Name: IDH1-mutant Diffüz Düşük Dereceli Gliomların Eksplant Kültürleri için Bir Protokol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-09T12:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Öğrenin, IDH1-mutant diffüz düşük dereceli gliomalar için enzimatik olmayan eksplant kültür protokolünü. Bu yöntem, uzun süreli hücre canlılığını koruyarak glioma biyolojisini anlamaya ve tedavi geliştirmeye katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Burada kullanılan tümör parçaları, Montpellier Üniversitesi Hastanesi'ndeki (CRB@chu-montpellier.fr) Biyolojik Kaynak Merkezi tarafından tutulan taze doku örneklerinin NEUROLOGY koleksiyonunun bir parçasıdır. Bu araştırma, Prof. J. P. Hugnot'un yürütücüsü olduğu "Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas" başlıklı proje kapsamında gerçekleştirilmiştir (Proje No. RECH/P722/1-5). Bu çalışma La ligue contre le cancer, ARC (Kanser Araştırmaları Derneği), ARTC, ARTC SUD, Les Etoiles dans la mer, EMBALL'ISO, Région Occitanie, INCA tarafından desteklenmiştir. K.A.C, Meksika'daki Ulusal Beşeri Bilimler Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONAHCYT) ve Fransa'daki Beyin Tümörü Araştırmaları Derneği (ARTC) tarafından desteklenmektedir.

