mechanisms+in+platelet+function%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Adhesion mechanisms in platelet function.</a> Circ Res. 100 (12), 1673-1685 (2007).</li>
<li>Chernysh, I. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distinctive+structure+and+composition+of+arterial+and+venous+thrombi+and+pulmonary+emboli%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The distinctive structure and composition of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli.</a> Sci Rep. 10 (1), 5112(2020).</li>
<li>Holcomb, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfusion+of+plasma%2C+platelets%2C+and+red+blood+cells+in+a+1%3A1%3A1+vs+a+1%3A1%3A2+ratio+and+mortality+in+patients+with+severe+trauma%3A+The+PROPPR+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA%22%5BJournal%5D)">Transfusion of plasma, platelets, and red blood cells in a 1:1:1 vs a 1:1:2 ratio and mortality in patients with severe trauma: The PROPPR randomized clinical trial.</a> JAMA. 313 (5), 471-482 (2015).</li>
<li>Shea, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doing+more+with+less%3A+low-titer+group+O+whole+blood+resulted+in+less+total+transfusions+and+an+independent+association+with+survival+in+adults+with+severe+traumatic+hemorrhage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Doing more with less: low-titer group O whole blood resulted in less total transfusions and an independent association with survival in adults with severe traumatic hemorrhage.</a> J Thromb Haemost. 22 (1), 140-151 (2024).</li>
<li>Cardenas, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+transfusions+improve+hemostasis+and+survival+in+a+substudy+of+the+prospective%2C+randomized+PROPPR+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Adv%22%5BJournal%5D)">Platelet transfusions improve hemostasis and survival in a substudy of the prospective, randomized PROPPR trial.</a> Blood Adv. 2 (14), 1696-1704 (2018).</li>
<li>Sperry, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prehospital+plasma+during+air+medical+transport+in+trauma+patients+at+risk+for+hemorrhagic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prehospital plasma during air medical transport in trauma patients at risk for hemorrhagic shock.</a> N Engl J Med. 379 (4), 315-326 (2018).</li>
<li>Meyer, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Every+minute+counts%3A+Time+to+delivery+of+initial+massive+transfusion+cooler+and+its+impact+on+mortality%5BTitle%5D)+AND+%22J+Trauma+Acute+Care+Surg%22%5BJournal%5D)">Every minute counts: Time to delivery of initial massive transfusion cooler and its impact on mortality.</a> J Trauma Acute Care Surg. 83 (1), 19-24 (2017).</li>
<li>Shea, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold-stored+platelet+hemostatic+capacity+is+maintained+for+three+weeks+of+storage+and+associated+with+taurine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Cold-stored platelet hemostatic capacity is maintained for three weeks of storage and associated with taurine metabolism.</a> J Thromb Haemost. 22 (4), 1154-1166 (2024).</li>
<li>Sperry, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+cold+stored+platelet+transfusion+following+severe+injury%3A+a+randomized+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Early cold stored platelet transfusion following severe injury: a randomized clinical trial.</a> Ann Surg. 280 (2), 212-221 (2024).</li>
<li>Schoeman, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+model+of+hemostasis+sensitive+to+platelet+function+and+coagulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">A microfluidic model of hemostasis sensitive to platelet function and coagulation.</a> Cell Mol Bioeng. 10 (1), 3-15 (2017).</li>
<li>Sakurai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microengineered+vascularized+bleeding+model+that+integrates+the+principal+components+of+hemostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A microengineered vascularized bleeding model that integrates the principal components of hemostasis.</a> Nat Commun. 9 (1), 509(2018).</li>
<li>Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+non-Newtonian+flow+behavior+in+ducts+of+unusual+cross+section%5BTitle%5D)+AND+%22Ind+Eng+Chem+Fundamentals%22%5BJournal%5D)">Predicting non-Newtonian flow behavior in ducts of unusual cross section.</a> Ind Eng Chem Fundamentals. 11 (4), 524-528 (1972).</li>
<li>Kim, D., Bresette, C., Liu, Z., Ku, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Occlusive+thrombosis+in+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22APL+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Occlusive thrombosis in arteries.</a> APL Bioeng. 3 (4), 041502(2019).</li>
