Name: Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: Öğrenin, HeLa hücreleri kullanarak TDP-43 salınımını ve otofaji düzenlemesini nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, ALS ve FTLD-TDP için terapötik hedefler keşfetmenize yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Bozulmuş Lizozom Füzyonu ile Otofajide LC3-II-Pozitif EV Salınımının Değerlendirilmesi

<ol><li>Tanaka, Y., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+1+mutants+form+aggregates+that+induce+accumulation+of+prion-like+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Prion%22%5BJournal%5D)">Profilin 1 mutants form aggregates that induce accumulation of prion-like tdp-43.</a> Prion. 10 (4), 283-289 (2016).</li>
<li>Mehta, P. R., Brown, A. L., Ward, M. E., Fratta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+era+of+cryptic+exons%3A+Implications+for+als-ftd%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">The era of cryptic exons: Implications for als-ftd.</a> Mol Neurodegener. 18 (1), 16(2023).</li>
<li>Kawakami, I., Arai, T., Hasegawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+basis+of+clinicopathological+heterogeneity+in+tdp-43+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">The basis of clinicopathological heterogeneity in tdp-43 proteinopathy.</a> Acta Neuropathol. 138 (5), 751-770 (2019).</li>
<li>Chatterjee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+extracellular+vesicle+tau+and+tdp-43+as+diagnostic+biomarkers+in+ftd+and+als%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Plasma extracellular vesicle tau and tdp-43 as diagnostic biomarkers in ftd and als.</a> Nat Med. 30 (6), 1771-1783 (2024).</li>
<li>Kasai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+use+of+csf+nfl+and+csf+tdp-43+improves+diagnostic+performance+in+als%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Combined use of csf nfl and csf tdp-43 improves diagnostic performance in als.</a> Ann Clin Transl Neurol. 6 (12), 2489-2502 (2019).</li>
<li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+secretion+is+a+key+pathway+for+clearance+of+pathological+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Exosome secretion is a key pathway for clearance of pathological tdp-43.</a> Brain. 139 (Pt 12), 3187-3201 (2016).</li>
<li>Ding, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+to+als-ftd-csf+generates+tdp-43+aggregates+in+glioblastoma+cells+through+exosomes+and+tnts-like+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Exposure to als-ftd-csf generates tdp-43 aggregates in glioblastoma cells through exosomes and tnts-like structure.</a> Oncotarget. 6 (27), 24178-24191 (2015).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> N Engl J Med. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Sasaki, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+spinal+cord+motor+neurons+in+sporadic+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autophagy in spinal cord motor neurons in sporadic amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 70 (5), 349-359 (2011).</li>
<li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Converging+mechanisms+in+als+and+ftd%3A+Disrupted+rna+and+protein+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Converging mechanisms in als and ftd: Disrupted rna and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li>
<li>Nguyen, D. K. H., Thombre, R., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+as+a+common+pathway+in+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Autophagy as a common pathway in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurosci Lett. 697, 34-48 (2019).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+involvement+of+lysosomal+dysfunction+in+pathological+changes+of+the+brain+in+aged+progranulin-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Possible involvement of lysosomal dysfunction in pathological changes of the brain in aged progranulin-deficient mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 2, 78(2014).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+progranulin-driven+autophagy-lysosomal+pathway+mediates+secretion+of+the+nuclear+protein+tdp-43%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the progranulin-driven autophagy-lysosomal pathway mediates secretion of the nuclear protein tdp-43.</a> J Biol Chem. 299 (11), 105272(2023).</li>
<li>Tanaka, Y., Ito, S., Suzuki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+secretion+via+extracellular+vesicles+is+regulated+by+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy+Rep%22%5BJournal%5D)">TDP-43 secretion via extracellular vesicles is regulated by macroautophagy.</a> Autophagy Rep. 3 (1), (2024).</li>
<li>Ratajczak, M., Ratajczak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+microvesicles%2Fexosomes%3A+discovery%2C+disbelief%2C+acceptance%2C+and+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">Extracellular microvesicles/exosomes: discovery, disbelief, acceptance, and the future.</a> Leukemia. 34 (12), 3126-3135 (2020).</li>