Bu protokolde kullanılan tümör fragmanları, hasta onamı alınmış, iyi tanımlanmış ve etik onaylı bir koleksiyondan temin edilmiştir. Bu araştırma, Gliomacult: Characterization and Primary Cultures of Low-Grade Gliomas (Proje No. RECH/P722/1-5) başlıklı proje kapsamında yürütülmüş ve 28 Ağustos 2023 tarihinde tümör biyobankasının bilimsel kurulu tarafından onaylanmıştır.
1. Kültür plakalarının hazırlanması
NOT: Bu adımları steril bir doku kültürü laminar akış kabini altında gerçekleştirin.
<ol>
	<li>Kültürden en az 1 saat önce, poli-D-lizin (PDL) ve laminin kaplı 24 kuyucuklu plakaları hazırlayın.
	<ol>
		<li>100 µg/mL son konsantrasyon için 10 mg PDL tozunu 100 mL borat tamponunda (pH 8.4) seyreltin. Çözündükten sonra, sterilite için çözeltiyi filtreleyin (0.22 µm). PDL kullanıma hazırdır; 3 mL'lik alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın.</li>
		<li>Jelleşmeyi önlemek için 1-2 mg/mL laminin tüpünü 4 °C'de çözdürün. 50 µL'lik alikotlar hazırlayın ve -20 °C'de saklayın. 
		NOT: Tekrarlayan çözdürme ve dondurma işlemlerinden kaçınılmalıdır.</li>
		<li>Plaka kaplama
		<ol>
			<li>Opsiyonel adım: hücre kültürü kaplarına uygun Ø, 13 mm steril lamelleri, her kuyucuğa bir adet gelecek şekilde 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. 
			NOT: Bu adım, gliom eksplantlarının daha sonraki immünboyaması içindir.</li>
			<li>Kuyucukların kaplanması için, 3 mL PDL çözeltisini 9 mL 1x PBS ile karıştırın ve 50 µL laminin ekleyin. 1-2 µg/cm² kaplama konsantrasyonu için her kuyucuğa bu çözeltiden 500 µL ekleyin. Kaplanmış plakaları oda sıcaklığında, tercihen yavaş sallama (15 RPM) ile en az 1 saat inkübe edin.</li>
			<li>Kültürden hemen önce, PDL-laminin çözeltisini uzaklaştırın ve steril 1x PBS ile iki kez durulayın. 
			NOT: Kuyucukların kurumasını önleyin.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Besiyerleri
<ol>
	<li>IDH1-mutant eksplantları, L-glutamin ile desteklenmiş DMEM/F12 ve Vitamin A içermeyen N2 ve B27'den oluşan bir serum ikame karışımı içeren tanımlanmış bir ortamda kültüre edin. Bakteriyel ve fungal kontaminasyonu önlemek için siprofloksasin, gentamisin ve fungin dahil olmak üzere antibiyotikler kullanın. Ek olarak, ortama büyüme faktörleri olan heparin, EGF ve FGF2 ekleyin, ortamı filtreleyin (0.2 µm) ve 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın. 
	NOT: Ortam bileşenleri ve hazırlama detayları için Tablo 1'e ve Materyal Tablosu'na bakın.</li>
</ol>
3. Eksplant hazırlama
<ol>
	<li>Numune işlemeye başlamadan önce, çalışma alanını ve steril aletleri şurada gösterildiği gibi hazırlayın Şekil 1ABir soğutma paketini %70'lik etanol püskürterek sanitize edin. Makas ve penseti %70'lik etanola daldırıp PBS ile durulayarak sterilize edin.</li>
	<li>Tümör rezeksiyonunu, ideal olarak cerrahi çıkarma sonrası 2 saat içinde, kültür için buz üzerinde hızla transfer edin (Şekil 1B). 
	NOT: Daha iyi sonuçlar elde etmek için tümör örneğinin çapı minimum 9-10 mm olmalıdır. Histolojik amaçlar için bu yöntem tercih edildiğinden, doku kültür ortamı olmadan taşınır. Sıvının bulunmaması, hızlı dondurma sırasında buz kristali oluşumunu önleyerek, gerektiğinde yapılacak sonraki histolojik incelemeler için doku bütünlüğünü korur.</li>
	<li>Tümör örneğinin bulunduğu kültür kabını soğutucu paketin üzerine yerleştirin ve fazla kanı uzaklaştırmak için 1X PBS ile nazikçe durulayın.</li>