<li>Kroll, M. H., Hellums, J. D., McIntire, L. V., Schafer, A. I., Moake, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelets+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Platelets and shear stress.</a> Blood. 88 (5), 1525-1541 (1996).</li>
<li>Sorrells, M. G., Neeves, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adsorption+and+absorption+of+collagen+peptides+to+polydimethlysiloxane+and+its+influence+on+platelet+adhesion+flow+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Adsorption and absorption of collagen peptides to polydimethlysiloxane and its influence on platelet adhesion flow assays.</a> Micromachines. 11 (1), 62(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><güçlü > Ekipmanlar< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td>491917-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>Bel-Art Space Saver Vakumlu Kurutucular</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-594-15A</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Dijital Ocak Gözü Karıştırıcı Fisher</td><td>Scientific</td><td>FB30786161</td><td></td></tr><tr><td>Somunlama Mikseri</td><td>Fischer Scientific</td><td>88-861-043</td><td></td></tr><tr><td>OHAUS Scout Denge Ölçeği</td><td>Uline</td><td>H-5852</td><td></td></tr><tr><td>Fırın</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0520</td><td></td></tr><tr><td>Plazma temizleyici</td><td>Harrick</td><td>PDC-32G (115V)</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga Pompası (PHD ULTRA CP, I/W PROGRAMLANABILIR)Harvard</td> <td>Aparatı</td><td>883015</td><td></td></tr><tr><td>Zen 3.4</td><td>Zeiss</td><td>Blue edition</td><td>Yazılımı</td></tr><tr><td>< güçlü > Malzeme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1/16 inç ID - Dikenli Dirsek Konnektörleri</td><td>Qosina</td><td>11691</td><td></td></tr><tr><td>10 mL şırınga</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-955-459</td><td></td></tr><tr><td>2-Hidroksipropil-&beta;-siklodekstrin</td><td>Cayman Kimyasalları</td><td>16169</td><td>%30 Fosfat Tamponlu Tuzlu Su</td></tr><tr><td>40 Mikron Filtrelerde</td> Çözünmüş <td>Fischer Scientific</td><td></td><td></td>NC1469671</tr><tr><td>CD41 antikoru</td><td>Novus Biologicals</td><td>&nbsp; NB100-2614</td><td>Tam Kanda 1:600 Oranı</td></tr><tr><td>Chrono-Par Kollajen Reaktifi</td><td>Chrono Log Corporation</td><td>385</td><td>1:5 Oranı %0.9 Tuzlu</td></tr><tr><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri Pistonlu Miltex Biyopsi Punch, 3.0 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0856599</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Snap-Cap Mikrosantrifüj SafeLock Tüpleri, 1.5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td></td></tr><tr><td>Essendant 121oz. Clorox Antiseptik Çamaşır Suyu</td><td>Fischer Scientific</td><td>50371500</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td>%70</td></tr> <tr><td>Falcon Güvenlik Tozu Kapalı DPSXLRCP Sıkıştırılmış Gaz</td><td>Supra</td><td>1381978</td><td></td></tr><tr><td>İnsan TruStain</td><td>Biolegend</td><td>422302</td><td>Tam Kanda 1:600 Oranı</td></tr><tr><td>LevGo smartSpatula Tek Kullanımlık Polipropilen Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-001-017</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Slaytları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-A3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Güvenlik Neşter</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-079-718</td><td></td></tr><tr><td>Salin</td><td>Millipore</td><td>567442</td><td>%0.90</td></tr> <tr><td>Sartorius Polistiren Tartı Tekneleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-735-744</td><td></td></tr><tr><td>Superslip Kapak Fişleri - Superslip No. 1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-055</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9285739</td><td>Polidimetilsiloksan (PDMS)</td></tr> <tr><td>Ticagrelor</td><td>Cayman Kimyasalları</td><td>15425</td><td></td></tr><tr><td>Tygon PVC Şeffaf Boru 1/16" ID, 1/8" OD, 50 ft uzunluk</td><td>McMaster-Carr</td><td>6516T11</td><td></td></tr><tr><td>Ultra İşlenebilir 360 Pirinç Bar</td><td>McMaster-Carr</td><td>8954K721</td><td>Ana kalıp imalatı için</td></tr><tr><td>Vacutainers</td><td>BD</td><td>363083</td><td></td></tr><tr><td>Dünya Hassas Alet Yeniden Kullanılabilir Biyopsi Punch, 1.5mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1215626</td><td></td></tr></tbody></table>

