IDH1-mutant Diffüz Düşük Dereceli Gliomların Eksplant Kültürleri için Bir Protokol

Laboratuvarımızda, yaygın düşük dereceli gliomlar olarak adlandırılan nadir beyin tümörü tipine odaklanıyoruz. Bu gliomlar genellikle genç yetişkinleri etkiler ve IDH-1 adı verilen gende bir mutasyon ile karakterize edilirler. Gliomlar alanındaki ana ilerleme, birincisi, tümöroid veya organoid gibi 3D modellerin kullanılması, ikincisi, gliomlarla nakledilen farelerin beyninde doğrudan görüntülemenin kullanılması ve üçüncüsü, özel transkriptomik ve tek hücreli RNA'nın kullanılmasıdır.

IDH-1 mutant gliomları üzerinde çalışırken karşılaştığımız ana zorluk, bu hücrelerin düşük proliferasyonu ve kültürde sürdürülmesinin zorluğudur ve böylece hücreleri canlı tutmak için bir protokol türettik ve tanımladık ve bazıları için bir hücre hattı türetebildik, Ancak tüm hastalar için değil. IDH-1 mutant hücrelerini in vitro olarak ve aynı zamanda in vivo olarak inceleyerek, bu hücrelerin oldukça plastik olduğunu ve astrosit benzeri veya oval benzeri olmak üzere iki hücrenin kaderini benimseyebildiklerini bulduk ve ayrıca dürtmenin bu plastisitede önemli bir rol oynadığını bulduk. Bu yeni eksplant protokolü ile IDH-1 mutant hücrelerini in vitro olarak haftalarca, hatta daha da fazla, aylarca muhafaza edebildik ve hastada bulduğumuz gibi farklı tipte tümöral hücreler olduğunu gösterdik.

Ayrıca, tümör hücreleri ve çevreleri arasındaki etkileşimi incelemeyi mümkün kılan mikroglial hücreler gibi bazı tümöral çevre hücrelerinin olduğunu bulduk, bu nedenle bu modeller tümörlerde bulunan biyolojik çeşitliliğin daha doğru bir temsilini sunuyor. Başlamak için çalışma alanını hazırlayın ve tüm sterilize edilmiş aletleri düzenleyin. Kültür için doku canlılığını korumak için tümör rezeksiyonunu buz üzerine aktarın.

Tümör rezeksiyonunu boyut ve heterojenlik açısından inceleyin. Yumuşak veya jöle benzeri bir dokuya sahip gri bir renk gösteren kısımları seçin, çünkü bu alanlar tümör hücreleri açısından zengindir. Seçilen tümör örneklerini 1.5 mililitrelik bir mikrotüp veya kriyoviyal içine aktarın ve bir mililitre ortam ekleyin.

Steril makas kullanarak numuneleri bir ila iki milimetre küp büyüklüğünde küçük parçalar halinde doğrayın. Daha sonra, steril makasla, yaklaşık üç ila dört milimetre çapında geniş bir açıklık oluşturmak için 1.000 mikrolitrelik bir pipet ucunun ucunu kesin. Kıyılmış doku parçalarının 100 ila 200 mikrolitresini kesilmiş bir uçla bir plakanın kuyucuklarına pipetleyin.

Daha küçük parçalar hızla çökelme eğiliminde olduğundan, düzgün dağılımı sağlamak için süspansiyonu nazikçe yeniden homojenize edin. Plakayı% 5 karbondioksit ve% 100 nem ile 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatöre yerleştirin. Tümörün metabolik aktivitesi hızlı sararmaya neden oluyorsa veya parça yoğunluğu gerektiriyorsa, ortamı günlük olarak değiştirin.

Başlamak için, kıyılmış tümör dokusu süspansiyonunu elde edin. Dondurma ortamı hazırlığı için, sekiz mililitre hücre kültürü ortamına iki mililitre DMSO ekleyin. Kıyılmış tümör süspansiyonunun bir hacmini, hazırlanan% 20 DMSO dondurma ortamının eşit bir hacmi ile birleştirin.

Tam karıştırmayı sağlamak için karışımı dikkatlice yukarı ve aşağı pipetleyin. Kademeli sıcaklık düşüşünü kolaylaştırmak için kriyoviyalleri hızla kriyojenik bir kaba aktarın, ardından uzun süreli depolama için sıvı nitrojene aktarmadan önce gece boyunca eksi 80 santigrat derecede inkübe edin. Çözdürmek için, kriyoviyalleri sıvı nitrojenden çıkarın ve hemen 37 santigrat derece su banyosuna koyun.

Hücrelerin yaklaşık% 80'i çözülene kadar ısıtın. DMSO'yu çıkarmak için, süspansiyonu hızlı bir şekilde beş mililitre önceden ısıtılmış 1X PBS içeren 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü beş dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve PBS yıkamasını tekrarlayın, ardından santrifüjlemeyi tekrarlayın.

Süpernatanı aspire edin, peletin rahatsız edilmediğinden emin olun. Peleti uygun miktarda ortamda yeniden süspanse edin ve önceden kaplanmış bir PDL Laminin 24 oyuklu plakaya aktarın. Plakayı 37 santigrat derecede inkübe edin.

Uzun, bipolar veya çok kutuplu morfolojiler sergileyen hücrelerin, en az dört haftalık bir kültür süresinden sonra kuyu yüzeyine tutturulmuş tümör eksplantlarından büyüdüğü gözlendi. Tümörden türetilmiş hücreler, karmaşık ağlar oluşturan uzun ve bipolar görünümlerle gösterildiği gibi, üç vakada taze ve kriyo ile korunmuş tümörler arasında karşılaştırılabilir morfoloji sergiledi. Tümör kaynaklı hücrenin lif boyunca radyal göçü açıkça gözlendi.

Başarısız eksplant kültürleri, otofloresan ve lipid içeriği ile karakterize edilen yapışık olmayan fragmanlar ve çok sayıda gitter hücresi gösterdi.