Name: Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSCden Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-06T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Keşfedin, iPSC'den türetilmiş epitel, mezenkimal, endotel ve makrofaj hücreleriyle hava yolu bariyeri modellemesini. Bu yöntem, akciğer sağlığı ve hastalıklarında hava yolu yeniden şekillenmesini in vivo çalışmak için değerli bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Akciğer Bariyeri Bütünlüğü, Hastalık ve İlaç Keşfini İncelemek için Hava Yolu Modeli

<ol><li>Wu, M., Zhang, X., Lin, Y., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+airway+basal+stem+cells+in+lung+homeostasis+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Respir+Res%22%5BJournal%5D)">Roles of airway basal stem cells in lung homeostasis and regenerative medicine.</a> Respir Res. 23 (1), 122(2022).</li>
<li>Blackburn, J. B., Li, N. F., Bartlett, N. W., Richmond, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+update+in+club+cell+biology+and+its+potential+relevance+to+chronic+obstructive+pulmonary+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">An update in club cell biology and its potential relevance to chronic obstructive pulmonary disease.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 324 (5), L652-L665 (2023).</li>
<li>Fahy, J. V., Dickey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+mucus+function+and+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Airway mucus function and dysfunction.</a> N Engl J Med. 363 (23), 2233-2247 (2010).</li>
<li>Whitsett, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+epithelial+differentiation+and+mucociliary+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Airway epithelial differentiation and mucociliary clearance.</a> Ann Am Thorac Soc. 15 (Suppl 3), S143-S148 (2018).</li>
<li>Khalilgharibi, N., Mao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+form+and+function%3A+On+the+role+of+basement+membrane+mechanics+in+tissue+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">To form and function: On the role of basement membrane mechanics in tissue development, homeostasis and disease.</a> Open Biol. 11 (2), 200360(2021).</li>
<li>Mcdonald, D. M., Yao, L. C., Baluk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+airway+blood+vessels+and+lymphatics%3A+Lessons+from+development+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Am+Thorac+Soc%22%5BJournal%5D)">Dynamics of airway blood vessels and lymphatics: Lessons from development and inflammation.</a> Proc Am Thorac Soc. 8 (6), 504-507 (2011).</li>
<li>Parker, D., Prince, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immunity+in+the+respiratory+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Innate immunity in the respiratory epithelium.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 45 (2), 189-201 (2011).</li>
<li>Davis, J. D., Wypych, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+functional+heterogeneity+of+the+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cellular and functional heterogeneity of the airway epithelium.</a> Mucosal Immunol. 14 (5), 978-990 (2021).</li>
<li>Vareille, M., Kieninger, E., Edwards, M. R., Regamey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+airway+epithelium%3A+Soldier+in+the+fight+against+respiratory+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">The airway epithelium: Soldier in the fight against respiratory viruses.</a> Clin Microbiol Rev. 24 (1), 210-229 (2011).</li>
<li>Fosse, J. H., Haraldsen, G., Falk, K., Edelmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+in+emerging+viral+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells in emerging viral infections.</a> Front Cardiovasc Med. 8, 619690(2021).</li>
<li>Wang, Y., Zheng, J., Wang, X., Yang, P., Zhao, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alveolar+macrophages+and+airway+hyperresponsiveness+associated+with+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alveolar macrophages and airway hyperresponsiveness associated with respiratory syncytial virus infection.</a> Front Immunol. 13, 1012048(2022).</li>
<li>Costa, A., De Souza Carvalho-Wodarz, C., Seabra, V., Sarmento, B., Lehr, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+co-culture+of+human+alveolar+epithelium%2C+endothelium+and+macrophages+for+studying+the+interaction+of+nanocarriers+with+the+air-blood+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Triple co-culture of human alveolar epithelium, endothelium and macrophages for studying the interaction of nanocarriers with the air-blood barrier.</a> Acta Biomater. 91, 235-247 (2019).</li>