	<li>Rezeke edilen tümör genellikle, tümör kitlesini, infiltre olmuş dokuyu ve tümöral olmayan bileşenleri içeren belirgin bir boyut ve heterojenlik sergiler (Şekil 1C). Tümör hücresi izolasyonu için gri renkli, yumuşak veya jöle benzeri dokuya sahip bölgeleri seçin; çünkü bu bölgeler daha fazla tümör hücresi içerme eğilimindedir. Aksine, kültür için uygun daha az tümör hücresi içerebileceği için sert ve beyaz bölgelerden kaçının (Şekil 1Delektrokoter sonucu oluşmuş olma ihtimali yüksek olan ve analiz için güvenilir sonuçlar vermeyebilecek kararmış alanlar ile birlikte)</li>
	<li>Seçilen örnekleri, parçalamak üzere 1,5 mL'lik bir mikrotüpe veya kriyotüpe aktarın. 1,5 mL'lik mikrotüpe veya kriyotüpe 1 mL steril besiyeri ekleyin ve örneği, küçük parçalar (1-2 mm) oluşana kadar steril makasla doğrayın.3elde edilir. 
	NOT: Genellikle 1-2 mm boyutunda küçük parçalar elde etmek için yaklaşık 1-2 dakika doğrama işlemi gereklidir3 boyutunda (Şekil 1E).</li>
	<li>Steril makasla, mavi bir ucu dikkatlice kesin 1,000 µL geniş bir açıklık oluşturmak için pipet ucunu kesin, açıklık yaklaşık 3-4 mm çapında olmalıdır. Bu modifiye edilmiş ucu kullanarak 50-200 µL doğranmış doku fragmanlarını her bir kuyucuğa eşit şekilde dağıtın. Küçük parçalar hızla çökmeye meyilli olduğu için, homojen dağılımı sağlamak amacıyla her kuyucuktaki süspansiyonu nazikçe yeniden homojenize edin. 
	NOT: Aşırı yoğunluktan kaçının ve her bir kuyucuğa çok fazla fragman eklemeyerek dengeyi sağlayın (Şekil 1F).</li>
	<li>Tümör fragmanlarını şu sıcaklıkta inkübe edin: 37°C %5 CO2'li ve %100 nemli bir inkübatörde. Tümörün metabolik aktivitesi (medyumnun hızla sararmasıyla belirtilir) ve her kuyuktaki fragman sayısı gerektiriyorsa, medyumu her gün değiştirin. Medyum değişimleri sırasında, şu ekipmana sahip bir pipet kullanarak medyumu dikkatlice aspire ederek özen gösterin: 200 µL uç kısmıyla, yapışmış tümör fragmanlarını rahatsız etmemeye dikkat ederek.</li>
</ol>
<img alt="Tümör doku hazırlama süreci; ekipman kurulumu; doku örnekleri; santrifüj sonuçları; analiz şeması." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67260/67260fig01.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Şekil 1"> 
Şekil 1: Tümör eksplant kültürü prosedürü. WHO 2021 sınıflamasına göre evre II astrositoma tanısı konmuş 44 yaşındaki bir hastadan yaygın düşük dereceli gliom rezeksiyonu örneği alınmıştır. Tümör, IDH1 mutasyonu (Ekzon 4 c.395 G&gt;A, p.Arg132His) ve TP53 mutasyonu (Ekzon 8 c.843_844delinsGT, p.Asp281_Arg282delinsGluHis) sergilemiş, ayrıca ATRX boyamasının yokluğu gözlemlenmiştir. TERT geninin Ets/TCF bağlanma bölgelerinde (C250T ve C228T) herhangi bir mutasyon saptanmamıştır. (A) Çalışma yüzeyi, örnek bozulmasını minimize eden ve biyolojik bileşenlerin canlılığını koruyan bir ortam sağlayan soğutucu paketten oluşmaktadır. Bu önlemler, dokunun kalitesini ve bütünlüğünü korumak açısından önemlidir. (B) Örneğin hastaneden laboratuvara nakliyesi buz üzerinde yapılmalıdır. (C) Tümör rezeksiyon fragmanı. Oklar, kültür için en uygun kısımları göstermektedir. (D) Ezilecek en uygun kısmın seçilmesi için tümör diseksiyonu gerçekleştirilir. Deneyimlerimize göre, beyaz cevherin başarılı eksplantlar oluşturma olasılığı genellikle daha düşüktür. (E) Makasla mekanik olarak ezildikten sonra 15 mL'lik tüpte bulunan yaklaşık 1-2 mm³ çapındaki tümör fragmanları. (F) Uygun ekim için gereken tümör parçası sayısı, 24 kuyucuklu plakadaki kuyucuklar için gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67260/67260fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Kıyılmış tümör kriyoprezervasyonu ve çözme