trombosit fonksiyonunun değerlendirilmesinde mikroakışkanlar

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Bu yöntemin kullanımını takiben yapılan mikroakışkan deneyler, akım kanalının darlık olan bölgede trombositten zengin trombüs oluşumunu göstermelidir (Şekil 1). Şekil 1A , fonksiyonel trombositlerin kanaldan kan akışını engellemek için kanalın stenotik bölgesinde bir trombüs oluşturduğu temsili sonuçları göstermektedir. Deney süresince çekilen kinetik görüntülerin ortalama floresan yoğunluğu (MFI) eğrileri, büyüyen trombüste trombosit katılımının bir gecikmesini, büyümesini ve plato fazını göstermektedir (Şekil 2A, C). Bir P2Y12 antagonisti olan Ticagrelor'un artan konsantrasyonları, trombosit MFI'nin yanı sıra MFI eğrilerinin eğrisi (AUC) altında hesaplanan alanı azaltır (Şekil 2B, D). 5 dakikalık inkübasyona kıyasla 30 dakikalık bir Ticagrelor inkübasyonundan sonra tam kan empedans agregometrisi kullanılarak daha belirgin bir doz-yanıt ilişkisine uygun olarak, belirgin trombosit disfonksiyonunu gözlemlemek için daha uzun inkübasyon sürelerine (5 dakikaya kıyasla 30 dakika) ihtiyaç vardır (Ek Şekil S1). Farklı araç koşulları altında, mikroakışkan modelde P2Y12 inhibisyonunun benzer zamana bağlı etkileri gözlenmiştir (Ek Şekil S2).
Simüle edilmiş hemostatik resüsitasyon yönteminde iki trombosit popülasyonunun görüntülenmesi, her iki trombosit popülasyonunun trombüs içine dahil edilmesini göstermektedir (Şekil 3A). Her iki trombosit popülasyonunun karşılık gelen floresan sinyallerine dahil edilmesi, MFI ölçümleri yoluyla deney süresi boyunca kinetik olarak ölçülebilir (Şekil 3B). Büyüme fazındaki daha dik eğimler ve artan son nokta MFI ölçümleri, kan örneği P2Y12 inhibisyonu yoluyla trombosit disfonksiyonu ile indüklendiğinde alıcı trombositlerin miktar tayininde görülebilen artmış trombosit işlevselliği ve hemostatik potansiyeli gösterir ve daha sonra, taze otolog tam kanın belirgin bir trombosit floroforu ile boyanmış 1:10 hacimsel oranda karıştırılmasıyla simüle edilen resüsitasyon. Otolog tam kan karıştırma ile, oda sıcaklığında saklama günü 5'te bir aferez trombosit ürününe kıyasla, simüle edilmiş transfüzyon ürününden daha fazla trombosit dahil edildi ve bu da oluşturan trombüse minimum ürün katılımı gösterdi. 5. gün oda sıcaklığında trombosit ürün karışımı, taze otolog tam kan ile karıştırmaya kıyasla daha düşük alıcı trombosit katılımı gösterdi (Şekil 3B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig01.jpg"> 
Şekil 1: Mikroakışkanlar kullanılarak trombosit fonksiyon testinin temsili. (A) Düşük hacimli kan örnekleri kullanılarak trombosit fonksiyon testi için şematik mikroakışkan deney düzeneği, kanı stenotik bir akış odasından çeken ve gerçek zamanlı olarak görüntü yakalamaya izin veren bir çekme şırınga pompası da dahil olmak üzere gösterilmiştir. (B) Trombositlerin yapışacağı, aktive olacağı ve toplanacağı kollajen kaplı bir yüzey de dahil olmak üzere stenotik bir akış odasının yandan görünümü gösterilmiştir, bu da stenotik bölgede büyüyen bir trombüs ile sonuçlanır. (C) Stenotik bir mikroakışkan kanalda (3.500 s-1) akış altında sitratlı bir kan örneğinin ve 300 s'nin üzerinde oluşan büyüyen bir trombüsün gerçek zamanlı görüntü yakalaması. Ölçek çubukları = 200 μm (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig02.jpg"> 