<li>Leibel, S. L., Mcvicar, R. N., Winquist, A. M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+3D+whole+lung+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+for+modeling+lung+developmental+biology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of 3D whole lung organoids from induced pluripotent stem cells for modeling lung developmental biology and disease.</a> J Vis Exp. (170), e62456(2021).</li>
<li>Mccauley, K. B., Hawkins, F., Kotton, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+epithelial-only+airway+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Stem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Derivation of epithelial-only airway organoids from human pluripotent stem cells.</a> Curr Protoc Stem Cell Biol. 45 (1), e51(2018).</li>
<li>Choi, K. -Y. G., Wu, B. C., Lee, A. H. -Y., Baquir, B., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+organoid+and+air-liquid+interface+models+as+a+screening+method+in+the+development+of+new+host+defense+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Utilizing organoid and air-liquid interface models as a screening method in the development of new host defense peptides.</a> Front Cell Infect Microbiol. 10, 228(2020).</li>
<li>Fulcher, M. L., Randell, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+nasal+and+tracheo-bronchial+respiratory+epithelial+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Human nasal and tracheo-bronchial respiratory epithelial cell culture.</a> Methods Mol Biol. 945, 109-121 (2013).</li>
<li>Hao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+modeling+of+SARS-COV-2+infection+of+in+vitro+cultured+polarized+human+airway+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Long-term modeling of SARS-COV-2 infection of in vitro cultured polarized human airway epithelium.</a> mBio. 11 (6), e02852-e02920 (2020).</li>
<li>Patsch, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+vascular+endothelial+and+smooth+muscle+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of vascular endothelial and smooth muscle cells from human pluripotent stem cells.</a> Nat Cell Biol. 17 (8), 994-1003 (2015).</li>
<li>Van Wilgenburg, B., Browne, C., Vowles, J., Cowley, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient%2C+long-term+production+of+monocyte-derived+macrophages+from+human+pluripotent+stem+cells+under+partly-defined+and+fully-defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient, long-term production of monocyte-derived macrophages from human pluripotent stem cells under partly-defined and fully-defined conditions.</a> PLoS One. 8 (8), e71098(2013).</li>
<li>Pouyanfard, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+macrophages+ameliorate+liver+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Human-induced pluripotent stem cell-derived macrophages ameliorate liver fibrosis.</a> Stem Cells. 39 (12), 1701-1717 (2021).</li>
<li>Ardini-Poleske, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lungmap%3A+The+molecular+atlas+of+lung+development+program%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lungmap: The molecular atlas of lung development program.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 313 (5), L733-L740 (2017).</li>
<li>Ronaghan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M1-like%2C+but+not+m0-+or+m2-like%2C+macrophages%2C+reduce+RSV+infection+of+primary+bronchial+epithelial+cells+in+a+media-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">M1-like, but not m0- or m2-like, macrophages, reduce RSV infection of primary bronchial epithelial cells in a media-dependent fashion.</a> PLoS One. 17 (10), e0276013(2022).</li>
<li>Gotoh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+alveolar+epithelial+spheroids+via+isolated+progenitor+cells+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Generation of alveolar epithelial spheroids via isolated progenitor cells from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Rep. 3 (3), 394-403 (2014).</li>
<li>Yamamoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+alveolar+stem+cells+derived+from+human+iPS+cells+in+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of alveolar stem cells derived from human iPS cells in organoids.</a> Nat Methods. 14 (11), 1097-1106 (2017).</li>