NOT: Kriyokoruma, kontaminasyon veya eksplant kültürlerinin kaybı durumunda yedekleme sağlamak ya da tümör örneklerini daha sonra işlemek için uygulanır.
<ol>
	<li>Kriyoprezervasyon: 8 mL hücre kültür ortamına 2 mL DMSO ekleyerek dondurma ortamını (%20 v/v DMSO çözeltisi) hazırlayın.</li>
	<li>Sıvı DMSO'nun nihai konsantrasyonunu %10'a getirmek için, doğranmış tümör süspansiyonundan 1 birimi, eşit hacimdeki %20'lik DMSO dondurma ortamı ile birleştirin. Tam karışımı sağlamak için karışımı dikkatlice pipetle aşağı yukarı karıştırın, ardından kriyotüplere yaklaşık 1 mL dağıtın.</li>
	<li>Sıvı azota nihai depolamadan önce, kademeli sıcaklık düşüşü için kriyotüpleri hızla bir kriyojenik konteynere aktarın ve ardından -80 °C'de gece boyu inkübe edin. 
	NOT: Bu adım, hücreler dondurma ortamına yerleştirildikten hemen sonra gerçekleştirilmelidir; çünkü DMSO gibi bazı kriyoprotektanlar, hücreler oda sıcaklığında gerekenden daha uzun süre bunlara maruz kalırsa zararlı olabilir.</li>
	<li>Çözdürme: Kriyotüpleri sıvı azottan çıkarın ve hücrelerin yaklaşık %80'i çözünene kadar hemen 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirin.</li>
	<li>DMSO'yu uzaklaştırmak için süspansiyonu hızla 5 mL önceden ısıtılmış 1x PBS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne pipetleyin ve 300 × g hızda 5 dk santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatantı uzaklaştırın ve 1X PBS ile yıkama işlemini ardından santrifüjle (adım 4.5) tekrarlayın. Peleti dağıtmamaya dikkat ederek süpernatantı aspire edin ve önceden kaplanmış PDL-Laminin 24 kuyucuklu plakaya aktarmak için uygun miktarda ortam ekleyip inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>24 saat sonra hücrelerin yapışıp yapışmadığını doğrulayın. Birkaç gün sonra, kültür ortamını değiştirerek yapışmamış fragmanları uzaklaştırın.</li>
</ol>
5. Kültürün pasajlanması
NOT: Eksplantlar yerleştikten sonra videomikroskopi veya immün boyama için kullanılabilir. Alternatif olarak, tümör hücreleri eksplanttan dışarı göç etmişse ve sağlıklı görünüyorsa, eksplant enzimatik ayrıştırma yoluyla pasajlanabilir ve daha fazla deney için kuyucuklara yeniden ekilebilir. Bununla birlikte, bu protokolün tekrarlanan pasajlamalar için tasarlanmadığını belirtmek önemlidir. Genellikle, tümör hücreleri yaşlanmadan veya ölmeden önce yalnızca tek bir pasaj denemesi yapılabilir. Tüm eksplant kültürleri başarılı pasajla sonuçlanmayacaktır.
<ol>
	<li>Pasajlamak için eski medyumu uzaklaştırın, 1X PBS ile durulayın, kuyucuklara (125 µL) %0,05 trypsin-EDTA ekleyin ve 37 °C'de 3-4 dk inkübe edin; ardından 6,5 µL Trypsin Inhibitor, 12 µL 20 mM CaCl2 (final dilüsyonu 2mM olacak şekilde) ve 1 µL DNAse I ekleyin. 
	NOT: Disosyasyon için gereken inkübasyon süresi kültüre bağlı olarak değişebilir. Hücrelerin en az 3 dk sonra ayrılıp ayrılmadığını kontrol etmek önemlidir. Genellikle eksplantlar tamamen tek hücre süspansiyonuna ayrılmayabilir ve yeni eksplant kültürleri oluşturabilen küçük kümeler sıklıkla kalır.</li>
	<li>500-600 µL'ye ayarlanmış bir p1000 ile eksplantları dağıtmak için nazikçe yıkayın. Kabarcık oluşumundan kaçının.</li>
	<li>5 mL 1x PBS ekleyin ve 300 × g hızda 5 dk santrifüjleyin. Süpernatantı aspire edin, pelletini önceden ısıtılmış taze medyumda yeniden süspanse edin ve ekim için hücre sayımı yapın.</li>
	<li>Faz kontrast mikroskobu altında bölünen hücreleri gözlemleyerek hücre hattı oluşturma potansiyeli olan kültürleri belirleyin. Bu bölünen hücreler, Şekil 2A'da gösterildiği gibi tipik olarak yuvarlak bir morfolojiye ve görünür kromozomlara sahiptir.</li>
</ol>