<li>Tanaka, Y., Kozuma, L., Hino, H., Takeya, K., Eto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abemaciclib+and+vacuolin-1+decrease+aggregate-prone+tdp-43+accumulation+by+accelerating+autophagic+flux%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Abemaciclib and vacuolin-1 decrease aggregate-prone tdp-43 accumulation by accelerating autophagic flux.</a> Biochem Biophys Rep. 38, 101705(2024).</li>
<li>Dingjan, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endosomal+and+phagosomal+snares%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Endosomal and phagosomal snares.</a> Physiol Rev. 98 (3), 1465-1492 (2018).</li>
<li>Tanaka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progranulin+regulates+lysosomal+function+and+biogenesis+through+acidification+of+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Progranulin regulates lysosomal function and biogenesis through acidification of lysosomes.</a> Hum Mol Genet. 26 (5), 969-988 (2017).</li>
<li>Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+freely+available+easy-to-use+software+%27EZR%27+for+medical+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transpl%22%5BJournal%5D)">Investigation of the freely available easy-to-use software 'EZR' for medical statistics.</a> Bone Marrow Transpl. 48 (3), 452-458 (2013).</li>
<li>Cookson, N. A., Cookson, S. W., Tsimring, L. S., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle-dependent+variations+in+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Cell cycle-dependent variations in protein concentration.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2676-2681 (2010).</li>
<li>Plate, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecule+proteostasis+regulators+that+reprogram+the+ER+to+reduce+extracellular+protein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Small molecule proteostasis regulators that reprogram the ER to reduce extracellular protein aggregation.</a> eLife. 5, e15550(2016).</li>
<li>Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mammalian+autophagy+in+protein+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Jpn+Acad+Ser+B+Phys+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of mammalian autophagy in protein metabolism.</a> Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 83 (2), 39-46 (2007).</li>
<li>Nanayakkara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagic+lysosome+reformation+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagic lysosome reformation in health and disease.</a> Autophagy. 19 (5), 1378-1395 (2023).</li>
<li>Nozawa, T., Minowa-Nozawa, A., Aikawa, C., Nakagawa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STX6-VTI1B-VAMP3+complex+facilitates+xenophagy+by+regulating+the+fusion+between+recycling+endosomes+and+autophagosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">The STX6-VTI1B-VAMP3 complex facilitates xenophagy by regulating the fusion between recycling endosomes and autophagosomes.</a> Autophagy. 13 (1), 57-69 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>% 0,25 Tripsin EDTA</td><td>Fujifilm Wako</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Çanak</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150464</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tüp</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; L Pipet Ucu</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-301</td><td>pipetleme</td></tr><tr><td>2-Merkaptoetanol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>21417-52</td><td>için bir malzeme numune tampon çözeltisi</td></tr><tr><td>3,3'-Diaminobenzidin Tetrahidroklorür</td><td>Nacalai Tesque</td><td>11009-41</td><td>DAB çözeltisi için bir malzeme</td></tr><tr><td>3,5 cm Tabak&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>6 cm Tabak&nbsp;</td><td>TrueLine</td><td>TR4001</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Blok Termostatik Banyolar (kuru termobanyolar)</td><td>EYELA</td><td>273860</td><td></td></tr><tr><td>Aspiratör</td><td>SANSYO</td><td>SAP-102</td><td>inhalasyon solüsyonu</td></tr><tr><td>Avanti JXN-30</td><td>Beckman Coulter</td><td>B34193</td><td></td></tr><tr><td>Bafilomisin A1</td><td>Adipogen</td><td>BVT-0252</td><td></td></tr><tr><td>Biotin konjuge Keçi Anti-tavşan IgG Antikor</td><td>Vektörü Laboratuvarlar&nbsp;</td><td>BA-1000</td><td>İmmünoblotlama için 2. antikor</td></tr><tr><td>Biotin konjuge At Antimouse IgG Antikoru Vektör</td><td>Laboratuvarları&nbsp;</td><td>BA-2000</td><td>İmmünoblotlama için 2. antikor</td></tr><tr><td>Bir</td><td>Nacalai Tesque</td><td>03953-95</td><td>immünoblotlama için bir malzeme</td></tr><tr><td>Bromophenol Blue</td><td>Nacalai Tesque</td><td>05808-61</td><td> numune tampon çözeltisi için bir malzeme</td></tr><tr><td>Calf Serum</td><td>cytiva</td><td>SH30073.03</td><td></td></tr><tr><td>CanoScan LiDE 220</td><td>Canon</td><td>CSLIDE220</td><td>Tarayıcı</td></tr><tr><td>Santrifüj 5702 R</td><td>eppendolf</td><td>5703000039</td><td></td></tr><tr><td>Sayma Slaytları Çift Odacıklı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450015J</td><td>hücre sayımı</td></tr><tr><td>Dijital Sonifier 450</td><td>BRANSON</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit</td><td>Nacalai Tasque</td><td>09659-14</td><td>araç</td></tr><tr><td>DMEM