<li>Firth, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+multiciliated+cells+in+functional+airway+epithelia+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Generation of multiciliated cells in functional airway epithelia from human induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (17), E1723-E1730 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>12 kuyulu plakalar</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu uçlar, 0.4 ve mikro; m, yarı saydam ve nbsp;</td><td>VWR</td><td>10769-208</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol ve nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Yenilikçi Hücre Teknolojisi</td><td>AT104</td><td></td></tr><tr><td>Aktivin A Ar-Ge</td><td> D Systems</td><td>338-AC</td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoik asit (RA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625</td><td></td></tr><tr><td>askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>B27 retinoik asit içermez&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>BMP4&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>314-BP / CF</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA) Fraksiyon V,% 7.5 çözelti&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>Br-cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5386</td><td></td></tr><tr><td>CD 14 (FITC)</td><td>BioLegend</td><td>982502</td><td></td></tr><tr><td>CD 31 PECAM-1(APC)</td><td>R& D Sistemi</td><td>FAB3567A</td><td></td></tr><tr><td>CD 45 (PE)</td><td>BD Biosciences</td><td>560975</td><td></td></tr><tr><td>CD 68 (PE)</td><td>BioLegend</td><td>33808</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021&nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab120890</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Fujifilm</td><td>014-27501</td><td></td></tr><tr><td>Deksametazon&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>Dispase&nbsp;</td><td>StemCellTech</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10565042</td><td></td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>3093</td><td></td></tr><tr><td>E-CAD/CD 324 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324107</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>R& D Systems</td><td>236-EG</td><td></td></tr><tr><td>EGM2 Medium</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM/CD 326 (APC)</td><td>BioLegend</td><td>324212</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10082139</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>345-FG/CF</td><td></td></tr><tr><td>FGF7</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>251-KG / CF</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Fisher</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax ve nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Jambon' s F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>IBMX (3-İzobtil-1-metilksantin)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>IL-3</td><td>Peprotech</td><td>200-03</td><td></td></tr><tr><td>Iscove ' s Modifiye Dulbecco' s Orta (IMDM) + Glutamax&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>31980030</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serum Replasmanı (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Peprotech&nbsp;</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Monotiogliserol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR plus Kiti (10/kutu)</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>5825</td><td></td></tr><tr><td>N2&nbsp;</td><td></td><td>NEAA Yaşam Teknolojileri</td> 17502048 <td></td>ThermoFisher</tr><tr><td></td><td></td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Kalem/strep</td><td>Lonza</td><td>17-602F</td><td></td></tr><tr><td>ReleSR</td><td>Kök Hücre Teknolojisi</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 + Glutamax&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12633012</td><td></td></tr><tr><td>SB431542&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PeproTech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>SMA</td><td>Invitrogen</td><td>50-9760-80</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff APEL 2 Orta</td><td>KÖK HÜCRE Teknolojileri</td><td>5275</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>VEGF165</td><td>Preprotech</td><td>100-20</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin</td><td>Hücre Sinyali</td><td>5741S</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (Kaya İnhibitörü)&nbsp;</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1254/1</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Canlandırıcı</td><td>339100</td><td></td></tr></tbody></table>