<ol><li>Dasgupta, P., Balasubramanyian, V., De Groot, J. F., Majd, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+of+low-grade+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Preclinical models of low-grade gliomas.</a> Cancers (Basel). 15 (3), 596(2023).</li>
<li>Tirosh, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+supports+a+developmental+hierarchy+in+human+oligodendroglioma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma.</a> Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).</li>
<li>Jooma, R., Waqas, M., Khan, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+low-grade+glioma+-+changing+concepts+in+diagnosis+and+management%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Diffuse low-grade glioma - changing concepts in diagnosis and management: A review.</a> Asian J Neurosurg. 14 (2), 356-363 (2019).</li>
<li>Louis, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathology+of+malignant+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Molecular pathology of malignant gliomas.</a> Annu Rev Pathol. 1, 97-117 (2006).</li>
<li>Adenis, L., Plaszczynski, S., Grammaticos, B., Pallud, J., Badoual, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+radiotherapy+on+diffuse+low-grade+gliomas+evolution%3A+Confronting+theory+with+clinical+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">The effect of radiotherapy on diffuse low-grade gliomas evolution: Confronting theory with clinical data.</a> J Pers Med. 11 (8), 818(2021).</li>
<li>Pirozzi, C. J., Yan, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+implications+of+idh+mutations+for+cancer+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">The implications of idh mutations for cancer development and therapy.</a> Nat Rev Clin Oncol. 18 (10), 645-661 (2021).</li>
<li>Van Den Bent, M. J., Smits, M., Kros, J. M., Chang, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffuse+infiltrating+oligodendroglioma+and+astrocytoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Diffuse infiltrating oligodendroglioma and astrocytoma.</a> J Clin Oncol. 35 (21), 2394-2401 (2017).</li>
<li>Suva, M. L., Tirosh, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glioma+stem+cell+model+in+the+era+of+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The glioma stem cell model in the era of single-cell genomics.</a> Cancer Cell. 37 (5), 630-636 (2020).</li>
<li>Augustus, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+CRYAB%2B+KCNN3%2B+SOX9%2B+astrocyte-like+and+EGFR%2B+PDGFRA%2B+OLIG1%2B+oligodendrocyte-like+tumoral+cells+in+diffuse+idh1-mutant+gliomas+and+implication+of+NOTCH1+signalling+in+their+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Identification of CRYAB+ KCNN3+ SOX9+ astrocyte-like and EGFR+ PDGFRA+ OLIG1+ oligodendrocyte-like tumoral cells in diffuse idh1-mutant gliomas and implication of NOTCH1 signalling in their genesis.</a> Cancers (Basel). 13 (9), 2107(2021).</li>
<li>Hubert, C. G., Rich, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+explants+as+tumor+models%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Patient-derived explants as tumor models.</a> Cancer Cell. 40 (4), 348-350 (2022).</li>
<li>Abdullah, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+patient-derived+organoid+models+of+lower-grade+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Establishment of patient-derived organoid models of lower-grade glioma.</a> Neuro Oncol. 24 (4), 612-623 (2022).</li>
<li>Yuzhakova, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+3d+tumor+spheroid+model+from+the+patient%27s+glioblastoma+cells+and+its+study+by+metabolic+fluorescence+lifetime+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sovrem+Tekhnologii+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a 3d tumor spheroid model from the patient's glioblastoma cells and its study by metabolic fluorescence lifetime imaging.</a> Sovrem Tekhnologii Med. 15 (2), 28-38 (2023).</li>
<li>Kloosterman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology+of+microglia+across+contexts+of+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Morphology of microglia across contexts of health and disease.</a> Cell. 187, 5336-5356.e30 (2024).</li>
<li>Thomas, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+updates+to+the+World+Health+Organization+classification+of+adult-type+and+pediatric-type+diffuse+gliomas%3A+A+clinical+practice+review%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">2021 updates to the World Health Organization classification of adult-type and pediatric-type diffuse gliomas: A clinical practice review.</a> Chin Clin Oncol. 12 (1), 7(2023).</li>
<li>Azar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+characterization+of+IDH1-mutated+diffuse+low+grade+gliomas+reveals+tumor+heterogeneity+and+absence+of+EGFR%2FPDGFRalpha+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular characterization of IDH1-mutated diffuse low grade gliomas reveals tumor heterogeneity and absence of EGFR/PDGFRalpha activation.</a> Glia. 66 (2), 239-255 (2018).</li>
<li>Bhaduri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+radial+glia-like+cancer+stem+cells+contribute+to+heterogeneity+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Outer radial glia-like cancer stem cells contribute to heterogeneity of glioblastoma.</a> Cell Stem Cell. 26 (1), 48-63.e6 (2020).</li>
</ol>

