Name: Nicotiana benthamianada Plasmodesmataya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:55:00.000+00:00
Duration: 5 min 54 s
Description: Öğrenin, Nicotiana benthamiana'da plazmodezmata protein lokalizasyonunu konfokal mikroskopi ile analiz etme yöntemini. Bu protokol, bitki hücreleri arası iletişim ve viral enfeksiyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Plazmodesmata Fonksiyonunu Keşfetmek: Hedeflenen Proteinlerin Konfokal Mikroskobu

<ol><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-localized+protein+mediates+crosstalk+between+cell-to-cell+communication+and+innate+immunity+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis.</a> The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).</li>
<li>Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+gateways+to+local+and+systemic+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection.</a> Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).</li>
<li>Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Channels+under+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Channels under pressure.</a> Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).</li>
<li>Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata%3A+Structure%2C+function+and+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis.</a> Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).</li>
<li>Fernandez-Calvino, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+plasmodesmal+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis plasmodesmal proteome.</a> PLoS One. 6 (4), e18880(2011).</li>
<li>Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+meta-proteomic+pipeline+for+the+identification+of+plasmodesmata+proteins+and+regulatory+conditions+in+diverse+plant+species%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species.</a> BMC Biol. 20, 128(2022).</li>
<li>Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmodesmata-associated+%CE%B2-1%2C3-glucanase+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+J%22%5BJournal%5D)">A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis.</a> The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).</li>
<li>Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+for+rice+membrane+dynamics+and+plasmodesmata+during+biotrophic+invasion+by+the+blast+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus.</a> The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).</li>
<li>Aung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+bacteria+target+plant+plasmodesmata+to+colonize+and+invade+surrounding+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues.</a> The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).</li>
<li>Cui, W., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+callose+synthases+CalS1%2F8+regulate+plasmodesmal+permeability+during+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Plants%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress.</a> Nat Plants. 2 (5), 160(2016).</li>
<li>Liu, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytosphinganine+affects+plasmodesmata+permeability+via+facilitating+PDLP5-stimulated+callose+accumulation+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant%22%5BJournal%5D)">Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis.</a> Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).</li>
<li>Caillaud, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+protein+PDLP1+localizes+to+haustoria-associated+membranes+during+downy+mildew+infection+and+regulates+callose+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition.</a> PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).</li>
<li>Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLi%2C+Z+%22The+Plant+Cell%22">The Plant Cell</a>. , (2024).</li>
<li>Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChen%2C+X+%22Sci+Bull%22">Sci Bull</a>. , (2024).</li>
<li>Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Arabidopsis+GPI-anchor+plasmodesmal+neck+protein+with+callose+binding+activity+and+potential+to+regulate+cell-to-cell+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking.</a> The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).</li>
<li>Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+targeting+of+a+plasmodesmal+protein+affecting+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication.</a> PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).</li>
<li>Lim, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmodesmata+localizing+proteins+regulate+transport+and+signaling+during+systemic+acquired+immunity+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants.</a> Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).</li>
<li>Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+several+Nicotiana+species+as+hosts+for+high-scale+Agrobacterium-mediated+transient+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression.</a> Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).</li>
<li>Walhout, A. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAY+recombinational+cloning%3A+Application+to+the+cloning+of+large+numbers+of+open+reading+frames+or+ORFeomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes.</a> Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).</li>
<li>Huang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dsRNA-induced+immunity+targets+plasmodesmata+and+is+suppressed+by+viral+movement+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins.</a> The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).</li>
<li>Roberts, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+changes+in+the+frequency+and+architecture+of+plasmodesmata+during+the+sink-source+transition+in+tobacco+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves.</a> Protoplasma. 218, 31-44 (2001).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plasmodesmal+localization+signal+of+TMV+MP+is+recognized+by+plant+synaptotagmin+SYTA%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA.</a> mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).</li>
<li>Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannabidiol+prevents+the+development+of+cold+and+mechanical+allodynia+in+paclitaxel-treated+female+C57Bl6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice.</a> Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).</li>
<li>Erkkilä, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widefield+fluorescence+lifetime+imaging+of+protoporphyrin+IX+for+fluorescence-guided+neurosurgery%3A+An+ex+vivo+feasibility+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biophotonics%22%5BJournal%5D)">Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study.</a> J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).</li>
<li>Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tobamovirus+Turnip+vein+clearing+virus+30-kilodalton+movement+protein+localizes+to+novel+nuclear+filaments+to+enhance+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection.</a> J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).</li>
<li>Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+functional+plasmodesmal+localization+signal+in+a+plant+viral+cell-to-cell-movement+protein%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein.</a> mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).</li>
<li>Kumar, G., Dasgupta, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variability%2C+functions+and+interactions+of+plant+virus+movement+proteins%3A+what+do+we+know+so+far%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far.</a> Microorganisms. 9 (4), 695(2021).</li>
<li>Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ins+and+outs+of+nondestructive+cell-to-cell+and+systemic+movement+of+plant+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses.</a> Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ABT AC 1 fazlı motor</td><td>BRANDTECH</td><td>&nbsp; ABF63/4C-7RQ</td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens EHA105</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kontaminasyon kontrolü&nbsp;</td><td>CCI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi BP Klonaz II Enzim karışımı</td><td>İnvitrojen</td> <td># 11789020</td><td></td></tr><tr><td>Ağ Geçidi LR Klonaz II Enzim karışımı</td><td>Invitrojen</td> <td># 11791020</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 8.0.1.</td><td>GraphPad Yazılım A.Ş.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resim J</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri ve Optik ve Hesaplamalı Enstrümantasyon</td><td></td><td></td>Laboratuvarı</tr><tr><td>Lazer taramalı konfokal mikroskop</td><td>Zeiss</td><td>LSM 900</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Bitki türleri</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Invitrogen</td><td>#12213013</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Yüksek Kaliteli DNA Polimeraz</td><td>NEB</td><td>#M0491S</td><td></td></tr></tbody></table>

