Name: Eksize Edilmiş Perfüze Fare Kalplerinde İntrinsik Kardiyak Otonomik Nöronların Optogenetik Aktivasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T12:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Öğrenin, perfüze fare kalplerinde optogenetik yöntemle intrinsik kardiyak otonomik nöronları nasıl aktive edeceğinizi. Bu teknik, kolinergik ve katekolaminergik aktivite arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan protokolleri, George Washington Üniversitesi'nin Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylandı ve Ulusal Sağlık Enstitüsü'nün Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip etti.
1. Mikro-LED ışık kaynağı yapısı
<ol>
	<li>İyi havalandırılan bir alanda diseksiyon mikroskobu altında, en az 20 cm uzunluğunda iki yalıtılmış bakır telin soyulmuş uçlarını 465 nm'lik bir mikro LED'in temas noktalarına lehimleyin (Şekil 1). LED'i bir güç kaynağına bağlayarak ve açarak lehimlemeyi test edin.</li>
	<li>200 μL filtreli pipet ucunun altını 1 cm kesin. Küçük çaplı bir çubuk kullanarak filtreyi dışarı itin. Mikro LED'i, LED'in ucuyla aynı hizada olması için tellerle pipet ucuna yerleştirin. LED'i ve kabloları yerinde tutmak için pipet ucunun üst kısmındaki filtreyi yerine takın ve ardından LED'in kenarlarını pipet ucuna süper yapıştırın. Süper yapıştırıcının kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Baz ve sertleştiriciyi 10:1 oranında birleştirerek silikon elastomeri hazırlayın ve iyice karıştırın. Bir vakum odası kullanarak veya santrifüjleyerek karışımdaki kabarcıkları çıkarın.</li>
	<li>0,5 mL'lik bir santrifüj tüpü alın ve LED'in çıkarılmasını kolaylaştırmak için yanları çizin (istenirse burada tüpün içine yağlayıcı da eklenebilir). Sızıntı olmadığından emin olmak için tüpün dışını bantlayın. Silikon elastomer karışımından yaklaşık 0,2 mL tüpün içine dökün ve ardından mikro LED pipet ucunu, LED ile tüpün tabanı arasında en az 1 mm boşluk bırakarak tüpe yerleştirin. Kabarcıklar oluşmuşsa, bunları çıkarmak için santrifüj tüpünü sert bir yüzeye vurun. NOT: LED'i yerleştirirken kabarcık oluşumunu azaltmak için pipet ucu önleyici olarak silikon elastomer ile kaplanabilir.</li>
	<li>Santrifüj tüpü mikro LED'ini 50 °C'lik bir laboratuvar fırınına veya inkübatöre dik olarak yerleştirin ve en az 8 saat veya gece boyunca bırakın. Fırınla etkileşime girerken ısıya dayanıklı eldivenler giyin. Elastomer sertleştikten sonra LED'i santrifüj tüpünden çıkarın. Elastomer hala yapışkansa, tekrar fırına koyun.</li>
	<li>Tamamen sertleştikten sonra, LED'in ucundaki fazla elastomeri hassas bir maket bıçağıyla 1 mm'den fazla kalmayacak şekilde çıkarın. LED'in uygun şekilde kapsüllenmesi, fotostimülasyon sırasında dokunun ısınmasını en aza indirecektir.</li>
	<li>Bir optik güç ölçer kullanarak LED'in optik gücünü belirleyin. Güç ölçeri açın ve dalga boyu ayarlarını 465 nm okuyacak şekilde ayarlayın. LED'i bir fotodiyot güç sensörü ile aynı hizaya getirin ve LED'i fonksiyon üreteci ile açın. Optik güç ölçer watt cinsinden bir okuma üretecektir. Güç okumasını aydınlatılan yüzeyin alanına (0,88 mm2) bölerek ışınımı hesaplayın. NOT: ChR2.4 2'nin uygun aktivasyonu için ideal ışınım yaklaşık2 mW/mm11 olmalıdır.</li>
</ol>
2. Deneysel hazırlık
<ol>
	<li>Kolinerjik nöronlarda (ChAT-ChR2) veya katekolaminerjik nöronlarda (TH-ChR2) ChR2'yi eksprese etmek için fareleri önceki yayına uygun olarak yetiştirin12 (Şekil 2). Daha önce tarif edildiği gibi bir genotipleme yaklaşımı kullanarak deneyler için kullanılan farelerde TH-Cre veya ChAT-Cre ekspresyonunu doğrulayın12.</li>
	<li>En az 225 mL Krebs-Henseleit (KH) çözeltisi hazırlayın (mM cinsinden: 118 NaCl, 4.7 KCl, 1.25 CaCl2, 0.57 MgSO4, 25 NaHCO3, 1.17 KH2PO4</li><li><li><li> </li><li></li><li><li></ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig1.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig1large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig2.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig2large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li><li> </li><li><li></li><li> </li><li></li><li></ol><ol><li></li><li><li></li><li><li></ol><ol><li><li><li><li><li><li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig3large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Deisseroth, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+optical+technologies+for+illuminating+genetically+targeted+brain+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Next-generation optical technologies for illuminating genetically targeted brain circuits.</a> J Neurosci. 26 (41), 10380-10386 (2006).</li>
<li>Entcheva, E., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+optogenetics%3A+a+decade+of+enlightenment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment.</a> Nat Rev Cardiol. 18, 349-367 (2021).</li>
<li>Ambrosi, C. M., Klimas, A., Yu, J., Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+applications+of+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Cardiac applications of optogenetics.</a> Prog Biophys Mol Biol. 115 (2-3), 294-304 (2014).</li>
