Doğal öldürücü hücre kaynaklı hücre dışı vezikül bazlı kanser biyoterapötiklerini üretmek ve izole etmek için ölçeklenebilir biyoüretim iş akışı

Araştırmamız, kanser hücrelerini öldürmede doğal olarak etkili olan bir tür bağışıklık hücresi tarafından üretilen küçük veziküllere odaklanmaktadır. Bu veziküller, beyin gibi hem birincil hem de ikincil bölgelerde katı tümörleri tedavi etmek için umut verici terapötik potansiyele sahiptir. Bu çalışmada, boyut dışlama kromatografisi yoluyla vezikülleri izole etmek için iki modlu bir reçine kullanıyoruz, vezikülleri kirleticilerden fiziksel olarak ayırarak ürün saflığını en üst düzeye çıkarırken, elektrostatik kuvvetler yoluyla reçine içindeki kirleticileri daha fazla hapsediyoruz.

Daha sonra kullanmadan önce vezikülleri sterilize eder, konsantre eder ve tampon değiştiririz Bu videodaki biyo-üretim iş akışı ayrıntıları, klinik olarak ilgili koşulları kullanır ve maliyet açısından ölçeklenebilir, büyük miktarlarda yüksek saflıkta hücre dışı vezikülleri etkili bir şekilde üretir. Bu, akademik laboratuvarların güvenilir bir üretim ve izolasyon süreci ile bu tür terapötikleri incelemek için güvenle kaynak yatırımı yapmaları için tekniği erişilebilir kılar. Şu anda bu veziküllerin ve klinik öncesi modellerin terapötik potansiyelini araştırıyoruz ve nasıl çalıştıklarına dair anlayışımızı daha da güçlendiriyoruz.

Başlamak için, üreticinin talimatlarına göre hızlı protein sıvı kromatografi sistemi başlatma işlemini gerçekleştirin. Kolonun içine hava girmediğinden emin olmak için damladan damlaya yöntemini kullanarak bağlantılar yapın. Numuneleri toplamak için fraksiyon toplayıcıyı uygun toplama tüpleriyle kurun.

Fraksiyonlama ayarlarını istenen toplama hacmine değiştirin. Önceden hazırlanmış 40 ila 80 mililitre hücre dışı vezikül veya EV açısından zengin şartlandırılmış ortamı 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın ve 37 santigrat derecede hızla çözün. Numuneyi dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 10.000 G'de döndürün ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.

Çift sarmallı DNA seviyelerini azaltmak için, EV açısından zengin şartlandırılmış ortamı beş milimol magnezyum klorür ve mililitre endonükleaz başına 50 birim ile tedavi edin. Numuneyi orta derecede karıştırma ile 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin. Kromatografi sistemi hazır olduğunda, EV açısından zengin şartlandırılmış ortamı 60 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin ve numune hattına bağlayın.

Sistemi başlatmak ve akış hızını sıfıra ayarlamak için Manuel Çalıştır'a tıklayın. Çalıştırmayı önceden kaydetmek için yazılım istemlerini izleyin. Ardından Başlat'a tıklayın.

Line Beat Çift Filtreli PBS'yi seçin ve dakikada iki mililitrelik bir akış hızında çalıştırarak çözeltinin sütundan geçtiğinden emin olun. Emici stabilize olduğunda, Otomatik Sıfır UV'ye basın. Numuneyi kolondan önce atık şişesine yönlendirmek için akış yolunu değiştirin. Beş ila 20 saniye sonra örneği sütuna yönlendirin.

UV okumaları yaklaşık 230 miliabsorbans birimine ulaştığında, Fraksiyonlama'ya tıklayın. Numunenin tamamen enjekte edilmesinden sonra, saflaştırmaya devam etmek için tampon sistemini Çift Filtreli PBS'ye geçirin. UV değeri yaklaşık 1.600 miliabsorbans birimine ulaştığında, tekrar Fraksiyonlama'ya tıklayın.

Çalışma durduğunda, kromatogramı bir PDF belgesi olarak kaydedin. Ultra filtrasyon aparatının her bileşenini 20 ila 30 mililitre% 90 etanol ile durulayın. Beş ila 10 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün ve akışı atın.