Şekil 2: P2Y12 antagonisti Ticagrelor ile 30 dakikalık inkübasyondan sonra azaltılmış trombosit MFI kıvrım değişiklikleri ve eğri altındaki alan. (A) P2Y12 antagonisti ile sadece 5 dakika inkübasyon, MFI eğrilerinin hafifçe uzamış gecikme fazlarını ve (B) MFI AUC'de hafif düşüşleri gösterir. (C) P2Y12 antagonisti ile 30 dakikalık inkübasyon, uzun gecikme fazları ve düşük sonlanım MFI değerlerinin yanı sıra (D) MFI AUC ile gösterilen daha sağlam disfonksiyon ile sonuçlanır. Bireysel veri noktaları biyolojik kopyaları temsil eder ve ortalama ± standart sapma gösterilir. Kısaltmalar: MFI = ortalama floresan yoğunluğu; AUC = eğrinin altındaki alan; HP-β-CD = 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67214/67214fig03.jpg"> 
Şekil 3: Mikroakışkan odada, hasta trombosit disfonksiyonunu simüle eden, alıcı numunede koagülopatik P2Y12 inhibisyonu ile karışan kan ürünü. (A) Aferez trombosit ünitesi (plazma, saklama günü 7) (camgöbeği içinde CD41), 30 dakika boyunca 0.8 μM Ticagrelor ile önceden inkübe edilmiş sitrat kan ile 1: 10 oranında karıştırılır (kırmızı CD41). (B) Zaman içinde alıcı trombosit kinetiği ile birlikte aferez trombosit ünitesi (saklama günü 5) veya otolog taze tam kan (1:10 oranı) alan alıcı kan örneğinin temsili normalleştirilmiş ortalama floresan yoğunluk eğrileri. Alıcı sitratlı kan, kan ürünleri ile karıştırılmadan önce 30 dakika boyunca 0.8 μM Ticagrelor ile önceden inkübe edildi. (C) Konfokal mikroskopi için bir lamel üzerine bağlanmış modifiye edilmiş bir cihazdan temsili z-yığını görüntüsü. Aferez trombosit ürünü, von Willebrand faktör antikoruna (1:600) ek olarak 1:5 hacimsel oranda trombositopenik kan örneği (ürün:kan) ile karıştırıldı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: Görüntü analizi için Matlab kodu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/ImageReader_Jove_Supplemental.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Tam kan empedans agregometrisi, Ticagrelor ile P2Y12 inhibisyonunun zamana bağımlılığı. 30 dakikalık inkübasyon, 5 dakikaya kıyasla daha belirgin bir doz-yanıt ilişkisi ile sonuçlanır. Araç ve ilaç solüsyonları %0.1 v/v olarak kullanıldı. Bireysel veri noktaları biyolojik kopyaları temsil eder ve ortalama ± standart sapma gösterilir. Kısaltmalar: AUC = eğrinin altındaki alan; HP-β-CD = 2-hidroksipropil-β-siklodekstrin. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S2: Trombosit fonksiyonunun mikroakışkan modelinde Ticagrelor ile zamana bağlı P2Y12 inhibisyonu. Temsili MFI eğrileri ve tek bir sağlıklı donörden alınan teknik kopyalar için eğri değerlerinin altındaki alan, ilaç çözünürlüğü için kullanılan etanol aracı (%1 v/v) ile gösterilir. Kısaltmalar: MFI = ortalama floresan yoğunluğu; AUC = eğrinin altındaki alan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67214/67214_Supp%20Fig%202.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