nicotiana benthamiana'da plasmodesmata'ya protein ayıklamasının konfokal mikroskopi analizi

Confocal Microscopy Analysis of Protein Sorting to Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Bitki fizyolojisinde PH fonksiyonu ve patojenlerle etkileşimler üzerine yapılan çalışmaları kolaylaştırmak için, PD lokalizasyonu için üç basit ve güvenilir referans protein geliştirilmiştir. İki hücresel PD proteini ve bitki tobamovirüsü TVCV tarafından kodlanan patojen türevli bir MP proteini seçildi. Bu proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, her bir proteinin C-terminaline kaynaşmış bir otofloresan raportör EGFP kullanılarak görselleştirildi. Alternatif bir yaklaşımda, PD ile ilişkili kalloz birikintilerinin anilin mavisi boyanması kullanılarak PD görselleştirildi. Deneyler, hem PDLP5'in hem de MP'nin, daha önce belirtildiği gibi, hücre çekirdeğinde de lokalize olan MP ile noktasal PD lokalizasyonu sergilediğini gösterdi (Şekil 1A)25. Buna karşılık, PDCB1'in PD ve ER arasında bölündüğü görülmüştür (Şekil 1A). GFP etiketli proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu yorumlamada daha az deneyimli araştırmacılar için, Şekil 1A ayrıca bitki hücrelerinde eksprese edilen EGFP'nin karakteristik nükleositoplazmik modelini de göstermektedir. PDCB1'in ER sinyalini doğrulamak için, PDCB1'i bir ER markörü ile birlikte ifade ettik ve PDCB1 sinyalinin ER markörünün sinyaliyle örtüştüğünü bulduk (Şekil 1B). Test edilen proteinlerin PD lokalizasyonunun etkinliğini değerlendirmek için, bu sinyalin PD lokalizasyonunu sergileyen floresan sinyali ifade eden hücrelerin yüzdesi hesaplanmıştır (Tablo 1).
Referans proteinleri kullanarak hücre altı lokalizasyonunun tanımlanması için, referans protein ekspresyonunun zaman ölçeğini ve lokalizasyonunun potansiyel değişikliklerini anlamak yararlıdır. Şekil 2 , MP, PDLP5 ve PDCB1 için PD'nin kendileri anilin mavisi boyama ile görselleştirildiğinde bu tür kinetikleri göstermektedir. Hem MP hem de PDLP5, infiltrasyondan bir günlük sonra (dpi) PD'de birikmeye başladı ve bu birikim 2 dpi'de belirgin bir maksimuma ulaştı ve 5 gün daha sabit kaldı, ardından sinyal yoğunluğu azaldı, büyük olasılıkla protein bozulması nedeniyle. PDCB1 hücre altı sıralamasının zaman seyri daha karmaşıktı: ilk 3 dpi için, PDCB1, PD'ye özgü sinyal lokalizasyonunu neredeyse tamamen gizleyen nispeten güçlü bir ER sinyali sergilerken, 5 dpi'de bu ikinci sinyal daha az hücrede de olsa daha belirgin hale geldi (Şekil 2). İlginç bir şekilde, 5 dpi'den sonra PDCB1'in net PD lokalizasyon modelinin ortaya çıkması, EGFP sinyalini gösteren önemli ölçüde daha az hücre ile çakıştı (Ek Şekil 1). Bu nedenle, PDLP5 ve MP, 2-5 dpi'lik optimal bir görselleştirme zaman penceresi ile diğer hücresel bölmelerin çoğunda çok az arka plana sahip PD referans proteinleri olarak işlev görebilir. Öte yandan PDCB1, bir PD işaretleyici kadar uygun değildir.
Daha sonra PD belirteçlerinin, diğer PD proteinlerinin varlığında hücre altı lokalizasyon özgüllüklerini korudukları doğrulandı. Bu amaçla, MP-EGFP veya PDLP5-EGFP, CFP ile etiketlenmiş başka bir bitki virüsü olan Tütün mozaik virüsünün (TMV)26 MP'sini PD-lokalize eden bir ile birlikte eksprese edildi. Şekil 3 , her iki durumda da, birlikte eksprese edilen proteinlerin net bir PD lokalizasyon modeli sergilediğini göstermektedir. Benzer şekilde, MP-EGFP- veya PDLP5-EGFP eksprese eden dokuların PD'ye özgü histolojik anilin mavisi boyanması, EGFP ve anilin mavisi sinyallerinin PD lokalizasyonu ile herhangi bir girişim tespit etmedi (Şekil 3).