<li>Pinol, R. A., Bateman, R., Mendelowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+approaches+to+characterize+the+long-range+synaptic+pathways+from+the+hypothalamus+to+brain+stem+autonomic+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Meth%22%5BJournal%5D)">Optogenetic approaches to characterize the long-range synaptic pathways from the hypothalamus to brain stem autonomic nuclei.</a> J Neurosci Meth. 210 (2), 238-246 (2012).</li>
<li>Zeng, H., Madisen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+transgenic+approaches+in+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Mouse transgenic approaches in optogenetics.</a> Prog Brain Res. 196, 193-213 (2012).</li>
<li>Sauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+gene+targeting+in+mice+using+the+Cre%2Flox+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system.</a> Methods. 14 (4), 381-392 (1998).</li>
<li>Hedrick, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+channelrhodopsin+and+archaerhodopsin+in+cholinergic+neurons+of+Cre-lox+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization of channelrhodopsin and archaerhodopsin in cholinergic neurons of Cre-lox transgenic mice.</a> PLoS One. 11 (5), 1-15 (2016).</li>
<li>Moreno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sudden+heart+rate+reduction+upon+optogenetic+release+of+acetylcholine+from+cardiac+parasympathetic+neurons+in+perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Sudden heart rate reduction upon optogenetic release of acetylcholine from cardiac parasympathetic neurons in perfused hearts.</a> Front Physiol. 10, 1-11 (2019).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. Molecular and cellular neurocardiology in heart disease. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHabecker%2C+BA+%22J+Physiol%22">J Physiol</a>. , (2024).</li>
<li>Wengrowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+release+of+norepinephrine+from+cardiac+sympathetic+neurons+alters+mechanical+and+electrical+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovas+Res%22%5BJournal%5D)">Optogenetic release of norepinephrine from cardiac sympathetic neurons alters mechanical and electrical function.</a> Cardiovas Res. 105 (2), 143-150 (2015).</li>
<li>Williams, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+optogenetics%3A+empirically-derived+voltage-+and+light-sensitive+channelrhodopsin-2+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Computational optogenetics: empirically-derived voltage- and light-sensitive channelrhodopsin-2 model.</a> PLoS Comput Biol. 9 (9), e1003220(2013).</li>
<li>Moreno, A., Kowalik, G., Mendelowitz, D., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+control+of+cardiac+autonomic+neurons+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetic control of cardiac autonomic neurons in transgenic mice.</a> Meth Mol Biol. 2191, 309-321 (2021).</li>
<li>Einthoven, W., Fahr, G., de Waart, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+direction+and+manifest+size+of+the+variations+of+potential+in+the+human+heart+and+on+the+influence+of+the+position+of+the+heart+on+the+form+of+the+electrocardiogram%5BTitle%5D)+AND+%22Am+Heart+J%22%5BJournal%5D)">On the direction and manifest size of the variations of potential in the human heart and on the influence of the position of the heart on the form of the electrocardiogram.</a> Am Heart J. 40 (2), 163-211 (1950).</li>
<li>Giles, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paradoxical+arteriole+constriction+compromises+cytosolic+and+mitochondrial+oxygen+delivery+in+the+isolated+saline-perfused+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Paradoxical arteriole constriction compromises cytosolic and mitochondrial oxygen delivery in the isolated saline-perfused heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 315 (6), H1791-H1804 (2018).</li>
<li>Wallick, D. W., Martin, P. J., Masuda, Y., Levy, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+autonomic+activity+and+changes+in+heart+rate+on+atrioventricular+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of autonomic activity and changes in heart rate on atrioventricular conduction.</a> Am J Physiol. 243 (4), H523-H527 (1982).</li>
<li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac optogenetics.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304 (9), H1179-H1191 (2013).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+nerve+transdifferentiation+reduces+action+potential+heterogeneity+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic nerve transdifferentiation reduces action potential heterogeneity after myocardial infarction.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 318 (3), H558-H565 (2020).</li>
<li>Shattock, M. J., Tipton, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomic+conflict%3A+a+different+way+to+die+during+cold+water+immersion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Autonomic conflict: a different way to die during cold water immersion.</a> J Physiol. 590 (14), 3219-3230 (2012).</li>
