Name: Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNAların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-18T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Öğrenin, tek moleküllü FRET-TIRF mikroskobisi için uzun RNA'ların çift renkli uç etiketlemesi ve fosfolipid veziküllerde kapsüllenmesi yöntemini. Bu protokol, RNA katlanma dinamiklerinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>smFRET-TIRF Çalışmaları için RNA'ların Çift Renkli Uç Etiketleme ve Vezikül Kapsüllenmesi

<ol><li>Eitan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+dynamic+structural+biology%3A+Challenges%2C+perspectives+and+an+appeal+for+open-science+practices%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices.</a> Elife. 10, e60416(2021).</li>
<li>Taekjip, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+resonance+energy+transfer+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence resonance energy transfer at the single-molecule level.</a> Nat Rev Methods Primers. 4, 22(2024).</li>
<li>Ahunbay, E., Steffen, F. D., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+dual+end-labeling+of+large+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical dual end-labeling of large ribozymes.</a> Methods Mol Biol. 2439, 191-204 (2022).</li>
<li>Ahunbay, E., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Group+II+Introns%3A+Highly+structured+yet+dynamic%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia+%28Aarau%29%22%5BJournal%5D)">Group II Introns: Highly structured yet dynamic.</a> Chimia (Aarau). 77 (4), 235-241 (2023).</li>
<li>Steiner, M., Karunatilaka, K. S., Sigel, R. K. O., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+studies+of+group+II+intron+ribozymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-molecule studies of group II intron ribozymes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105 (37), 13853-13858 (2008).</li>
<li>Karunatilaka, K. S., Solem, A., Pyle, A. M., Rueda, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+Mss116-mediated+group+II+intron+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of Mss116-mediated group II intron folding.</a> Nature. 467 (7318), 935-939 (2010).</li>
<li>Paudel, B. P., Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O., Rueda, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+molecular+crowding+accelerates+group+II+intron+folding+and+maximizes+catalysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Optimal molecular crowding accelerates group II intron folding and maximizes catalysis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 115 (47), 11917-11922 (2018).</li>
<li>Saha, R., Verbanic, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+vesicles+chaperone+an+encapsulated+RNA+aptamer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lipid vesicles chaperone an encapsulated RNA aptamer.</a> Nat Commun. 9 (1), 2313(2018).</li>
<li>Boukobza, E., Sonnenfeld, A., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+in+surface-tethered+lipid+vesicles+as+a+new+tool+for+single+biomolecule+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Immobilization in surface-tethered lipid vesicles as a new tool for single biomolecule spectroscopy.</a> J Phys Chem B. 105 (48), 12165-12170 (2001).</li>
<li>Cisse, I., Okumus, B., Joo, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fueling+protein+DNA+interactions+inside+porous+nanocontainers%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Fueling protein DNA interactions inside porous nanocontainers.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104 (31), 12646-12650 (2007).</li>
<li>Zelger-Paulus, S., Hadzic, M. C. A. S., Sigel, R. K. O., Börner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+fluorescently+labeled+RNAs+into+surface-tethered+vesicles+for+single-molecule+FRET+studies+in+TIRF+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of fluorescently labeled RNAs into surface-tethered vesicles for single-molecule FRET studies in TIRF microscopy.</a> Methods Mol Biol. 2331, 1-16 (2020).</li>