Yazarların beyan edecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

IDH1 mutant düşük dereceli gliomlar için in vitro ve preklinik modeller geliştirmek, bu tümörlerin yavaş büyümesi ve IDH mutasyonunun neden olduğu kapsamlı genomik ve epigenomik değişikliklerin kopyalanmasının karmaşıklığı nedeniyle özellikle zorludur. Ayrıca, bu infiltratif tümör hücreleri; immün, endotelyal, glial ve nöronal hücreler dahil olmak üzere çevre hücrelerle aktif olarak etkileşime girer ve hayatta kalmak için potansiyel olarak bunlara dayanır. Bu karmaşık etkileşimi bir laboratuvar ortamında yeniden oluşturm...

Diffüz gliomlar en sık görülen primer beyin tümörleridir. Bu tümörler şu anda çok yoğun tedaviye (cerrahi, radyo ve kemoterapi) rağmen tedavi edilememektedir1. Artan kanıtlar, gliomagenezin beyinde bulunan yetişkin kök veya glial progenitör hücrelerden kaynaklandığı hipotezini desteklemektedir2. Glioblastomlar en agresif tipi temsil etse de, diffüz düşük dereceli gliomlar (DLGG, grade 2 tümörler) de yaygındır (diffüz gliomların %15'i)1,3. DLGG'ler yavaş büyür ve bu 'dağınık' neoplazm4'ün ayırt edici özelliği olan beyaz cevher yolları boyunca göç eder. Bu DLGG'ler tedaviye rağmen sıklıkla tekrarlar ve sonuçta yüksek dereceli malignitelere (derece 3 ve 4)5) ilerler.
DLGG, izositrat dehidrojenaz 1 veya 2 geninde (IDH1 veya IDH2) bir yanlış anlamlı mutasyon ile karakterize edilir ve bu da onkometabolit 2-hidroksilütaratın (2HG) anormal üretimine neden olur. Bu, epigenetik disregülasyonlar6 yoluyla hücre farklılaşmasını bozar. IDH1-mutant gliomlar ayrıca alt tiplere ayrılır: astrositomlar tipik olarak ATRX ve P53'te mutasyonlara sahipken, oligodendrogliomlar 1p19q delesyonları7 ile karakterize edilir. Bu tümörler tümöral hücrelerin heterojenliğini sergiler. Tek hücreli RNA dizilimi ve immünokarakterizasyonu, bu tümörler içinde kök hücre benzeri, astrosit benzeri ve oligodendrosit benzeri fenotipler sergileyen çeşitli tümör hücresi popülasyonunu ortaya çıkarmıştır8,9.
Kolayca bulunabilen, uzun süreli kültürlerden ve hücre hatlarından yararlanan glioblastomun aksine, IDH1 mutant tümörlerini araştırmak için özel olarak tasarlanmış hücresel araçların kayda değer bir kıtlığı vardır1. Bu, terapötik gelişimi ilerletmek ve IDH1-mutant gliomagenez ve hastalık ilerlemesi hakkındaki anlayışımızı derinleştirmek için önemli bir engel teşkil etmektedir. Geleneksel serumla yetiştirilen hücre hatları, uzun süre kullanılırken, orijinal tümörleri yetersiz bir şekilde çoğaltır ve değiştirilmiş transkripsiyonel profiller gösterir. Alternatif olarak, ister 2D ister 3D tümöroid modellerde olsun, serumsuz kültür koşulları, tümör hücrelerinin transkripsiyonel profillerini ve normal beyin dokusuna invazyon gibi in vivo fenotiplerini daha etkili bir şekilde korur10,11.
Ek olarak, bir hastanın cerrahi örneğinden türetilen kısa süreli hücre kültürleri, tümörün moleküler profilini ve hücresel çeşitliliğini korur, böylece hücre hatlarına kıyasla tümörlerin biyolojik özelliklerini daha iyi temsil eder12. Burada, glioma araştırması ve terapötik geliştirme için geliştirilmiş in vitro modellere olan ihtiyacı ele almayı amaçlayan, taze veya donmuş hasta rezeksiyonlarından türetilen eksplantlar olarak IDH1 mutant diffüz düşük dereceli gliom kültürünü kültürlemek için basit, enzimatik olmayan bir yöntem sunuyoruz. Ayrıca IDH1-mutant hücre hatlarını türetme potansiyeli de sunarlar.

<table><tbody><tr><td>Anti-ASCL1</td><td>BD Pharmingen ve ticaret;</td><td>556604</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Anti-ATRX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA001906</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Agilent</td><td>M081401-2</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Anti-GFAP</td><td>Aves Labs</td><td>AB_2313547</td><td>Seyreltme 1:500</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Fujifilm Wako Antikorları</td><td>019-19741</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-IDH1 (R132H) fare Monoklonal Antikoru</td><td>Dianova</td><td>DIA-H09</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki67</td><td>BD Pharmingen ve ticaret;</td><td>556003</td><td>Dilituion 1:1000</td></tr><tr><td>Anti-OLIG1</td><td>R& D Sistemleri&reg;</td><td>AF2417</td><td>Dulituion 1:300</td></tr><tr><td>Anti-OLIG2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MABN50</td><td>Seyreltme 1:250</td></tr><tr><td>Anti-SOX9</td><td>Abcam&reg;</td><td>EPR14335-78</td><td>Seyreltme 1:100</td></tr><tr><td>B-27 Takviyesi (50x), eksi A vitamini</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serum Albümini (BSA)</td><td>CiteAb</td><td>A-421-100</td><td></td></tr><tr><td>Siprofloksasin HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1044-1G</td><td></td></tr><tr><td>CoolCell</td><td>Corning&reg;</td><td>432000</td><td>Hücre Dondurma Kabı, 12 x 1 mL veya 2 mL Kriyojenik Şişeler için</td></tr><tr><td>Kapak kayma ve oslash;, 13 mm</td><td>Karl Hecht&trade; Asistan ve ticaret;</td><td></td><td></td>328017</tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, glutamin içermez</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21331020</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Fosfat Tamponlu Tuzlu Su (PBS) 1x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm TC ile işlenmiş Hücre Kültürü Kabı</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>353003</tr><tr><td>Falcon 24 kuyulu Temizle Düz Tabanlı</td><td>Corning&reg;</td><td>353047</td><td>TC ile muamele edilmiş Çok Kuyulu Hücre Kültürü Plakası, Kapaklı, Steril ve nbsp;</td></tr><tr><td>Fungin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-fn-1</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15750-037</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-100KU</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td></td></tr><tr><td>İnsan EGF</td><td>PeproTech</td><td>AF-100-15-1MG</td><td></td></tr><tr><td>İnsan FGF-temel</td><td>PeproTech</td><td>100-18B-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>N-2 Takviyesi (100x)</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>PDL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7886</td><td></td></tr><tr><td>GF / 0.2 ve mikro ile serum akrodiski 37 mm şırınga filtresi; m Supor</td><td>PALL Corporation</td><td>4525</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin İnhibitörü</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Z1 Apotome 3 mikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>düz geniş alan epifloresan mikroskobu</td></tr></tbody></table>