Ardından, cihazı dengelemek için steril PBS ile durulama işlemini gerçekleştirin ve santrifüjleme adımlarını daha önce olduğu gibi tekrarlayın. NK-EV'lerin tüm seyreltilmiş fraksiyonlarını birleştirin. Steriliteyi en üst düzeye çıkarmak için, seyreltilmiş NK-EV solüsyonunu 0,22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin, çift filtreli PBS ile önceden ıslatın.

Süzüntüyü sterilize edilmiş konsantrasyon aparatına toplayın. Süzüntüyü 15 ila 40 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün. Döndürdükten sonra, serolojik bir pipet kullanarak çözeltiyi üst filtre bölmesinde karıştırın.

Yine, 10 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün. NK-EV'yi toplamak için filtreleme cihazını ters çevirin ve toplama cihazına takın. NK-EV'yi 2.000 G'de iki dakika döndürün ve saflaştırılmış ürünü steril bir tüpe aktarın.

Nanopartikül izleme analiz sistemini üreticinin talimatlarına göre başlatın. Akış hücresinde hava kabarcıkları olup olmadığını gözlemleyin. Bir hava kabarcığı varsa, akış hücresini %20 etanol ve çift filtrelenmiş su ile durulayarak çıkarın.

Temizlendikten sonra, lazer modülünü nanopartikül izleme analiz cihazına dikkatlice yeniden yerleştirin. Kapıyı kapatın ve Kamerayı Başlat'a tıklayın. Yakalama ayarlarını iki ekran kazancı ve kamera düzeyi 14 olarak değiştirin.

Akış hücresini stabilize etmek için ısıtıcıyı açın. 23 santigrat derecede 30 derecelik bir akış hızında bir dakika boyunca bir yakalama toplamak üzere SOP sekmesi altında bir komut dosyası oluşturmak için Standart Ölçüm'e tıklayın. Verileri kaydetmek için klasörü ve dosya adını yol adına ekleyin.

Saflaştırılmış NK-EV ürününü vorteksleyin ve seyreltmelerini çift filtreli PBS kullanarak hazırlayın. Seyreltilmiş numuneyi girdapladıktan sonra, hava kabarcıkları oluşturmadan 1 mililitrelik toplama şırıngasına yükleyin. Şırıngayı dikkatlice alet yükleme hattına bağlayın.

Şırıngada yaklaşık 0,5 mililitre bırakarak numunenin yarısını yavaşça itin. Parçacıklar ekranda göründüğünde, kamerayı her parçacığın etrafında en fazla bir hale olacak şekilde odaklayın, Donanım sekmesi altında, Demle'ye tıklayın ve beş saniye boyunca 1.000'lik bir oran ayarlayın. Ardından oranı 30'a düşürün.

Komut Dosyasını Çalıştır'a basın. Ayarların doğru olduğundan emin olduktan sonra Evet'e tıklayın ve yazılım istemlerini izleyin. Yakalamayı tamamladıktan sonra, yazılım dosyaları işlemeyi veya dışa aktarmayı istediğinde İptal'e tıklayın.

Seyreltme başına beş yakalama kaydettikten sonra, beş yakalamanın tümünü analiz için içe aktarın. Dosyaları vurgulayın ve Seçili Dosyaları İşle'ye tıklayın. İşlem sekmesi altında, analiz ayarlarını iki ekran kazancına ve 15 algılama eşiğine ayarlayın.

Analiz için işaretleyin ve Tamam'ı tıklayın. İşlemden sonra, ek kutulara tıklamadan Evet'e tıklayın veya dosyaları dışa aktarmak için Dışa Aktar'a tıklayın. Saflaştırılmış NK-EV parçacık boyutu 76.30 ila 174.30 nanometre arasında değişmekte olup, ortalama konsantrasyon 1.39 çarpı 10 ila mililitre başına 12 EV gücündedir.

Ek olarak, florometre ölçümü mililitre başına yaklaşık 300 miligramlık bir protein konsantrasyonu ve mililitre başına 225 miligramlık çift sarmallı bir DNA konsantrasyonu gösterdi. NK-EV'lerle insan K562 lösemi hücresi tedavisi, mililitre başına dokuz EV'nin gücüne 9.33 kez 10'luk bir EC 50 ile hücre canlılığında doza bağlı bir azalma gösterdi.