akciğer sağlığı ve hastalığında hava yolu bariyeri bütünlüğünü modellemek için ipsc'den türetilmiş epitelyal, mezenkimal ve İmmün hücre ko-kültürü

iPSC-Derived Epithelial, Mesenchymal, Endothelial, and Immune Cell Co-Culture to Model Airway Barrier Integrity in Lung Health and Disease

iPSC'den türetilmiş hava yolu organoidlerinin, endotel hücrelerinin, bağışıklık hücrelerinin ve ko-kültürlerin farklılaşmasının başarıyla tamamlandığı olarak değerlendirilebileceği birden fazla aşama vardır. Farklılaşmalar farklı iPSC hatlarında gerçekleştirilebilir ve bu protokol en az beş farklı hatta test edilmiştir. Protokolün, özellikle tohumlama yoğunluğunu değiştirerek ve optimize ederek her yeni iPSC hattına uyarlanması gerekir.
iPSC'den türetilmiş hava yolu organoidlerinin başarılı verimi, parlak alan aracılığıyla değerlendirilebilir ve dört özelliğe sahip olacaktır: tanımlanmış sınırlar / kenarlar, yarı saydam / kistik morfoloji, çoğalma / genişleme yeteneği ve nekrotik hücrelerin eksikliği. Bulanık görünen hava yolu organoidleri, kültürün 2 haftası boyunca boyut olarak artmaz ve nekrozlu ko-kültür deneyleri için kullanılmamalıdır. Çevresinde kalın bir luminal tabaka bulunan organoidler vs. Yarı saydam / kistik organoidler sonraki deneyler için hala kullanılabilir. Bununla birlikte, yarı saydam/kistik hava yolu organoidleri ağırlıklı olarak bazal hücrelerden oluşurken, kalın çift zarlı organoidler ağırlıklı olarak kulüp hücrelerinden oluşur. Bazal hücreler kolayca çoğalıp genişlediğinden, hava-sıvı interfaz kültürü ve polarizasyon için daha uygundurlar. iPSC'den türetilmiş akciğer organoidlerinin başarılı verimini değerlendirmek için diğer yöntemler, başarılı bir farklılaşma verimi olan yüzey marker CPM (Tablo 1) için akciğer progenitör aşamasında (farklılaşmanın 16. günü) akış-sitometri analizidir &gt;% 50 CPM + hücreleri.
Hava yolu organoid ayrışması ve hava-sıvı interfaz kültürü için, ECM polimerinin tamamının çıkarıldığından emin olun, aksi takdirde hücrelerin zar üzerinde genişlemesini önleyecektir. Hücreler, hava kaldırmadan önce kültürün 3. gününe kadar birleşmelidir. iAirways'deki hücre tiplerinin doğrulanması, ilgili hücre tipine özgü belirteçler için boyama ile değerlendirilebilir: bazal hücreler (p63+), kulüp hücreleri (SCGB1A1+), goblet hücreleri (MUC5AC+) ve kirpikli hücreler (AcTub+). Karakterizasyon ve ayırt edici akciğer hücresi tipine özgü belirteçler LungMAP21'de doğrulanmıştır. Mezenşim, vimentin veya düz kas aktinine karşı antikorlarla tespit edilebilir. Daha fazla kirpikli hücre oluşturmak için, kültürler daha uzun bir süre hava kaldırma veya DAPT ilavesi gerektirebilir.
iPSC'den türetilmiş endotel hücrelerinin başarılı verimi, parke taşı benzeri bir morfoloji gösteren parlak alan aracılığıyla değerlendirilebilir (iPSC'den türetilmiş endotel farklılaşmasının 6. günü). Başarılı bir iPSC'den türetilmiş endotel kültürü% &gt;50 CD31 + hücre içerecektir ve sıralamadan sonra verim 500.000 hücreden fazla olacak şekilde yeterli hücre üretilmelidir. Hücreler pasajlı veya kriyoprezerve edilebilir ve CD31 markörü her pasaj veya yeni kültür ile akış yoluyla test edilmelidir. Hücreler P4'ün ötesine geçirilmemelidir. Referans için, CD31 sıralaması öncesi / sonrası iPSC'den türetilmiş endotel hücrelerine bakınız (Şekil 1C). Endotel hücreleri, uzun ve iğ şeklinde morfolojiye sahip büyük bir hücre gövdesi ile düz olacaktır.
Makrofaj farklılaşması için, embriyoid cisimleri ULA kuyusunun dibinde kalmalı ve her kuyucukta sadece bir EB bulunmalıdır. 