Yüksek Glikoz</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08458-45</td><td>kültür ortamı</td></tr><tr><td>Fenol Kırmızısı olmadan DMEM</td><td>Nacalai Tesque</td><td>08489-45</td><td>kültür ortamı</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>348-01311</td><td>A68 çözümü için bir malzeme</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>sürüm 16.16.27</td><td>satistik analiz</td></tr><tr><td>EZR</td><td>Referans No. 24</td><td>sürüm 1.68</td><td>satistik analiz</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma</td><td>173012</td><td>Kültür ortamı</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>NIH</td><td></td><td>Görüntü analiz aracı</td></tr><tr><td>Gliserol</td><td>Nacalai Tesque</td><td>09886-05</td><td>için bir malzeme örnek tampon çözeltisi</td></tr><tr><td>Hoehst33342</td><td>Dojindo&nbsp;</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Hidrojen Peroksit</td><td>Fujifilm Wako</td><td>080-0186</td><td>DAB çözeltisi için bir malzeme</td></tr><tr><td>Kimwipe S-200</td><td>NIPPON PAPER CRECIA</td><td>62011</td><td>temizleme mendili</td></tr><tr><td>Düşük Tutma Tüpü</td><td>Nippon Genetics</td><td>FG-MCT015CLB</td><td>siRNA ve DNA transfeksiyonu</td></tr><tr><td>LSM780 Konfokal Lazer Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal Fare Anti-LC3 Antikor</td><td>MBL</td><td>M186-3</td><td>İmmünoblotlama için 1. antikor</td></tr><tr><td>Nikel(II) Klorür Hekzahidrat</td><td>Fujifilm Wako</td><td>149-01041</td><td>DAB çözeltisi için bir malzeme</td></tr><tr><td>N-Lauroylsarcosine Sodyum Tuzu</td><td>Nacalai Tesque</td><td>20117-12</td><td></td></tr><tr><td>Optima XE-90 Ultrasantrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>A94471</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Azaltılmış Serum Ortamı</td><td>Thermo Fisher Bilimsel</td><td>31985-070</td><td>siRNA ve DNA transfeksiyonu</td></tr><tr><td>pEGFP-C1-hAtg13</td><td>Addgene</td><td>22875</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>Nacalai Tesque</td><td>26253-84</td><td>Kültür ortamı</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Test Kitleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan Anti-PCNA Antikoru</td><td>BioAcademia</td><td>70-080</td><td>1. antikor immünoblotlama</td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan Anti-syntaxin 6 Antikor</td><td>ProteinTech</td><td>10841-1-AP</td><td>İmmünoblotlama için 1. antikor</td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan Anti-TSG101 Antikoru</td><td>ProteinTech</td><td>28283-1-AP</td><td>İmmünoblotlama için 1. antikor</td></tr><tr><td>Poliklonal Tavşan Anti-ULK1 Antikoru</td><td>ProteinTech</td><td>20986-1-AP</td><td>İmmünoblotlama için 1. antikor</td></tr><tr><td>Poliviniliden Diflorür Membran</td><td>Milliore</td><td>IPVH00010</td><td>immünoblotlama için bir malzemedir</td></tr><tr><td>R</td><td>R geliştirme çekirdek ekibi</td><td>sürüm 4.4.1</td><td>satistik analiz</td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13778</td><td>siRNA transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>siRNA STX6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HSS115604</td><td>transfeksiyon için siRNA</td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Nacalai Tesque</td><td>31320-05</td><td>Tris tamponu ve A68 çözeltisi için bir malzeme</td></tr><tr><td>Sodyum Dodesil Sülfat</td><td>Fujifilm Wako</td><td>192-13981</td><td>> için bir malzeme<br/ numune tampon çözeltisi</td></tr><tr><td>SPARK Mikroplaka Okuyucu</td><td>TECAN</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stealth RNAi Negatif Kontrol Dubleksleri, Med GC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12935300</td><td>siRNA transfeksiyonu</td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Fujifilm Wako</td><td>193-00025</td><td>A68 çözümü için bir malzeme</td></tr><tr><td>TC20 Termal Yazıcılı Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Bio-Rad</td><td>1450109J1</td><td>hücre sayımı</td></tr><tr><td>Thermobath</td><td>TOKYO RIKAKIKAI</td><td>MG-3100</td><td>inkübasyon</td></tr><tr><td>TransIT-293</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR 2700</td><td>DNA transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR2300</td><td>DNA transfeksiyon reaktifi</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan</td><td>Nacalai Tesque</td><td>35406-75</td><td>Tris tamponu, numune tamponu ve A68 çözeltisi için bir malzeme</td></tr><tr><td>Tripan Mavi Boya% 0.40</td> <td>Bio-Rad</td><td>1450021</td><td>hücre sayımı</td></tr><tr><td>Ultra Şeffaf Üstü Açık Tüp, 16 x 96mm &nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>361706</td><td>P1 EV fraksiyonu için toplama</td></tr><tr><td>yapıyor Ultra Şeffaf Tüp, 14 x 89mm</td><td>Beckman Coulter</td><td>344059</td><td>P2 EV fraksiyonu için toplama</td></tr><tr><td>Vectastain ABC Standart Kiti</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>PK-4000</td><td>immünoblotlama</td></tr><tr><td>Yıkama Şişesi</td><td>Bir Olarak</td><td>1-4640-02</td><td>yıkama membranı</td></tr><tr><td>&mu;-Slide 8 Kuyulu Yüksek</td><td>ibidi</td><td>80806</td><td></td></tr></tbody></table>