PD lokalizasyon çalışmaları genellikle referans proteinin genel ekspresyonunun ve PD sinyalinin daha kantitatif bir tahmininden yararlanır. Bu niceleme yaklaşımı Şekil 4 ve Şekil 5'te gösterilmiştir. Genel ifadenin nicelleştirilmesi için, PDLP5 ve MP'nin sinyal yoğunluğu ölçüldü. Her iki protein de 10 dpi periyodu boyunca tüm görselleştirme zaman noktalarında güçlü sinyaller gösterdi, maksimum sinyal yoğunluğu PDLP5 için 3 dpi ve MP için 2 dpi'de (Şekil 4). Görselleştirme zaman noktalarının hiçbirinde PDLP5 ve MP arasında sinyal yoğunluğunda istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu. PDCB1 sinyal yoğunluğu, zaman noktaları arasında daha fazla dalgalanma sergiledi ve en güçlü sinyal 7 dpi'de gözlemlendi (Şekil 4), ancak ifade eden hücrelerin kıtlığı nedeniyle bu zaman noktasında istatistiksel olarak anlamlı veri toplamak zordu. Bu nedenle, ilk 3 dpi, PDCB1 ifadesini algılamak için en uygun zamanlamayı temsil eder. Beklendiği gibi, anilin mavisi boyama örnekleri, geçici olarak eksprese edilen proteinlerden daha kararlı bir sinyal sergiledi (Şekil 4).
PDLP5 ve MP tarafından oluşturulan PD punkta daha sonra ölçüldü. PDLP5, gözlem süresi boyunca sabit sayıda PD punkta gösterdi ve test edilen zaman noktalarının herhangi ikisi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark yoktu (Şekil 5). MP tarafından oluşturulan en yüksek PD punkta sayısı 2 dpi'de tespit edildi ve gözlem süresinin sonuna kadar nispeten sabit kaldılar. PDLP5 ve MP arasındaki PD punkta sayıları karşılaştırıldığında, çoğu örnekleme zamanında istatistiksel olarak anlamlı bir fark ortaya çıkmadı (Şekil 5). Anilin mavisi ile boyanmış PD puncta sayısı da 10 dpi'de hafifçe azalmasına rağmen sabit kaldı. Anilin mavisi, PDLP5 veya MP ile süslenmiş PD punkta sayıları, bu belirteçlerin PD özgüllüğü ile tutarlı olarak istatistiksel anlamlılık ile birbirine benzerdi (Şekil 5). PDCB1 için PD puncta sayıları analiz edilmedi, çünkü daha önceki zaman noktalarında PD sinyali ER sinyali tarafından gizlendi ve daha sonraki zaman noktalarında sadece nispeten az sayıda hücrede gözlendi (bkz. Şekil 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig01.jpg"> Şekil 1: TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in plazmodesmata (PD) lokalizasyonu, Nicotiana benthamiana'da geçici olarak eksprese edilir ve PD'nin anilin mavisi boyanması. (A) MP-EGFP, PDLP5-EGFP ve PDCB1-EGFP'nin PD lokalizasyonu ve anilin boyama. EGFP sinyali yeşil, anilin mavisi sinyali mavi ve plastid otofloresan kırmızıdır. (B) MP-EGFP, PDLP5-EGFP ve PDCB1-EGFP'nin mRFP ile etiketlenmiş endoplazmik retikulum (ER) markörü ile birlikte ekspresyonu. Görüntüler infiltrasyondan 2 gün sonra (dpi) kaydedildi ve iki bağımsız deneyi temsil eden tek konfokal bölümlerdir (N = 2 bitkiden 20 görüntü). EGFP sinyali yeşil, mRFP sinyali mor ve plastid otofloresan kırmızı renktedir. Sarı oklar, ER'de lokalize PDCB1'i gösterir. Ölçek çubukları = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig02.jpg"> Şekil 2: Nicotiana benthamiana'da geçici olarak ifade edilen TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in PD lokalizasyonunun ve PD'nin anilin mavisi boyanmasının zaman seyri. Görüntüler 2 dpi'de kaydedildi ve iki bağımsız deneyi temsil eden tek konfokal bölümlerdir (N = 20 tesisten 2 görüntü, PDCB1-EGFP için 7 dpi ve 10 dpi hariç, daha az hücrenin sinyal sergilediği). EGFP sinyali yeşil renktedir ve anilin mavisi sinyali mavi renktedir. Ölçek çubukları = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig03.jpg"> Şekil 3: TVCV MP ve PDLP5, PD lokalize edici bir TMV MP ile birlikte ekspresyon ve anilin mavisi ile kostaining'i takiben PD lokalizasyonlarını korurlar. Görüntüler 2 dpi'de kaydedildi ve 4-6 bitkiden N ≥ 10 görüntüyü temsil eden tek konfokal bölümlerdir. EGFP sinyali yeşil renktedir, CFP sinyali ve anilin mavisi sinyali mavi renktedir ve plastid otofloresan kırmızı renktedir. Ölçek çubukları = 5 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig04.jpg"> Şekil 4: Nicotiana benthamiana ve anilin mavisi PD boyamasında geçici olarak ifade edilen TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in floresan yoğunluğunun zaman seyri. Nicel veriler, Şekil 2'de açıklanan deneylerden toplanmıştır. Hata çubukları, birden fazla deneyden elde edilen ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Bireysel veri noktaları, her ölçüm için ortalama olarak gösterilir. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü varyans analizi ile değerlendirilen ortalama değerler arasındaki farklar P değerleri için istatistiksel olarak anlamlıdır. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01 ve ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001; ns, istatistiksel olarak anlamlı değil. Mavi çubuklar, anilin boyama; açık yeşil çubuklar, MP-EGFP, koyu yeşil çubuklar, PDLP5-EGFP; sarı çubuklar, PDCB1-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67378/67378fig05.jpg"> Şekil 5: Nicotiana benthamiana'da geçici olarak ifade edilen TVCV MP ve PDLP5 ile PD punkta oluşumunun zaman seyri ve PD'nin anilin mavisi boyanması. Nicel veriler, Şekil 2'de açıklanan deneylerden toplanmıştır. Hata çubukları, birden fazla deneyden elde edilen ortalamanın standart sapmasını temsil eder. Bireysel veri noktaları, her ölçüm için ortalama olarak gösterilir. Tukey'in çoklu karşılaştırma testi ile iki yönlü varyans analizi ile değerlendirilen ortalama değerler arasındaki farklar P değerleri için istatistiksel olarak anlamlıdır. *P &lt; 0.05, **P &lt; 0.01, ***P &lt; 0.001, ****P &lt; 0.0001. Mavi çubuklar, anilin boyama; açık yeşil çubuklar, MP-EGFP, koyu yeşil çubuklar, PDLP5-EGFP. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/67378fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td colspan="4">Deney I</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Toplam hücreler</td>
			<td>PD lokalizasyonu olan hücreler</td>
			<td>Karışık sinyalli hücreler</td>
			<td>PD lokalizasyonu olan hücreler (%)</td>
		</tr><tr><td>Anilin mavisi</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>4</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>3</td>
			<td>38</td>
			<td>7.5</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>0</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td colspan="4">Deney II</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>Toplam hücreler</td>
			<td>PD lokalizasyonu olan hücreler</td>
			<td>Karışık sinyalli hücreler</td>
			<td>PD lokalizasyonu olan hücreler (%)</td>
		</tr><tr><td>Anilin mavisi</td>
			<td>40</td>
			<td>40</td>
			<td>8</td>
			<td>100</td>
		</tr><tr><td>MP-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>8</td>
			<td>97.5</td>
		</tr><tr><td>PDCB1-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>12</td>
			<td>31</td>
			<td>30</td>
		</tr><tr><td>PDLP5-EGFP</td>
			<td>40</td>
			<td>39</td>
			<td>2</td>
			<td>97.5</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: PD lokalizasyonunun etkinliği.
Ek Şekil 1: Nicotiana benthamiana'da geçici olarak eksprese edilen TVCV MP, PDLP5 ve PDCB1'in PD lokalizasyonu. Görüntüler 5 dpi (A), 7 dpi (B) ve 10 dpi (C) olarak kaydedildi. EGFP sinyali yeşildir ve plastid otofloresan kırmızıdır. Ölçek çubukları = 20 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67378/Figure%20S1.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Plasmodesmata are membranous nanopores that connect the cytoplasm of adjacent plant cells and enable the cell-to-cell trafficking of nutrients, ...

confocal-microscopy-analysis-protein-sorting-to-plasmodesmata

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitki hücreleri arasındaki makromoleküler ticareti, geçici bir ilgi floresan etiketli protein ifade ve konfokal mikroskobu ile içi ve hücreler arası dağılımı analiz değerlendirilebilir.

-Cell Hücre makromoleküler Ulaştırma Testi Planta Biyolistik Bombardıman kullanımı

Biz bitki protein-protein etkileşimleri test etmek için bir teknik geliştirdik. Sarı floresan protein (YFP) örtüşmeyen iki parça halinde bölünmüş durumda. Her parçası füzyon proteinleri ifade sağlayan, Gateway sistemi üzerinden ilgi bir gen-frame klonlanmış. YFP sinyal Sulandırma sadece tahkikat proteinler etkileşime girdiğinde oluşur.

Ağ Geçidi Uyumlu Bimoleküler Floresan tamamlama (BiFC) kullanarak Bitki Protein Etkileşimleri Tespiti

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Hücre altı düzeyde, sinyal olayları gelişimsel ve çevresel ipuçları tarafından dinamik olarak modüle edilir. Burada, dinamik protein-protein etkileşimini izlemek ve bitki hücrelerinde sinyal iletiminin uzamsal organizasyonunu açıklamak için tütün geçici ekspresyon sistemini kullanan bir protokolü açıklıyoruz.

Tütün Geçici İfade Sisteminin Kullanılması bir MAPK sinyal yolu Mekansal Reorganizasyon Görüntüleme

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Birden çok chimeric floresan füzyon protein geleneksel yöntemlerle zorlukları aşmak tesislerinde ortak ifade etmek için yeni bir yöntem geliştirdik. Kaset protein ortak ifade ulaşmak için ifade birden çok fonksiyonel olarak bağımsız protein içeren bir tek ifade plazmid kullanarak yararlanır.

Bitkilerde etkin bir şekilde birden fazla Chimeric floresan Fusion proteinlerin ortak ifade

Bu protokolü nasıl görüntü yaşamak ve sürgün apikal sürgen confocal mikroskobu tarama lazer kullanarak farklı bitki türü üzerinden analiz sunuyor.

Sürgün apikal sürgen farklı bitki türü üzerinden confocal canlı görüntüleme

Burada açıklanan Nicotiana benthamiana yaprak dokusunda NLR bağışıklık reseptörünün TIR etki alanının etkileşim ortaklarının belirlenmesi için bir yakınlık etiketleme yöntemidir. Ayrıca Nicotiana ve diğer bitki türlerinde bu tekniği kullanarak ilgi diğer proteinler arasındaki etkileşimlerin belirlenmesi için ayrıntılı bir protokol sağlanır.

Protein-Protein Etkileşim Ağlarının Planta Özdeşleştirilmesinde TurboID Tabanlı Yakınlık Etiketlemesi

Mısır yaprağı primordiaları derinlemesine kaplanır ve yuvarlanır, bu da onları incelemeyi zorlaştırır. Burada, floresan ve konfokal görüntüleme için enine kesitler ve açılmış mısır yaprağı primordialarının bütün montajlarını hazırlamak için yöntemler sunuyoruz.

Enine kesitler hazırlamak için geliştirilmiş yöntemler ve floresan ve konfokal görüntüleme için mısır yaprağı primordiasının bütün montajlarını açma

Öğrenin, Nicotiana benthamiana'da plazmodezmata protein lokalizasyonunu konfokal mikroskopi ile analiz etme yöntemini. Bu protokol, bitki hücreleri arası iletişim ve viral enfeksiyon mekanizmalarını anlamaya yardımcı olur.

Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Daha fazla video keşfet