<li>Sacconi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KHz-rate+volumetric+voltage+imaging+of+the+whole+Zebrafish+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">KHz-rate volumetric voltage imaging of the whole Zebrafish heart.</a> Biophys Rep. 2 (1), 100046(2022).</li>
<li>Asfour, H., Swift, L. M., Sarvazyan, N., Doroslovacki, M., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+decomposition+of+transmembrane+voltage-sensitive+dye+fluorescence+using+a+multiresolution+wavelet+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Signal decomposition of transmembrane voltage-sensitive dye fluorescence using a multiresolution wavelet analysis.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 58 (7), 2083-2093 (2011).</li>
<li>Nyns, E. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+termination+of+ventricular+arrhythmias+in+the+whole+heart%3A+towards+biological+cardiac+rhythm+management%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Heart+J%22%5BJournal%5D)">Optogenetic termination of ventricular arrhythmias in the whole heart: towards biological cardiac rhythm management.</a> Eur Heart J. 38 (27), 2132-2136 (2017).</li>
<li>Ripplinger, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+cardiac+electrophysiology+and+arrhythmias+in+small+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of cardiac electrophysiology and arrhythmias in small animals.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 323 (6), H1137-H1166 (2022).</li>
<li>Swift, L. M., Kay, M. W., Ripplinger, C. M., Posnack, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+the+beat+to+see+the+rhythm%3A+excitation-contraction+uncoupling+in+cardiac+research%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stop the beat to see the rhythm: excitation-contraction uncoupling in cardiac research.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (6), H1005-H1013 (2021).</li>
<li>Asfour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+fluorescence+imaging+of+isolated+biventricular+working+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">NADH fluorescence imaging of isolated biventricular working rabbit hearts.</a> J Vis Exp. (65), e4115(2012).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>#3c Forseps (x2)</td><td>Dumont</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>0.2 &mu; m Selüloz Nitrat Membran Filtresi</td><td>Whatman</td><td>7182-004</td><td>KH</td></tr><tr><td>0.5 ml filtrelemek için, Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>Ultra Cruz</td><td>sc-200269</td><td></td></tr><tr><td>10 & mu; m Çekirdek Membran Filtresi</td><td>Whatman</td><td>111115</td><td>Sistem filtresi için</td></tr><tr><td>Analog İnkübatör&nbsp;</td><td>Qunicy Labs</td><td>12-140</td><td></td></tr><tr><td>Aort Kanülü</td><td>Harvard Aparatı&nbsp;</td><td>73-2798</td><td></td></tr><tr><td>Keyfi Fonksiyon Üreteci</td><td>Tektronix</td><td>AFG3021B</td><td></td></tr><tr><td>Örgülü İpek Sütür 4-0</td><td>Cerrahi Uzmanlıklar Look</td><td>SP116</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>Kavisli Hemostat</td><td>Ted Pella</td><td>53065</td><td></td></tr><tr><td>Einthoven Goldberger Modülü</td><td>Hugo Sachs Elektronik</td><td>73-1778</td><td></td></tr><tr><td>Esnek Silikon Tel 30AWG</td><td>BNTECHGO</td><td>619317716902</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Ağır Kavisli İris Forseps&nbsp;</td><td>Aesculap</td><td>OC022R</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sodyum Enjeksiyon</td><td>Ajanı</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>İris Makas</td><td>Ted Pella</td><td>13215</td><td></td></tr><tr><td>İzofluran Çözeltisi</td><td>Covetrus</td><td>029405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 8&nbsp;</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>Veri toplama yazılımı</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Diseksiyon Makası</td><td>WPI</td><td>504520</td><td></td></tr><tr><td>Micro-LED</td><td>Dialight</td><td>598-8091-107F</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>Optik Güç Ölçer</td><td>Thorlabs</td><td>PM100D</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 8/35</td><td>Ekipman</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Kendiliğinden açılan&nbsp; Hassas Makas</td><td>Excelta</td><td>366</td><td></td></tr><tr><td>Tek Hayvan Anestezi Makinesi</td><td>EZ-108SA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lehimleme İstasyonu</td><td>Weller</td><td>WES51</td><td></td></tr><tr><td>SureOne Filtre Pipet Uçları</td><td>Fisherbrand</td><td>02-707-478</td><td></td></tr><tr><td>SYLGARD 184 Silikon Elastomer Kiti</td><td>DOW</td><td>04019862</td><td></td></tr><tr><td>Doku Forseps</td><td>Ted Pella</td><td>13220</td><td></td></tr><tr><td>Boru Akış Sistemi</td><td>Transonik</td><td>TS410</td><td></td></tr></tbody></table>