microfluidics-in-assessing-platelet-function

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Trombosit adezyon kaskad kayma akışı varlığında yer alır, konvansiyonel (statik) iyi plaka deneyleri için bir faktör değildir. Bu makale, fizyolojik kesme akış koşulları taklit etmek için iyi bir mikroakışkan plaka formatı kullanan bir trombosit agregasyonu tahlil raporları.

Mikroakışkan Akış Hücreler kullanarak Akış altında Trombosit Yapışma ve toplama

Trombosit transfüzyonu ve hemostazı, kan bankacılığı trombositlerinin işlevini araştırmak için kan sulandırma ve mikroakışkan akış odaları kullanılarak modellendi. Veriler, trombosit depolama lezyonunun in vitro olarak hemostaz üzerindeki sonuçlarını göstermektedir.

Mikroakışkan Akış Chambers Hemostaz ve Trombosit Transfüzyon Model Sulandırılarak Kan kullanma<em&gt; İn Vitro</em

Bu makale aynı zamanda trombosit fonksiyonu ve pıhtılaşmayı ölçen hemostaz deneysel model tanımlamaktadır. Trombosit ve fibrin floresans gerçek zamanlı olarak ölçülür ve platelet yapışma oranı, bir pıhtılaşma hızının, pıhtılaşma başlangıcı belirlenir. Model transfüzyonu için konsantreleri akışı altında trombosit prokoagülan özelliklerini belirlemek için kullanılır.

Trombosit Transfüzyon ve Hemostaz için bir mikroakışkan Akış Odası Modeli Gerçek zamanlı Trombosit Birikimi ve Fibrin oluşumu Tedbirleri

Biz bulanıklık derecesi agonist kaynaklı trombosit agregasyon ölçümleri ile takip insan kanından yıkanıp trombosit izolasyonu için basit bir yöntem tarif eder. Bir örnek olarak, Pannexin1 kanalı inhibitörü Parlak Mavi FCF ile bir ön kuluçkalama sonrası kollajen insan trombosit agregasyon cevap üzerinde çalışma yapılması için bu yöntemi uygulanır.

Kollajen ile indüklenen on Aggregation Pannexin1-inhibitör Parlak Mavi FCF: Türbidimetrik İnsanlar üzerinde Trombositler Yıkanmış

Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.

Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme

Hasta kaynaklı endotel ile tam kan etkileşimini araştırmak için in vitro vasküler hastalık modeli salıyoruz. Bu sistem çeşitli koşullar altında primer endotel hücrelerinin trombojenik özelliklerinin incelenmesini sağlar. Bu yöntem özellikle pıhtılaşmanın farklı aşamalarında situ trombojenite ve antikoagülasyon tedavisinin değerlendirilmesi için uygundur.

In Vitro Mikroakışkan Hastalık Modeli Gerçek Zamanlı Olarak Tam Kan-Endotel Etkileşimleri ve Kan Pıhtısı Dinamikleri Çalışma

Kapasitif bir biyosensör kullanan yeni bir dinamik çok parametreli trombosit fonksiyonel testi için bir protokol burada sunulmaktadır. Fizyolojik alaka düzeyini artırmak için yarı katı bir mikro ortam içinde tasarlanan bu yaklaşım, trombosit sayısına, stimülasyon güçlerine ve aktivasyon yollarına duyarlı üç çıktı parametresi sağlar.

Kapasitif Biyosensör Kullanarak Dinamik Çok Parametreli Trombosit Fonksiyon Değerlendirmesi

Prokoagülan trombosit oluşumu, artmış tromboz riski ile ilişkilendirilmiştir. Burada, prokoagülan trombositlerin ayırt edici özellikleri olan fosfatidilserin ve mikrovezikül salınımının maruziyetini ölçmeyi amaçlayan, yıkanmış trombositleri insan kanından izole etmek için kesin bir protokol sunulmaktadır.

İnsan Saflaştırılmış Trombositlerinden Fosfatidilserin Maruziyeti ve Mikrovezikül Salınımının Ölçülmesiyle Prokoagülan Trombosit Karakterizasyonu

Bu çalışma, kanda trombus oluşumunu tetiklemek için kesme stresi kullanan ve trombü birden fazla boyutlu okuma ile karakterize eden bir mikrofluidik testi tanımlar. Bu test, kan örneklerinin protrombotik eğilimini ölçebilir ve bu nedenle hastalık teşhisi, ilaç keşfi ve trombozla ilgili temel mekanik çalışmalarda faydalıdır.

Trombus Profilleme Testi: Biyomekanik Trombogenezin Kapsamlı Karakterizasyonu İçin Mikrofluidik Tabanlı Bir Platform

Endo-PAT 2000 kullanıyorsanız endotel fonksiyonunu değerlendirmek için bir non-invaziv prosedür gösterilmiştir.

Endo-PAT 2000 ile Endotel Vazodilatör Fonksiyon değerlendirilmesi

Keşfedin mikroakışkan cihazlar kullanarak fizyolojik koşullar altında trombosit fonksiyonunu değerlendirme yöntemini. Bu yaklaşım, transfüzyon tıbbında hemostatik resüsitasyon ve trombosit disfonksiyonu çalışmalarına katkı sağlar.

Trombosit Fonksiyonunun Değerlendirilmesinde Mikroakışkanlar

Daha fazla video keşfet