hücre İçi lc3 pozitif veziküllerin birikimi ile İlişkili olarak hücre dışı veziküller yoluyla lc3-ii salınımının değerlendirilmesi

Evaluation of LC3-II Release via Extracellular Vesicles in Relation to the Accumulation of Intracellular LC3-positive Vesicles

Önceki çalışmalarda gösterildiği gibi, Baf tedavisi TSG101 (P1: P &lt; 0.01, P2: P = 0.012, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) ve LC3-II (P1: P &lt; 0.01, P2: P &lt; 0.01, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) EV açısından zengin fraksiyonda. Özellikle, Baf tedavisi ayrıca EV fraksiyonundaki STX6 seviyelerini de arttırdı (P1: P &lt; 0.01, P2: P &lt; 0.01, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi) (Şekil 1A), STX6'nın EV'lerin bir bileşeni olabileceğini düşündürmektedir. EV fraksiyonunda proliferatif hücre nükleer antijeni (PCNA) gözlenmedi. STX6'nın hücre fraksiyonundaki immünoblotlanması, siRNA yıkımı ile STX6 seviyelerinin yarı yarıya azaldığını ortaya koydu (Şekil 1B). STX6 knockdown, hem araç hem de Baf ile muamele edilen koşullar altında hücre ve EV fraksiyonlarındaki TSG101 seviyelerini etkilemedi (Şekil 1C). Bununla birlikte, STX6 knockdown, araç ile tedavi edilen koşul altında hücre fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini arttırdı, ancak Baf ile tedavi edilen koşul altında değil. STX6 knockdown, Baf ile muamele edilen koşul altında EV fraksiyonundaki LC3-II seviyelerini de arttırdı (Şekil 1D). Bu bulgular, EV'lerde LC3-II'yi immünoblotlama yoluyla tespit etmek için kullanılan yöntemlerin, knockdown verimliliği önemli olmasa bile, yeterince hassas olduğunu göstermektedir. Ek olarak, bu sonuçlar, STX6 yıkımının hücre içi otofagozom sayılarını arttırdığını ve Baf tedavisi altında otofagozomla ilişkili veziküllerin hücre dışı salınımını arttırdığını göstermektedir.
STX6 yıkımının hücre içi otofagozom ve otolizozom sayılarını etkileyip etkilemediğini daha fazla araştırmak için, otofagozom markörü mCherry-LC3 ve lizozom markörü LAMP1-GFP kullanılarak otofagozomlar ve lizozomlar görselleştirildi. Konfokal canlı hücre görüntüleme, LAMP1-GFP ve mCherry-LC3'ü eksprese eden HeLa hücrelerinde GFP ve mCherry pozitif vezikülleri ortaya çıkardı (Şekil 2A). Otolizozomlar GFP- ve mCherry pozitif veziküller olarak tanımlanırken, otofagozomlar GFP-negatif ve mCherry pozitif veziküller olarak tanımlandı. STX6 knockdown, araçla tedavi edilen koşul altında otofagozomların ve otolizozomların sayısını artırdı (Şekil 2B, C). Bununla birlikte, STX6 yıkımı, Baf ile tedavi edilen koşul altında otofagozom ve otolizozom sayılarını etkilememiştir (Şekil 2B, C).
STX6 yıkımına bağlı hücre içi otofagozom sayılarındaki artışın, artmış otofagozom oluşumundan kaynaklanıp kaynaklanmadığını belirlemek için, otofagozom oluşumu için gerekli bir süreç olan omegazom oluşumu, omegazom markörü GFP-ATG13 sinyal yoğunluğu kullanılarak incelendi. Konfokal canlı hücre görüntüleme, omegazom oluşumunu gösteren GFP-ATG13'ün birleştirilmiş bir görüntüsünü sağladı (Şekil 3A). STX6 knockdown, GFP-ATG13 sinyal yoğunluğunu azalttı (P = 0.023, EZR19'da iki yönlü ANOVA ile belirlendiği gibi). STX6 knockdown, araç tarafından tedavi edilen koşullar altında GFP-ATG13 sinyal yoğunluğunu önemli ölçüde etkilemese de, Baf ile tedavi edilen koşullar altında sinyali önemli ölçüde azalttı (Şekil 3B). Toplu olarak, bu bulgular STX6 yıkımının, otofagozomla ilişkili veziküllerin birikimine bağlı LC3-II pozitif veziküllerin salınımını arttırdığını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig01.jpg"> 