<li>Okumus, B., Wilson, T. J., Lilley, D. M. J., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+studies+reveal+that+single+molecule+ribozyme+heterogeneities+are+intrinsic%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation studies reveal that single molecule ribozyme heterogeneities are intrinsic.</a> Biophys J. 87 (4), 2798-2806 (2004).</li>
<li>Ishitsuka, Y., Okumus, B., Arslan, S., Chen, K. H., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature-independent+porous+nanocontainers+for+single-molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Temperature-independent porous nanocontainers for single-molecule fluorescence studies.</a> Anal Chem. 82 (23), 9694-9701 (2010).</li>
<li>Liu, B., Mazouchi, A., Gradinaru, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trapping+single+molecules+in+liposomes%3A+surface+interactions+and+freeze-thaw+effects%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Trapping single molecules in liposomes: surface interactions and freeze-thaw effects.</a> J Phys Chem B. 114 (46), 15191-15198 (2010).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Paul, T., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+generation+and+regeneration+of+PEG-passivated+slides+for+single-molecule+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for generation and regeneration of PEG-passivated slides for single-molecule measurements.</a> STAR Protoc. 3 (1), 101152(2022).</li>
<li>Hadzic, M. C. A. S., Kowerko, D., Börner, R., Zelger-Paulus, S., Sigel, R. K. O. Detailed analysis of complex single molecule FRET data with the software MASH. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHadzic%2C+MCAS+%22Imaging%2C+Manipulation%2C+and+Analysis+of+Biomolecules%2C+Cells%2C+and+Tissues+IX%22">Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues IX</a>. Farkas, D. L., Nicolau, D. V., Leif, R. C. SPIE 971119, (2016).</li>
<li>Chu, B. C., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Le+Orgel.+Derivatization+of+unprotected+polynucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Le Orgel. Derivatization of unprotected polynucleotides.</a> Nucleic Acids Res. 11 (18), 6513-6529 (1983).</li>
<li>Qin, P. Z., Pyle, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+labeling+of+RNA+with+fluorophores+and+other+structural+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Site-specific labeling of RNA with fluorophores and other structural probes.</a> Methods. 18 (1), 60-70 (1999).</li>
<li>Whitfeld, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+the+determination+of+nucleotide+sequence+in+polyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A method for the determination of nucleotide sequence in polyribonucleotides.</a> Biochem J. 58 (3), 390-396 (1954).</li>
<li>Zamecnik, P. C., Stephenson, M. L., Scott, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+soluble+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Partial purification of soluble RNA.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 46 (6), 811-822 (1960).</li>
<li>Proudnikov, D., Mirzabekov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+methods+of+DNA+and+RNA+fluorescent+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical methods of DNA and RNA fluorescent labeling.</a> Nucleic Acids Res. 24 (22), 4535-4542 (1996).</li>
<li>Wang, P. Y., Sexton, A. N., Culligan, W. J., Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Carbodiimide+reagents+for+the+chemical+probing+of+RNA+structure+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Carbodiimide reagents for the chemical probing of RNA structure in cells.</a> RNA. 25 (1), 135-146 (2019).</li>
<li>Mitchell, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+RNA+structural+probing+of+uracil+and+guanine+base-pairing+by+1-ethyl-3-%283-dimethylaminopropyl%29carbodiimide+%28EDC%29%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">In vivo RNA structural probing of uracil and guanine base-pairing by 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC).</a> RNA. 25 (1), 147-157 (2019).</li>