idh1-mutant diffüz düşük dereceli gliomların eksplant kültürleri için bir protokol

A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

En sık görülen primer beyin tümörleri olan diffüz gliomlar, histopatolojik kriterlere ve genetik mutasyonlara göre düşük ve yüksek dereceli olarak kategorize edilir. Diffüz düşük dereceli gliomlar, ağırlıklı olarak genç erişkinleri etkileyen ve yüksek dereceli gliomlara yatkınlık yaratan bir alt küme oluşturur. İki ana diffüz düşük dereceli gliom türü vardır: astrositomlar ve oligodendrogliomlar, her biri farklı genetik ve histolojik özelliklerle tanımlanır. Bu tümörler karakteristik olarak metabolik enzim IDH1'in mutasyona uğramış bir varyantını sergiler ve hücresel farklılaşmayı bozar. Heterojendirler, hem proliferatif kök hücreleri hem de daha farklılaşmış, hareketsiz glial hücreleri içerirler. 
Hastaya özgü, in vitro tümör modelleri, onkojenik mekanizmaların çözülmesi ve kişiselleştirilmiş tedavi için ilaç seçiminin uyarlanması için önemli bir potansiyele sahiptir. Bununla birlikte, özellikle IDH1 mutant düşük dereceli gliomlar için güvenilir in vitro modellerin olmaması, temel ve translasyonel araştırmaları engellemiştir. Burada, IDH1-mutant tümörleri enzimatik ayrışmaya ihtiyaç duymadan tanımlanmış ortamlarda eksplantlar olarak kültürlemek için basit bir yöntem sunuyoruz. Bu eksplantlar, IDH1-mutant protein ekspresyonunun yanı sıra ASCL1 (MASH1), OLIG1 ve OLIG2 gibi oligodendrosit progenitör hücreleri ve astrositler (GFAP, SOX9) için belirteçleri koruyarak uzun süre sürdürülebilir. DMSO'daki donmuş tümörlerden de kurulabilirler. Bu kültürler, ilaç taraması, videomikroskopi ve gen çalışmaları için değerli bir platform görevi görebilir ve böylece bu zorlu tümörlerin anlaşılması ve tedavisinde ilerlemeleri kolaylaştırabilir. Ayrıca IDH1-mutant hücre hatlarını türetme potansiyeli de sunarlar.

Birkaç gün sonra, bazı tümör fragmanları kuyu yüzeylerine yapışacak ve eksplantlardan hücrelerin dışa doğru büyümesini başlatacaktır. İlk ekim ile tümöral büyüyen hücrelerin görülmesi arasındaki süre örnekten örneğe farklılık gösterir. İlk kültürler genellikle önemli miktarda hücresel debris içerir, bu da canlı hücrelerin varlığını değerlendirmeyi zorlaştırır. Sonuç olarak, kültür en az 4 hafta boyunca sürdürülmelidir. Hücreler büyümeye başladığında, bipolar veya multipolar görünümlü uzamış hücreler gözlemlenir (<strong ...

IDH1-mutant diffüz düşük dereceli gliomlar kültüre edilmesi zor olan nadir tümörlerdir. IDH1 mutant protein ekspresyonunu koruyan ve kültürleri aylarca sürdüren basit, enzimatik olmayan bir eksplant yöntemi sunuyoruz. Daha da önemlisi, bu teknik dondurularak saklanmış tümörlerle çalışır ve glioma araştırmaları için değerli bir kaynak sunar.

IDH1-mutant Diffüz Düşük Dereceli Gliomların Eksplant Kültürleri için Bir Protokol

Diffuse gliomas, the most prevalent primary brain tumors, are categorized into low and high grades based on histopathological criteria and genetic ...

a-protocol-for-explant-cultures-idh1-mutant-diffuse-low-grade

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Bu video, diffüz intrinsik pontin gliomundan veya DIPG'den etkilenen beyin sapı dokusundan glial progenitör hücrelerin izole edilmesi ve kültürlenmesi sürecini göstermektedir. Enzimatik bir sindirim yoluyla tümör dokusundan izole edilen glial hücreler, büyümelerini ve serbest yüzen nörosferlerin gelişimini destekleyen nörobazal bir ortamda kültürlenir.

Diffüz İntrinsik Pontin Gliomundan Hücrelerin İzole Edilmesi ve Kültürlenmesi

Malign gliomalar, farklı klinik ve moleküler özelliklere sahip heterojen bir yüksek infiltive glial neoplazm grubunu oluşturur. Primer ortotopik ksinograftlar preklinik hayvan modellerinde malign glioma alt tiplerinin histopatolojik ve moleküler özelliklerini rekapitulate eder.

Primer Ortotopik Glioma Xenografts Infiltratif Büyüme ve İsocitrat Dehidrogenaz I Mutasyonu Rekapitulate

Kanser kök hücre fenotipi olan hücreler için seçmek üzere serumsuz nörosfer ortamında ayrışmış yüksek dereceli glioma cerrahi örneklerinin yayılması için protokol. Nörosfer olarak yetişemeyen örnekler için alternatif bir protokol önerilmiştir. İmmünostokimya için 3D nörosfer mimarisini korumak için bir parafin gömme tekniği tanımlanmıştır.

Klinik Olarak İlgili Hayvan Modellerinde ve 3D İmmün entrikalarda Kullanılmak Üzere Cerrahi Örneklerden Yüksek Dereceli Glioma Hücre Kültürünün Optimizasyonu

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Bu protokol, bir hastada elde edilen hücre kültürü modelleri ya da tümör ve mikro-hücrelerinin doğrudan karakterizasyonu kurulması için ölüm sonrası yaygın iç pontin glioma örnekleri hızlı işlem için bir yöntem tarif eder.

Diffüz İçsel Pontine Glioma Hızlı post-mortem Hücre Kültürü için Protokol (DIPG)

Bu çalışmada, iki spesifik insan nöral organoidleri, insan sinirsel organoidlerin içinde sadece insanlarda ve 2) nöron dopaminerjik olarak eğitim için ilgili ve doğru bir model olarak 1) insan glioblastoma gelişimi türetmek için protokoller tanıtır ve açıklanmaktadır üç boyutlu bir organoid üreten farklılaşma.

Beyin kanseri ve nörodejeneratif hastalıkların Incelenmesi için insan nöral Organoidler

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Bu çalışma, 3D hücre invazyonu ve göçü gibi dinamik süreçler sırasında plazma zarı üzerindeki proteinlerin ekspresyonunu gerçek zamanlı olarak incelemek için yararlı olan, pediatrik diffüz orta hat glioma hücre hattına uygulanan bir canlı 3D hücre immünositokimyası protokolü sunmaktadır.

Pediatrik Diffüz Orta Hat Gliomunun Canlı 3D Hücre İmmünositokimya Testleri

Proteomik disregülasyon, yaygın olarak infiltre eden gliomların yayılmasında önemli bir rol oynar, ancak birkaç ilgili protein tanımlanmamıştır. Dijital mekansal işleme (DSP), infiltratif gliomların invazyonu ve göçüne katkıda bulunabilecek aday proteinlerin diferansiyel ekspresyonunu karakterize etmek için verimli, yüksek verimli bir yaklaşım sunar.

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Burada, birincil hasta örneklerinden veya hasta kaynaklı hücre kültürlerinden glioblastoma (GBM) organoidleri üretme ve olgunluğa kadar sürdürme yöntemini açıklıyoruz. Bu GBM organoidleri fenotipik olarak çeşitli hücre popülasyonları içerir ve tümör mikroortamlarını ex vivo olarak yeniden yaratır.

Üç Boyutlu Organoid Kültür Kullanarak İnsan Glioblastoma Hücresel Çeşitliliğinin Ex vivo Korunması

Öğrenin, IDH1-mutant diffüz düşük dereceli gliomalar için enzimatik olmayan eksplant kültür protokolünü. Bu yöntem, uzun süreli hücre canlılığını koruyarak glioma biyolojisini anlamaya ve tedavi geliştirmeye katkı sağlar.

IDH1-mutant Diffüz Düşük Dereceli Gliomların Eksplant Kültürleri için Bir Protokol

Daha fazla video keşfet