Şekil 1: Araç veya Baf tedavisi altında kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edilen HeLa hücrelerinden hücre, P1 ve P2 fraksiyonlarının immünoblotlama sonuçları. HeLa hücreleri, kontrol veya STX6 siRNA ile transfeksiyondan sonra 24 saat boyunca araç (DMSO) veya 100 nM Baf ile muamele edildi. Hücre, P1 (20.000 × g pelet) ve P2 (110.000 × g pelet) fraksiyonları izole edildi. (A) STX6, TSG101, LC3 ve PCNA'yı gösteren her fraksiyonun temsili immünoblotlama görüntüleri. (B-D) İmmünoblot görüntülerinden (B) STX6, (C) TSG101 ve (D) LC3-II için dansitometrik analiz yapıldı. Sinyal yoğunlukları, araç veya Baf ile muamele edilen kontrol veya STX6 siRNA transfekte edilmiş hücrelere normalize edildi. Çubuk grafikler S.E.M. (N = 3) ± ortalama değerleri temsil eder. * Excel'de iki kuyruklu eşleşmemiş t-testi ile P &lt; 0.05'i gösterir. Kısaltmalar: STX6 = sözdizimi 6; Baf = bafilomisin A1; DMSO = dimetil sülfoksit; TSG101 = tümör duyarlılık geni 101; LC3 = mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B, hafif zincir 3B; PCNA = çoğalan hücre nükleer antijeni; S.E.M. = ortalamanın standart hatası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig02.jpg"> 
Şekil 2: Araç ve Baf ile muamele edilen koşul altında kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edilmiş Lamp1-GFP ve mCherry-LC3'ü birlikte eksprese eden HeLa hücrelerinin konfokal görüntü analizi. (A) LAMP1-GFP ve mCherry-LC3'ü stabil bir şekilde eksprese eden HeLa hücrelerinin konfokal görüntüleri, 48 saat boyunca kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edildi, ardından 4 saat boyunca DMSO veya 400 nM Baf'a maruz bırakıldı. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B,C) (B) otofagozomların (LAMP1-GFP negatif ve mCherry-LC3 pozitif noktalar) ve (C) otolizozomların (LAMP1-GFP ve mCherry-LC3 çift pozitif noktalar) kunatifikasyonu Fiji yazılımı kullanılarak gerçekleştirildi. Çubuk grafiklerdeki veriler S.E.M. (N = 3) ± ortalama değerler olarak sunulur. *, Excel'de iki kuyruklu eşleştirilmemiş t-testine dayalı olarak P &lt; 0,05'i gösterir. Kısaltmalar: Lamba1 = lizozomal ilişkili zar proteini 1; LC3 = mikrotübül ile ilişkili proteinler 1A/1B, hafif zincir 3B; STX6 = sözdizimi 6; Baf = bafilomisin A1; GFP = yeşil floresan proteini; S.E.M. = ortalamanın standart hatası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67385/67385fig03.jpg"> 
Şekil 3: GFP-ATG13 eksprese eden, kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edilen ve araç veya Baf tedavisine tabi tutulan HeLa hücrelerinin konfokal görüntülemesi. (A) HeLa hücreleri kontrol veya STX6 siRNA ile transfekte edildi, ardından pEGFP-C1-hAtg13 transfeksiyonu yapıldı ve 4 saat boyunca DMSO veya 400 nM Baf ile muamele edildi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (B) Bağıl sinyal yoğunlukları, her koşuldaki sinyalin Baf ile muamele edilen kontrol siRNA transfekte edilmiş hücrelerinkine normalleştirilmesiyle belirlendi. Çubuk grafik, verileri ± S.E.M. (N = 3) olarak gösterir. * Excel'deki iki kuyruklu eşleşmemiş t-testi ile P &lt; 0.05'i gösterir. Kısaltmalar: hAtg13 = insan otofajisi ile ilgili gen 13; STX6 = sözdizimi 6; Baf = bafilomisin A1; DMSO = dimetil sülfoksit; S.E.M. = ortalamanın standart hatası. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil S1: Kontrol siRNA'sı ile transfekte edilen ve Baf ile tedavi edilen HeLa hücrelerinden hücre, P1 ve P2 fraksiyonlarının immünoblot analizi. HeLa hücreleri kontrol siRNA ile transfekte edildi ve 24 saat boyunca 100 nM Baf'a maruz bırakıldı. Daha sonra fraksiyonlar hazırlandı: hücre, P1 (20.000 × g pelet) ve P2 (110.000 × g pelet). ULK1 ve PCNA'nın temsili immünoblot görüntüleri, karşılaştırma için her bir fraksiyondaki seviyelerini gösterir. Kısaltmalar: Baf = bafilomisin A1; ULK1 = unc-51, otofaji aktive edici kinaz 1 gibi; PCNA = çoğalan hücre nükleer antijeni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67385/67385_Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