<li>Rinaldi, A. J., Suddala, K. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+purification+and+labeling+of+RNA+for+single+molecule+fluorescence+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Native purification and labeling of RNA for single molecule fluorescence studies.</a> Methods Mol Biol. 1240, 63-95 (2015).</li>
<li>Liu, T., Patel, S., Pyle, A. M. Making RNA: Using T7 RNA polymerase to produce high yields of RNA from DNA templates. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiu%2C+T+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Academic Press. (2023).</li>
<li>Leamy, K. A., Assmann, S. M., Mathews, D. H., Bevilacqua, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bridging+the+gap+between+in+vitro+and+in+vivo+RNA+folding%5BTitle%5D)+AND+%22Q+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">Bridging the gap between in vitro and in vivo RNA folding.</a> Q Rev Biophys. 49, e10(2016).</li>
<li>Fiorini, E., Börner, R., Sigel, R. K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+in+vivo+Environment--The+Effect+of+Crowding+on+RNA+and+Biomacromolecular+Folding+and+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22Chimia%22%5BJournal%5D)">Mimicking the in vivo Environment--The Effect of Crowding on RNA and Biomacromolecular Folding and Activity.</a> Chimia. 69 (4), 207-212 (2015).</li>
<li>Peng, H., Lelievre, A., Landenfeld, K., Müller, S., Chen, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+encapsulation+stabilizes+intermolecular+association+and+structure+formation+of+functional+RNA+and+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Vesicle encapsulation stabilizes intermolecular association and structure formation of functional RNA and DNA.</a> Curr Biol. 32 (1), 86-96.e6 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><güçlü >RNA etiketleme< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1.5 & mL DNA LoBind tüpleri&nbsp;</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td></td><td></td>30108035</tr><tr><td>1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid hidroklorür (EDC-HCl veya EDC)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>11844071</td><td>Pierce EDC, tartımsız format. Mağaza&nbsp; -20 derece & derece; C</td></tr><tr><td>3-morfolinopropan-1-sülfonik asit (MOPS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, moleküler biyoloji için, > %99,5 (titrasyon)</td></tr><tr><td>Asetik asit (buzul)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00063</td><td>%100, analiz için susuz EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Santrifüj filtrasyon ünitesi&nbsp;</td><td>Sartorius</td><td>VS0132</td><td>Vivaspin 500, MWCO 50.000, PES, 500 & L</td></tr><tr><td>Siyanin5 hidrazid (Cy5-hidrazid)</td><td>Lumiprobe</td><td>23070</td><td>5 mg, CAS numarası 1427705-31-4&nbsp;</td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit (DMSO)</td><td>New England Biolabs</td><td>12611P</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>20821.296P</td><td>Mutlak &ge; Moleküler biyoloji için %99,8</td></tr> <tr><td>Gliserol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>, &ge; % 99.0</td></tr> <tr><td>Hidroklorik asit (HCl)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00317</td>% <td>dumanlı% 37, analiz için EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td> N-hidroksisüksinimid (NHS)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>130672</td><td>% 98</td></tr> <tr><td>Sodyum asetat (NaOAc) &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8750</td><td>susuz, ReagentPlus, & ge; % 99,0</td></tr> <tr><td>Sodyum meta-periodat (NaIO< alt > 4< / alt >)</td> <td>Thermo Fisher Scientific, Yaşam Teknolojileri</td><td>20504</td><td>Pierce ürün grubu</td></tr><tr><td>Sülfo-Siyanin3 amin (sCy3-amin)</td> <td>Lumiprobe</td><td>213C0</td><td>5 mg, CAS numarası 2183440-43-7</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan (Tris)</td> <td>Biosolve</td><td>200923</td><td>Moleküler biyoloji sınıfı</td></tr><tr><td><güçlü > Oda hazırlığı</ güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) &nbsp;</td><td>Analiz için Sigma-Aldrich</td><td>440140</td><td>%99</td></tr> <tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00014</td><td>EMSURE ACS,ISO,Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Biotin-Polietilen glikol-Süksinimidil valerat (biotin-PEG-SVA, bPEG) ve Metoksi polietilen glikol-Süksinimidil valerat (mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio, Inc.</td><td></td><td>BIO-PEG-SVA, MW 5,000 ve MPEG-SVA, MW 5,000 - Combo Kit</td></tr><tr><td>Lameller</td><td>Carl Roth</td><td>H876.2</td><td>24 x 24 mm, 0.13-0.16&nbsp; mm kalınlık</td></tr><tr><td>Deconex 11 üniversal</td><td>Borer Chemie AG</td><td>17416492</td><td>Laboratuvar cam eşya temizleme solüsyonu</td></tr><tr><td>Elmas kaplı karot matkap ucu</td><td>Crystalite corporation</td><td></td><td>1 mm kalınlık</td></tr><tr><td>Elmas delici</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR Kimyasalları</td><td>20821.296P</td><td>Mutlak & ge; %99,8</td></tr> <tr>kapaklı <td></td><td></td><td></td><td>cam Coplin boyama kavanozu</td></tr><tr><td>Görüntüleme ara parçası</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>654008</td><td>SecureSeal, 8 kuyu,&nbsp; 9&nbsp; mm ve kez; 0.12&nbsp; mm</td></tr><tr><td>Oksijen plazma temizleyici</td><td>Zepto One</td><td></td><td>Diener</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>moleküler biyoloji için, > %99,0</td></tr> <tr><td>Kuvars slaytlar</td><td>G. Finkenbeiner, Inc.</td><td></td><td>7.5&nbşk; x&nbsp; 2.5&nbsp; cm, 1 mm kalınlığında</td></tr><tr><td>Sodyum bikarbonat (NaHCO3)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>BioXtra, %99,5-100,5</td></tr><tr><td><güçlü>Lipid kek hazırlama</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>16:0 Biotinyl Cap PE, bPE (1,2-dipalmitoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin-N- (kap biyotinil) (sodyum tuzu), C53H98N4O11PNaS)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>870277P</td><td>-20'de 1 yıl kararlı &deg; C</td></tr><tr><td>14: 0 PC, DMPC (1,2-ditetradekanoil-sn-glisero-3-fosfokolin veya 1,2-dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin, C < alt > 36 < / alt >H < > altı < / alt > NO < alt >8 < / alt >P)</td> <td>Avanti Polar Lipidler</td><td>850345P</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL mikrosantrifüj tüpleri, Safe-Lock</td><td>Eppendorf</td><td>0030120094</td><td>500 nbsp'yi sterilize etmek için otoklav</td></tr><tr><td>; Analiz için mL Schlenk şişesi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kloroform</td><td>Merck</td><td>1.02445</td><td>EMSURE ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><güçlü>Kapsülleme yoluyla yüzey immobilizasyonu</güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)-6-Hidroksi-2,5,7,8-tetrametilroman-2-karboksilik asit (Trolox&reg;)</td><td>Thermo Fischer</td><td>53188-07-1</td><td>%</td>97-3-morfolinopropan-1-sülfonik</tr> <tr><td>asit (MOPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69947</td><td>BioUltra, moleküler biyoloji için, > % 99,5 (titrasyon). +4 & derece'de saklayın; Karanlıkta C.</td></tr><tr><td>Yapışkanlı conta tırnakları</td><td>Grace Bio-Labs&nbsp;</td><td>629200</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-05-2, sığır karaciğerinden C30</td><td>, sulu süspansiyon, 10.000-40.000 birim / mg protein</td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td> <td>& ge; %99,5 (GC), BioXtra</td></tr><tr><td>Ekstruder polikarbonat (PC) membran</td><td>Avanti Polar Lipidler</td><td>610005-1EA</td><td>0.1 &; m, 19 mm</td></tr><tr><td>ısıtma bloklu ekstruder seti</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Glikoz oksidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9001-37-0</td><td>Aspergillus niger, Tip VII,&nbsp; liyofilize toz, & ge; 100.000 birim/g katı (oksijen eklenmemiş)</td></tr><tr><td>Magnezyum klorür (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3, moleküler biyoloji için M1028</td><td>, 1,00 M &plusmn; 0,01 M çözelti</td></tr><tr><td>Polyester (PE) drenaj diski, membran</td><td>Whatman, Cytiva</td><td>230300</td><td>10 mm</td></tr><tr><td>Potasyum klorür (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60128</td><td>BioUltra, moleküler biyoloji için, & ge; Moleküler biyoloji için %99,5 (AT)</td></tr> <tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>, & % 99,0</td></tr> <tr><td>Streptavidin</td><td>Termo Fischer</td><td>434301</td><td></td></tr></tbody></table>