eksize edilmiş perfüze fare kalplerinde İntrinsik kardiyak otonomik nöronların optogenetik aktivasyonu

Optogenetic Activation of Intrinsic Cardiac Autonomic Neurons in Excised Perfused Mouse Hearts

Bir Langendorff sabit basınçlı perfüzyon sistemi (Şekil 4), uygun oksijenasyon, sıcaklık ve koroner akış sürdürülürse, fare kalp atış hızlarını bir saatten fazla bir süre boyunca en az 300 bpm'de tutabilmelidir. Bu kurulumla, aort perfüzat sıcaklığı koroner akışa dayanır, bu nedenle aort sıcaklığını 37 °C'de tutmak için akış hızı değiştikçe su banyosu sıcaklıklarının ayarlanması gerekebilir. Fare kalbi koroner akış hızları, kalbin boyutuna bağlı olarak tipik olarak 1.5-4.5 mL / dak arasında değişir. Akış hızı dalgalanmaları sırasında perfüzat sıcaklığının 37 °C'de tutulması, tutarlı kalp fonksiyonu için gereklidir ve özellikle sabit basınç perfüzyonu için önemlidir. Tarif edilen perfüzyon sistemi, perfüzat kolonu yüksekliği boyunca 70 mmHg'lik bir hidrostatik basıncı korumak için tasarlanmıştır. Bu, üst rezervuardan tutarlı bir taşma sağlayan bir pompa hızı ile gerçekleştirilir. Perfüzat, tam miyokardiyal oksijenasyonu sağlamak için normal veya supranormal koroner akışı iyileştirmek ve sürdürmek için 20 μM vazodilatör kromakalin ile desteklenebilir14.
ChAT-ChR2 fare kalplerinde 10 Hz ve 30 ms darbe genişliğinde kolinerjik nöronların fotostimülasyonu, kalp atış hızında neredeyse anlık bir düşüşe neden olmalıdır. Yeterince perfüze edilmiş kalplerde kolinerjik nöronların etkili fotostimülasyonu, kalp atış hızında en az 100 bpm'lik bir azalmaya yol açmalıdır. Şekil 5 , mikro LED açıldığında maksimum 75 bpm'lik bir düşüşe ulaşana kadar düşmeye devam eden 135 bpm'lik ani bir düşüşü göstermektedir. Mikro LED'i kapattıktan yarım saniye sonra, kalp atış hızı kademeli olarak ön stimülasyon seviyelerine dönmeden önce 175 bpm'ye yükselir. Stimülasyon öncesinde, sırasında ve sonrasında RR aralığındaki farklılıkları göstermek için altı derivasyonlu bir EKG sunulmaktadır (Şekil 5B). aVR, aVL ve aVF müşteri adayları, LabChart yazılımında Müşteri Adayları I ve II kullanılarak hesaplanır.
TH-ChR2 fare kalplerindeki katekolaminerjik nöronların fotostimülasyonu, kolinerjik nöronların fotostimülasyonuna kıyasla kalp hızında daha kademeli (üstel) bir değişikliğe neden olur. Bu muhtemelen, hedef proteinleri fosforile eden PKA'yı aktive eden cAMP aktive edici ikinci haberci sistemini gerektiren beta1-adrenerjik aktivasyondan kaynaklanırken, muskarinik aktivasyon yapmaz. Şekil 6 , 10 s boyunca 135 bpm kalp atış hızı artışını göstermektedir. Normal sinüs ritmine dönmek için ışık kapatıldıktan sonra 10 saniye daha gereklidir. Mikro LED uygun şekilde yalıtılmazsa kalbi ısıtarak kalp atış hızında artışa neden olabilir. Bu ısıtma tepkisi, TH-ChR2 stimülasyonundan daha az yoğundur; Bu nedenle, kalp atış hızındaki değişiklik daha az belirgindir.
Bu protokolün bir uygulaması, nöronları depolarize etmek için optogenetik stimülasyon kullanmaktır, bu da endojen nörotransmiterlerin salınmasına yol açarken aynı zamanda perfüsata ekzojen nörotransmiterler eklemektir. Şekil 7A, perfüzata eklenen bir bolus dozu NE ile bir ChAT-ChR2 fare kalbinden endojen asetilkolin salınımını göstermektedir. NE mevcut olmadan, fotostimülasyon kalp atış hızının 100 bpm'den fazla düşmesine neden oldu ve bu düşüşü stimülasyon süresi boyunca sürdürdü. Büyük bir NE dozu (2000 nM) ile birlikte, fotostimülasyon sırasında maksimum kalp atış hızı düşüşü 40 bpm idi. Kalp atış hızı hemen yükselmeye başladı ve ışık kapatılmadan önce neredeyse stimülasyon öncesi seviyelere ulaştı. Bu sonuç, ChAT nöron fotostimülasyonu ile kalp hızının optogenetik olarak baskılanmasının, yüksek doz NE'den kaynaklanan kalp hızındaki artışları tam olarak baskılayamadığını, kalp hızı baskılanmasının daha kısa süresine ve kalp hızında daha düşük düşüşlere neden olduğunu göstermektedir (Şekil 7B). Bu sonuçlar, eşzamanlı vagal sinir ve yıldız gangliyon stimülasyonu sırasında ilerleyici AV düğüm bloğu gösteren büyük hayvanlarda yapılan önceki çalışmalarla tutarlıdır 12,13.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig4.jpg"> 
Şekil 4: Deney düzeneği. Perfüzyon sistemi şeması. Oklar perfüzatın yönünü gösterir. Süperfüzyon perfüzatı kesikli çizgilerle gösterilir ve bileşenler kırmızı ile özetlenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig5.jpg"> 
Şekil 5: Temsili kolinerjik fotostimülasyon yanıtı. (A) ChAT-ChR2 optogenetik aktivasyonu sırasında 6 derivasyonlu bir EKG. Sabit mavi çizgiler, mikro LED'in açılıp kapatıldığını gösterir. Kırmızı kesikli kutular (B) parçacıklarının zamanını gösterir. (B) (a) öncesinde, (b) sırasında ve fotostimülasyondan sonra (c) yarım saniyelik EKG sinyali parçacıkları. Her bölüm için RR aralığı gösterilir. (C) Kalp atış hızı (üstte), bir fonksiyon üretecinden (altta) gelen nabız dalgalarıyla birlikte gösterilir. Kalp atış hızı 450 bpm'de başlar ve 8 saniye fotostimülasyondan sonra 315 bpm'ye düşer ve fotostimülasyon bittikten 7 saniye sonra 410 bpm'ye döner. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig6.jpg"> 
Şekil 6: Temsili katekolaminerjik fotostimülasyon yanıtı. (A) TH-ChR2 optogenetik aktivasyonu sırasında 6 derivasyonlu bir EKG. Sabit mavi çizgiler, mikro LED'in açılıp kapatıldığını gösterir. Kırmızı kesikli kutular (B) parçacıklarının zamanını gösterir. (B) (a) öncesinde, (b) sırasında ve fotostimülasyondan sonra (c) yarım saniyelik EKG sinyali parçacıkları. Her bölüm için RR aralığı gösterilir. (C) Kalp atış hızı (üstte), bir fonksiyon üretecinden (altta) gelen nabız dalgalarıyla birlikte gösterilir. Kalp atış hızı 390 bpm'de başlar ve fotostimülasyon bittikten 8 s sonra 390 bpm'ye dönmeden önce 10 sn fotostimülasyondan sonra 525 bpm'ye ulaşır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67364/67364fig7.jpg"> 
Şekil 7: Ekzojen NE ile kolinerjik fotostimülasyon. (A) ChAT-ChR2 fotostimülasyonu sırasında kalp atış hızı tepkisi, perfüzat için artan dozlarda NE eklenir. Kalp atış hızı NE nedeniyle maksimum artışa ulaştığında, mikro LED yaklaşık 10 saniye boyunca yandı. Yüksek dozlarda NE hızında kalp atış hızı baskılanması hala mümkündü, ancak doz arttıkça stimülasyon süresi azaldı. (B) Kalp atış hızının bastırılmış kaldığı süre. 10 saniyeye yakın süreler genellikle tüm stimülasyon süresi boyunca bastırılmış halde kalır. (C) Fotostimülasyon sırasında kalp atış hızındaki düşüş, daha yüksek NE dozlarında düşük dozlara göre daha az şiddetliydi. Düşük dozlar kalp atış hızında ortalama @'lık bir düşüşe neden olurken, daha yüksek dozlar sadece % düştü. İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için eşleşmemiş bir t-testi yapıldı. Ortalama * p &lt; 0.05'in standart hatası olarak sunulur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67364/67364fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Eksize Edilmiş Perfüze Fare Kalplerinde İntrinsik Kardiyak Otonomik Nöronların Optogenetik Aktivasyonu