(Macro)autophagy represents a fundamental cellular degradation pathway. In this process, double-membraned vesicles known as autophagosomes engulf ...

evaluation-lc3-ii-release-via-extracellular-vesicles-relation-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Mitophagy, takas zarar mitokondri, süreci mitokondrial homeostazı ve sağlık bakım için gereklidir. Bu makale en son mitophagy bazılarını algılama yöntemleri insan hücreleri, Caenorhabditis elegansve fareler sunar.

Vitro ve In Vivo insan hücreleri, C. Elegansve fareler Mitophagy tespiti

Ozmotik stres ekzositozu ve bu işlem sırasında serbest nörotransmitter miktarını etkiler. Biz nasıl transmisyon elektron mikroskobu ile birlikte elektrokimyasal yöntemleri birleştirerek ekstraselüler ozmotik basınç etkisi ekzositozu etkinlik, vezikül quantal boyut ve serbest nörotransmitter miktarı incelemek için kullanılabileceğini göstermek ekzositozu sırasında.

Ozmotik stres etkisi salgı veziküller ve ekzositozu izleme

Memeli hücreleri toplu autophagic tutma etkinliği ölçmek için basit ve iyi doğrulanmış bir iletişim kuralı burada açıklanmıştır. Bu yöntem laktat dehidrogenaz (karaciğer) oranı miktarının toplam hücresel karaciğer düzeylere göre sedimentable hücre kesirler dayanır.