5-7. güne kadar kistik değişiklikler göstermelidirler. Santrifüjlemeden sonra bir EB oluşturmazlarsa, iPSC'leri döndürmeden 96 oyuklu ULA plakasına tohumlayın. iPSC'lerin sayısının artırılması gerekli olabilir. iPSC'den türetilmiş bağışıklık hücrelerinin başarılı verimi, tamamen embriyoid cisimciklerinin (EB'ler) kistlere dönüşme yeteneğine bağlıdır (farklılaşmanın 7. günü). Kist geliştirmeyen iPSC'den türetilmiş immün EB'ler, jelatin üzerine kaplandığında stroma oluşturmayacak ve miyeloid progenitörler üretmeyecektir. Jelatin kaplı plakaya aktarıldıktan sonra, EB'ler plakanın dibine bağlı kalmalıdır. Plakanın hareketi, onları yerinden çıkarmamak için dikkatlice yapılmalıdır. Plakalar haftada iki kez manuel olarak değiştirilmeli ve askıya alınan hücreler Mac-CM2'ye geçirilmeli veya kriyoprezervasyonla saklanmalıdır. Ek olarak, askıya alınmış miyeloid progenitörleri hasat ettikten sonra, kaplanmamış plastik şişeye yapışmalı ve makrofajları gösteren vakuollerle parlak alan altında parlak hücreler oluşturmalıdırlar. Monositler için belirteç olan CD14+, askıda kalan hücrelerde %&gt;90 olmalıdır. Makrofaj belirteci, CD68, zamanla artmalıdır ve makrofajların ~% 50'si 2 hafta sonra CD68 + eksprese eder (Şekil 1D). Her hücre hattı için yapışma verimliliği belirlenmelidir. Ortalama yapışma verimliliği elde ediyoruz. Polarizasyon için, M0 makrofajları, farklı uyaranlarla desteklenen farklılaşma ortamı II'de 48 saat boyunca M1 (iPSC-M1) veya M2 (iPSC-M2) makrofajlarına polarize edilir: M1 polarizasyonu için 100 ng/mL LPS ve 20 ng/mL IFN-g veya M2 polarizasyonu için 50 ng/mL IL-4 ve 20 ng/mL IL-13. M1 polarizasyonu için belirteç CD80+'dır ve M2 polarizasyonu CD206+'dır.
Üçlü ko-kültürün başarılı bir şekilde oluşturulması, epitelyal sıkı bağlantı belirteçleri EPCAM, ECAD veya ZO-1 veya endotelyal sıkı bağlantı belirteci CD31 için immünofloresan yoluyla değerlendirilebilir (Şekil 2C, Tablo 1). Üçlü ko-kültürün işlevselliği, trans-elektriksel epitelyal / endotelyal direnç (TEER) ile de değerlendirilebilir. İyi monte edilmiş hava yolu organoid ve endotelyal ko-kültürleri, optimal hücre iletişimini ve bağlantısını gösteren daha büyük bir elektrik direncine sahip olacaktır. E-sigaralar veya viral meydan okuma gibi çevresel hakaretler, epitel ve endotel bariyerinin bütünlüğünü tehlikeye atacak ve ko-kültürün elektrik direncinin azalmasına (Şekil 3A,B) ve düzensiz sıkı bağlantılara (Şekil 3C) neden olacaktır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig01v2.jpg"> 
Şekil 1: iPSC'den türetilmiş hava yolu epiteli, endotel ve immün kültürlerin farklılaşması ve karakterizasyonu. (A) iAirway'in montajı için iPSC'ye yönelik farklılaşmaların şeması. (B) EPCAM ve ECAD için parlak alan (solda) ve akış sitometrisi analizi (sağda) ile karakterize iPSC'den türetilmiş hava yolu epitel organoidleri. (C) CD31 için parlak alan (solda), immünofloresan ve akış sitometrisi analizi (sağda) ile karakterize iPSC'den türetilmiş hava yolu endotelyumu. CD31 sıralamasından sonraki ilgili parlak alan sağda gösterilmiştir. (D) iPSC'den türetilmiş makrofajlar, pan hematopoietik belirteç CD45, monosit yapıcı CD14 ve makrofaj belirteç CD68 için parlak alan (solda) ve akış sitometrisi analizi (sağda) ile karakterize edilir. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig01largev2.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig02.jpg"> 
Şekil 2: iPSC'den türetilmiş epitelyal, mezenkimal ve makrofaj hücrelerinin ko-kültürü. (A) iAirway montajının şeması. (B) İlgili epitelyal ve endotelyal monokültürün, epitelyal ve endotelyal bi-kültürün ve epitelyal, endotelyal ve makrofaj ko-kültürünün parlak alan görüntüleri. Kırmızı sitotracker ile etiketlenmiş makrofajlar. Ölçek çubukları: 100 μm. (C) Hücre kültürü ekinin apikal tarafında sıkı bağlantı markörü ZO-1 ve bazolateral tarafta CD31 için immünofloresan boyama. Ölçek çubukları: 100 μm. (D) Apikal tarafta ayrışmış hava yolu organoidleri ile hücre kültürü ekinin kesiti, hava asansöründen 1 hafta sonra. Siyah okla H&amp;E boyamalı sol panel, kirpikli hücreleri gösterir. İmmünofloresan görüntüleme ile orta panel, epitel belirteci E-kaderin'i (ECAD) gösterir. İmmünofloresan görüntüleme ile sağ panel, vimentin (VIM) ve düz kas aktini (SMA) gibi mezenkimal belirteçleri gösterir. Ölçek çubukları: 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67247/67247fig03.jpg"> 
Şekil 3: E-sigara ve virüslere maruz kalan iAirways'in hava yolu bariyer fonksiyonundaki değişiklikler. (A) Trans-elektrik epitelyal/endotelyal direnç (TEER) ölçüm aracının şeması. (B<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/67247fig03large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67247/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank"></a>