A balance of cholinergic and catecholaminergic activation is necessary to maintain heart health. Interrogating the interaction between these pathways can ...

optogenetic-activation-intrinsic-cardiac-autonomic-neurons-excised

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu makale, potansiyometrik boya kullanarak (di-8-ANEPPS) Langendorff perfüze sıçan kalpleri yüzeyinde optik görüntü aksiyon potansiyeli hareketi yüksek bir zamansal ve mekansal çözünürlükte tekniği açıklar.

Langendorff perfüze sıçan Kalpler Optik Haritalama

Bu kağıt sağlam izole Langendorff transmembran potansiyeli (Vm) ve geçici hücre içi kalsiyum (CAT) optik haritalama sırasında diseksiyon prosedürü, enstrümantal kurulum ve deneysel koşullar fare kalpleri perfüze.

Fare Kalp Aksiyon Potansiyelleri ve Kalsiyum Geçici Optik Haritalama

Kaynak: Jungen, C.,  et al. Ex Vivo Langendorff Sisteminde İntrakardiyak Nöronların Kardiyak Elektrofizyoloji ve Aritmogenez Üzerindeki Etkisi. J. Vis. Uzm. (2018). Video, kalbin aritmiye duyarlılığını değerlendirmek için intrakardiyak sinir sistemini uyarmak için ex vivo bir tekniği göstermektedir. Bir perfüzyon aparatı kullanılarak, izole edilmiş bir fare kalbi oksijenli bir tampon ile perfüze edilir. İntrakardiyak sinir sistemi daha sonra aritmileri indüklemek için yüksek bir frekansta...

Aritmiye duyarlılığı değerlendirmek için intrakardiyak sinir sisteminin uyarılması

Burada fareler bir protokol kalp özel gen manipülasyon için mevcut. Anestezi altında fare kalpler dördüncü interkostal uzayda externalized. Daha sonra kodlama belirli genler bir şırınga vivo içinde görüntüleme ve Batı ile protein ifade ölçü tarafından takip Miyokardiyum içine enjekte edildi adenovirüse bakın analiz leke.

Vivo içinde kalp özel gen manipülasyon farelerde Intramyocardial enjeksiyonla için basit ve etkili bir yöntem

Burada, bir iletişim kuralı modülasyonu intrakardiyak otonom sinir sistemi ve temel Elektrofizyoloji, arrhythmogenesis ve ex vivo Langendorff kurulumu kullanarak kamp dinamikleri üzerindeki etkisi değerlendirilmesi için mevcut.

Kardiyak Elektrofizyoloji ve Arrhythmogenesis bir Ex Vivo Langendorff sisteminde intrakardiyak nöronların etkisi

Bu çalışmanın amacı, kardiyak dinamiği n çevirisel bir hayvan modeli kullanarak araştırmak için bir yöntem oluşturmaktır. Açıklanan deneysel yaklaşım, izole, bozulmamış bir domuz kalp modelindeki elektriksel aktiviteyi değerlendirmek için elektrofizyolojik bir çalışma ile birlikte çift emisyonlu optokardiografi içerir.

Ex Vivo Langendorff perfüzyonlu Kalplerin Optokardiyografi ve Elektrofizyoloji Çalışmaları

Tavşan kardiyomiyositlerinde GtACR1 aktivasyonunun elektromekanik etkilerinin değerlendirilmesi için bir protokol sayılmiyoruz. Hücre izolasyonu, kültür ve adenoviral transdüksiyon ve yama-kelepçe ve karbon-fiber teknikleri ile fonksiyonel deneyler hakkında ayrıntılı bilgi salıyoruz.

Optogenetik Modüle Kardiyomiyosit Aktivitesinin Elektromekanik Değerlendirilmesi

Bu çalışma, transgenik channelrhodopsin-2 (ChR2) farelerinin bozulmamış murin kalplerinin kardiyak ritmini, bir mikro-LED dizisi ile lokal fotostimülasyon ve epikardiyal membran potansiyelinin eşzamanlı optik haritalamasını kullanarak kontrol etmek için bir yöntem bildirmektedir.

Murin Kalplerde Optogenetik Çok Bölgeli Fotostimülasyon Uygulayarak İleri Kardiyak Ritim Yönetimi

Bu protokol, farelerdeki hız yapma kusurlarını tanımlamak için tüm sinoatriyal düğüm dokusunun mikroelekrod dizi kaydını kullanarak içsel kardiyak ateşleme hızını ölçmek için yeni bir metodoloji tanımlamayı amaçlamaktadır. Farmakolojik ajanlar, içsel tempo yapımı üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntemde de tanıtılabilir.

Farelerde İçSel Kardiyak Pacemaking Kusurlarını Belirlemek için Sinoatrial Düğüm Ateşleme Hızının Mikroelekrod Dizisi Kaydı

Bu protokol, ekokardiyografi rehberliğinde virüsün doğrudan intramiyokard enjeksiyonu ile sıçan ve fare kalplerinde transgen ekspresyonu yöntemlerini açıklamaktadır. İzole, Langendorff perfüze edilmiş kalplerin programlanmış elektriksel stimülasyonu ile kalplerin ventriküler aritmilere duyarlılığının değerlendirilmesi için yöntemler de burada açıklanmaktadır.

Kemirgen Kalplerde Viral Transgen Ekspresyonu ve Kardiyak Aritmi Riskinin Değerlendirilmesi

Bu protokol, gelişmekte olan fare kalplerinde kalp hücrelerinin elektroporasyona dayalı transgenezi için ayrıntılı bir metodolojik çerçeve sunar. Burada sağlanan video varlıkları, bu çok yönlü tekniğin öğrenilmesini kolaylaştıracaktır.

Fare Embriyonik Kalbinde Gen İletimi için Etkili Bir Transgenez Yaklaşımı

Öğrenin, perfüze fare kalplerinde optogenetik yöntemle intrinsik kardiyak otonomik nöronları nasıl aktive edeceğinizi. Bu teknik, kolinergik ve katekolaminergik aktivite arasındaki etkileşimleri incelemek için kullanılır.

Eksize Edilmiş Perfüze Fare Kalplerinde İntrinsik Kardiyak Otonomik Nöronların Optogenetik Aktivasyonu

Daha fazla video keşfet