Laktat dehidrogenaz haciz tahlil — Toplu Autophagic haciz etkinliğini memeli hücreleri belirlemek için basit ve güvenilir Yöntem

Bu rapor, mikroglia veya kan makrofajlarından ekstrasellüler vezikül (EV) izolasyonu için kronolojik gereksinimleri vurgulamaktadır. Mikroglia kaynaklı EV'ler nötral büyümenin düzenleyicisi olarak değerlendirilirken, c6 glioma hücre invazyonunun kontrolünde in vitro tahlillerde kan makrofajlı eV'ler incelendi. Amaç, belirli mikroortamlarda bağışıklık arabulucusu olarak bu EV fonksiyonlarını daha iyi anlamaktır.

İmmün Hücre Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu ve Hücre Çevresi Üzerindeki Fonksiyonel Etkisinin İncelenmesi

Burada, osteoartrit için model olarak kullanılan kıkırdak eksplantlarında göçlerini ve alımlarını izlemek için trombositten türetilmiş hücre dışı veziklikleri etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Kıkırdak Eksplantlarında Göç ve Alımı İzlemek için Hücre Dışı Veziküllerin Etiketlenmesi

Hücre dışı veziklinler (EV' ler) hücresel biyolojiye ve hücreler arası iletişime katkıda bulunur. Hücrelerin ALDıĞı EV'leri görselleştirmek ve ölçmek için pratik tahlillere ihtiyaç vardır. Mevcut protokol, nano filtrasyon tabanlı bir mikroakışkan cihaz tarafından EV izolasyonunu takiben konfokal mikroskopi yoluyla üç boyutlu floresan görüntüleme kullanarak EV alma testini önermektedir.

Konfokal Mikroskop Görüntüleme Analizi ile Hücre Dışı Veziklin Alımı Analizi

AlPcS2a aracılı kromofor yardımlı lazer inaktivasyonu (CALI), canlı hücrelerde hücre içi veziküllerin (IV'ler) uzaysal zamansal hasarını incelemek için güçlü bir araçtır.

Hücre İçi Vezikül Rüptürünün İşlevini İncelemek İçin Fotodinamik Bir Yaklaşım

Bu protokolün amacı, LC3 immünofloresan ve LC3 nokta ölçümü yoluyla pankreas kanseri ve pankreas asinar hücrelerinde otofajik düzeyleri belirlemektir.

LC3 İmmünofloresan Kullanılarak İki Farklı Pankreas Hücre Modelinde Otofaji Düzeylerinin Değerlendirilmesi

Önerilen protokol, hücre dışı veziküllerin hücre kültürü süpernatantlarından izolasyonu sırasında endotoksin ile kontaminasyonun nasıl önleneceği ve bunların nasıl uygun şekilde değerlendirileceği konusunda kılavuzlar içermektedir.

Kanser Hücre Hatlarından Elde Edilen Düşük Endotoksin İçeriği Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

Burada, hücresel üst yapı ile ilgili olarak nadir proteinlerin lokalizasyonunu araştırmak için bir araç olarak endojen, floresan etiketlemeye dayalı optimize edilmiş kesit korelasyonlu ışık-elektron mikroskobu için bir protokol sunuyoruz. Bu yaklaşımın gücü, Bafilomisin tedavisi olmadan aç bırakılmış hücrelerde endojen LC3'ün ultrastrüktürel lokalizasyonu ile gösterilmiştir.

Kesit Üzerinde Korbağül Işık-Elektron Mikroskobu ile Endojen LC3'ün Ultrastrüktürel Lokalizasyonu

Öğrenin, HeLa hücreleri kullanarak TDP-43 salınımını ve otofaji düzenlemesini nasıl değerlendirebilirsiniz. Bu yöntem, ALS ve FTLD-TDP için terapötik hedefler keşfetmenize yardımcı olur.

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal

Hücre İçi LC3 Pozitif Veziküllerin Birikimi ile İlişkili Olarak Hücre Dışı Veziküller Yoluyla LC3-II Salınımının Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet