Bir Makrofaj-Tümör Sferoid Ko-İnvazyon Testi

Metastaz sırasında nasıl etkileşime girdiklerini daha iyi anlamak için kanser ve bağışıklık hücrelerinin etkileşimini araştırmak istiyoruz. Çoğu durumda, in vivo modeller, bağışıklık sistemi bağlamında kanser hücrelerinin 3D istilası ile ilgili araştırma sorularını takip etmenin rutin yoludur veya sistemin izole edilmiş bileşenleri odaktadır. İn vivo durumun karmaşıklığını taklit eden, ancak mikroskop altında belirli çevresel özelliklerin daha doğrudan manipüle edilmesine izin veren hücresel davranışın analizine izin veren bir yöntem.

Değiştirilmemiş kanser hücrelerinin, motor protein KIF16B için tükenmiş makrofajlarla birlikte yetiştirildiklerinde 3D kollajen I matrisindeki invazyonu azaltacağını gösterdik. Bu, tümör mikroçevresindeki makrofaj yüzey proteinlerinin KIF16B güdümlü geri dönüşümünün rolüne işaret etmektedir. Yöntemimizi, makrofaj kanser hücresi bağlamının arayüzünde matris bozulmasının görselleştirilmesine izin verecek şekilde geliştirmeye devam etmek ve böylece bozunma ve adeziv mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını sağlamak istiyoruz.

Başlamak için, H1299 GFP hücrelerini, 25 santimetre karelik bir hücre kültürü şişesinde 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile %80 birleşmeye ulaşana kadar bir kanser hücresi ortamı ile yetiştirin. Hücreleri DPBS ile bir kez yıkayın ve hücreler ayrılana kadar iki ila üç dakika boyunca bir mililitre Tripsin-EDTA ekleyin. İki mililitre kanser hücresi ortamı ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun.

Daha sonra, ayrılmış hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpte 245 G'de beş dakika santrifüjleyin. Peleti beş mililitre DPBS ile yıkamadan önce tripsin içeren süpernatant çözeltisini çıkarın. Santrifüjlemeden sonra, peleti beş mililitre kanser hücresi ortamında yeniden askıya alın.

Bir Neubauer odası kullanarak hücreleri sayın. 8.000 hücreyi, 25 mikrolitre kanser hücresi ortamının son hacminde 96 oyuklu ultra düşük yapışma plakasına aktarın. Hücreleri üç gün boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Üç gün sonra, sferoidleri mikroskop altında homojenlik açısından kontrol edin. İnsan kan örneğini topladıktan sonra, 20 mililitre kanı bir transfüzyon torbasından 50 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. 50 mililitrelik yeni bir tüpe 15 mililitre lenfosit ayırma ortamı ekleyin.

20 mililitre kanı karıştırmadan lenfosit ayırma ortamı içeren tüpe dikkatlice aktarın ve karışımı dört santigrat derecede 30 dakika boyunca 450 G'de santrifüjleyin. Santrifüjleme sırasında, 50 mililitrelik yeni bir tüpe 10 mililitre soğuk RPMI 1640 Medium ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, yoğun beyaz fazı kan içeren tüpten hazırlanan RPMI içeren tüpe aktarın ve soğuk RPMI ile 50 mililitreye kadar doldurun.

Süspansiyonu 450 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Peleti 10 mililitre soğuk RPM'de tekrar askıya alın ve RPMI 1640 ile 50 mililitreye kadar doldurun. Karışımı tekrar santrifüjleyin ve peleti 50 mililitre RPM'de yeniden askıya alın.

Yine, numuneyi santrifüjleyin ve hücre peletini 1.5 mililitre soğuk monosit tamponunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, hücre süspansiyonuna 250 mikrolitre anti CD14 MicroBeads ekleyin ve buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, manyetik bir ayırıcı rafa bir filtre takarak bir ayırma sütunu hazırlayın.

Dengeleme için kolona 900 mikrolitre monosit tamponu ekleyin. İnkübasyondan sonra, hücre süspansiyonunu filtrenin üzerine dökün ve yerçekimi ile bir atık tüpe akmasına izin verin. Manyetik boncuklara bağlı hücreleri içeren sütunu yıkamak için bir mililitre monosit tamponu ekleyin.

Kolonun altındaki atık tüpünü, 20 mililitre RPMI içeren 50 mililitrelik yeni bir tüple değiştirin. Sütuna üç mililitre monosit tamponu ekleyin. Sütunu manyetik raftan çıkarın ve damgayı takın.

Hücreleri hazırlanan 50 mililitrelik tüpe bastırın ve 30 mililitreye kadar RPMI ile doldurun. Işık mikroskobu altında bir Neubauer sayma odası kullanarak hücreleri sayın ve hücre sayısını rpmi ile mililitrede altı hücrenin kuvvetine iki kez 10 olarak ayarlayın. Altı oyuklu bir odanın her bir oyuğuna bir mililitre hücre süspansiyonu ekin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede iki ila dört saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, hücrelerin düzgün bir şekilde yapışıp yapışmadığını kontrol edin ve RPMI'yi 1,5 mililitre monomedium ile değiştirin. Monositler makrofajlara farklılaşana kadar altı güne kadar inkübasyona devam edin. Altı oyuklu bir plakada donör kan örneklerinden birincil insan makrofajları türetildikten sonra, 500 mikrolitre Accutase ekleyin ve makrofajları ayırmak için 40 dakika inkübe edin.

Daha sonra 500 mikrolitre ortam ekleyin ve santrifüjleme için 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra hücreleri bir kez iki mililitre DPBS ile yıkayın ve bir Neubauer odası ile sayın. İstenilen sayıda makrofajı 40 mikrolitre kollajen I karışımıyla seyreltin ve tüpü kısaca girdaplayın.

Sferoidleri yıkamak için, 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına 300 mikrolitre DPBS ekleyin. DPBS ile steroidi toplamak için kesik uçlu bir mililitre mavi pipet ucu kullanın. Steroid uca yerleştikten sonra, tümör steroidini yüzey gerilimi ile aktarmak için pipeti görüntüleme odasının altına kısa bir süre itin.

Steroid ile aktarılan kalıntı DPBS'yi mümkün olduğunca çıkarın. Steroid içeren görüntüleme odasına hızlı bir şekilde 40 mikrolitre kollajen I makrofaj karışımı ekleyin. Kollajen karışımını tamamen polimerize etmek için plakayı nemli koşullar altında 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitte 30 dakika inkübe edin.

Polimerizasyondan sonra, her bir oyuğa dikkatlice 25 mikrolitre kanser hücresi ortamı ekleyin ve üç gün boyunca inkübasyona devam edin. İstenilen zaman noktalarında bir lazer tarama mikroskobu kullanarak canlı numuneyi görüntüleyin. H1299 GFP küresel alanı, istilanın üçüncü gününde 40.307 mikrometre kare olarak ölçülürken, küresel çevre 1700.17 mikrometre olarak bulundu ve bu da zaman içinde büyümeyi gösterdi.

Sferoidden kanser hücrelerinin toplu istilası gözlendi. Bireysel kanser hücresi istilası için bir gösterge olarak hizmet eden 51 izole parçacık tanımlandı. Küre, 1.10'luk bir en boy oranını ve 0.18'lik bir daireselliği korudu ve düşük deformasyon gösterdi.