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSC'den Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü

Human lung tissue is composed of an interconnected network of epithelium, mesenchyme, endothelium, and immune cells from the upper airway of the ...

ipsc-derived-epithelial-mesenchymal-endothelial-immune-cell-co

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gelişim Biyolojisi

Burada sunulan birincil insan kanı monosit izolasyon yanı sıra makrofajlar ve dendritik hücreler ve çok hücreli insan akciğer modeli içine epitel hücreleri ile montaj içine farklılaşma için bir protokoldür. Proinflamatuar uyaranlara maruz kalındığında, taze izole edilmiş veya çözülmüş monositlerden farklı bağışıklık hücrelerinden oluşan kokültürlerin biyolojik yanıtları karşılaştırılır.

Tehlike Değerlendirmesi İçin Epitel Hücreleri ve Primer İmmün Hücrelerden Oluşan Çok Hücreli İnsan Alveoler Modeli

Bu makalede, insan akciğerinin proksimal ve distal bölgelerinden canlı epitel hücrelerinin zenginleştirilmesine izin veren doku dissosiyasyonu ve hücresel fraksiyonasyon yaklaşımları için ayrıntılı bir metodoloji sunulmaktadır. Bu yaklaşımlar, akciğer epitel progenitör hücrelerinin fonksiyonel analizi için 3D organoid kültür modelleri kullanılarak uygulanmaktadır.

Organoid Kültür için İnsan Akciğer Epitel Progenitör Hücrelerinin İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi

Mevcut protokol, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı tip 2 alveoler epitel benzeri hücreleri (iAT2'ler) tanımlamaktadır. Bu hücreler 3D kültürde kendini yenileyen küreler olarak kültürlenebilir veya hava-sıvı arayüzü (ALI) kültürüne uyarlanabilir.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Tip 2 Alveolar Epitel Hücrelerinin 3D Küreleri ve 2D Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Üretilmesi

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre farklılaşma protokollerindeki son gelişmeler, organa özgü hücre tiplerinin kademeli olarak türetilmesine izin vermektedir. Burada, iPSC türevi hava yolu bazal hücrelerinin bakımı ve genişlemesi ve hava-sıvı arayüz kültürlerinde mukosiliyer bir epitel halinde farklılaşması için ayrıntılı adımlar sunuyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Hava Yolu Epitel Hücresi Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Sunulan protokol, mikroakışkan dinamik kültür kanallarında ve geleneksel sabit kuyu statik kültür odalarında yapışkan hücre tabakası yapısını görselleştirmek için konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) ile falloidin bazlı filamentöz-aktin boyama tekniğinin geliştirilmesini ve kullanımını açıklamaktadır. Bu yaklaşım, hücre katmanı akıcılığını, tek katmanlı oluşumu ve katman kalınlığı homojenliğini değerlendirmeye yardımcı olur.

Fizyolojik Boyutta Bir Mikroakışkan Kültür Cihazında Epitel Hücre Tek Katmanlarının Hazırlanması ve Yapısal Değerlendirilmesi

Burada, uzun süreli biyobankacılık için primer bronşiyal epitel hücrelerinin izolasyonu ve genişletilmesi ve hava-sıvı arayüzünde kültür yoluyla farklılaşmış epitel hücrelerinin üretilmesi için tekrarlanabilir, uygun fiyatlı ve sağlam bir yöntem sunulmaktadır.

Bronşiyal Epitel Hücrelerinin Biyobankacılık için Rezeke Akciğer Dokusundan İzole Edilmesi ve İyi Diferansiye Hava-Sıvı Arayüz Kültürlerinin Oluşturulması

Bu rapor, kan-beyin bariyeri modellerinin oluşturulması için μSiM platformunda montaj, hücre kültürü ve tahliller için protokoller sağlar.

Kan-Beyin Bariyerini Modellemek için MicroSiM (μSiM) Bariyer Doku Platformunun Kullanımı

Burada, insan özofagus organoidlerinin kültürü ve hava-sıvı arayüz kültürü için bir protokol sağlanmıştır. Özofagus organoidlerinin hava-sıvı arayüz kültürü, sitokinlerin özofagus epitel bariyeri üzerindeki etkisini incelemek için kullanılabilir.

Eozinofilik Özofajitte Epitel Bariyerini Araştırmak İçin Üç Boyutlu Hücre Kültürü Modelleri 

Burada, murin hava yolu epitel hücrelerini izole etmek ve farklılaştırmak için, kronik sigara dumanı ekstraktına (CSE) alışmalarına odaklanan bir in vitro model açıklıyoruz. Model, CSE'nin multi-omik etkisini kapsamlı bir şekilde karakterize etmek için kullanılabilir, bu da muhtemelen kronik duman maruziyeti altındaki hücresel tepkiler hakkında bilgi sağlar.

Sigara Dumanı Ekstraktı ile Uyarılan Murin Hava Yolu Epitel Hücrelerinde Multi-Omiklerin Farklılaşması ve Değişikliklerinin İncelenmesi için İn Vitro Model

Bu protokol yenidoğan farelerde ve prepubertal farelerden alınan bireysel yumurtalık folikülleri gelen yumurtalıklarını kullanarak, fare yumurtalık dokusunun primer kültür / ko-kültür açıklar. kültür teknikleri yumurtalık üzerindeki dışsal ajanların etkisi soruşturma olanak veren yüksek fizyolojik bir şekilde gelişimini desteklemek ve yumurtalık foliküllerinin arasındaki etkileşimlerin.

Kültür ve Co-Kültür Mouse Yumurtalıklar ve Yumurtalık Foliküller

Keşfedin, iPSC'den türetilmiş epitel, mezenkimal, endotel ve makrofaj hücreleriyle hava yolu bariyeri modellemesini. Bu yöntem, akciğer sağlığı ve hastalıklarında hava yolu yeniden şekillenmesini in vivo çalışmak için değerli bir araç sunar.

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSCden Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü (Video) | JoVE Journal

Akciğer Sağlığı ve Hastalığında Hava Yolu Bariyeri Bütünlüğünü Modellemek için iPSC'den Türetilmiş Epitelyal, Mezenkimal ve İmmün Hücre Ko-Kültürü

Daha fazla video keşfet