tek moleküllü fret-tirf mikroskobu için uzun rna'ların floresan uç etiketlemesi ve kapsüllenmesi

Fluorescent End-Labeling and Encapsulation of Long RNAs for Single-Molecule FRET-TIRF Microscopy

İlgilenilen 915-nt RNA'nın, maya mitokondriyal Sc.ai5γ grup II intronun, ekzonik dizilerle çevrili, bölgeye özgü tek ve çift floresan etiketlemesini sunuyoruz. FRET florofor çifti, 5'-fosfatın EDC/NHS aktivasyonu ve 3'-ribozun periyodat oksidasyonu ve ardından ilgili boya ekleri yoluyla RNA uçlarına yerleştirilir. Daha sonra RNA-boya konjugatlarını Şekil 4A'da gösterildiği gibi floresan jel elektroforezi ile doğruladık. RNA ve floroforların agaroz jeli üzerindeki birlikte göçü, başarılı etiketlemeyi doğrular. Daha sonra, Şekil 4B'de gösterildiği gibi, çift etiketli grup II intronunu karakterize etmek için topluluk floresan spektroskopisi kullanıldı. Enerji transferi, yani FRET, RNA'nın ikili etiketlemesini kanıtlayan donör boyanın uyarılması üzerine gözlendi. Özellikle, FRET'in mesafeye bağlı doğası ile tutarlı olarak, metal iyonlarının varlığında grup II intron RNA'nın katlanması, donör emisyonundaki azalma (yeşil ok) ve alıcı (kırmızı ok) emisyonunda karşılık gelen bir artış ile kanıtlandığı gibi FRET verimliliğinde bir artışa yol açmıştır. Bu, bu FRET etiketlemesinin ribozimin konformasyonel değişikliklerini izlediğini gösterir.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig04.jpg"> 
Şekil 4: RNA-boya konjugatlarının karakterizasyonu. (A) Tek ve çift floresan etiketli RNA'nın analitik jel bazlı analizi, boyaların %2'lik bir agaroz jel üzerinde RNA ile birlikte göçünü gösterir. Çift etiketli numunedeki floroforların birlikte lokalizasyonu, sırasıyla 532 nm ve 635 nm aydınlatma altında görselleştirilen Cy3 (üst, yeşil) ve Cy5 (orta, kırmızı) kanallarının birleştirilmiş görüntüsündeki (alt) sarı bant ile gösterilir. Şerit 1: 5'-sCy3 yalnızca RNA olarak etiketlendi, şerit 2: 3'-Cy5 yalnızca RNA olarak etiketlendi ve şerit 3: çift uçlu (5'-sCy3 ve 3'-Cy5) etiketli RNA. (B) Topluluk floresan spektroskopisi çift etiketlemeyi doğrular. Donör uyarması üzerine enerji transferi (λex = 515 nm, λem = 670 nm), her iki boyanın da RNA'ya başarılı bir şekilde bağlandığını doğrular. Gri eğri, katalitik öncesi RNA'nın emisyon profilini temsil ederken, siyah eğri, katlanmış grup II intron RNA'sında (3 dakika boyunca 70 ° C'de 500 mM KCl ile inkübe edilir, 5 dakika boyunca 42 ° C'ye soğutulur, ardından 100 mM MgCl2 ilavesi). Bu rakam Ahunbay ve ark.3 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Elimizdeki floresan çift etiketli vahşi tip grup II intron ile, şimdi dinamiklerini tek molekül düzeyinde keşfetmek için konumlandık. Fosfolipid veziküller içinde kapsüllendikten sonra, etiketli RNA, smFRET-TIRF için tek molekül çözünürlüğü elde etmek için çok düşük yüzey yoğunluklarında bir mikroskopi yüzeyi üzerinde hareketsiz hale getirilir. Şekil 5A'da görüldüğü gibi, birkaç ayrı molekül aynı anda izlenebilir. TIRF mikroskobu, FRET verimliliğinin ve zaman içindeki değişimlerinin gerçek zamanlı olarak izlenmesini sağlar. Şekil 5B , etiketli ve kapsüllenmiş RNA'nın statik ve dinamik tek moleküllü FRET izlerini örneklemektedir. Tipik bir dinamik iz, FRET verimliliğini dalgalandıran verici ve alıcı sinyaller arasında antikorelasyon sergiler. Donör uyarması üzerine alıcı emisyonu arttığında, donör emisyonu buna bağlı olarak azalır ve bu da boyalar arası mesafede dinamik bir değişikliği gösterir. Bu antikorelasyon, RNA molekülündeki konformasyonel değişiklikleri önerir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67391/67391fig05.jpg"> 
Şekil 5: smFRET ile ortaya konan grup II intron RNA'nın oldukça dinamik davranışı. Çift uçlu etiketli grup II intron RNA, bir fosfolipid vezikül içinde kapsüllenir ve objektif tabanlı bir TIRF mikroskobu ile görüntüleme için yüzeyde hareketsiz hale getirilir. (A) 532 nm uyarılma üzerine donör emisyonu (sCy3, yeşil) ve alıcı emisyonu (Cy5, kırmızı) sergileyen bireysel etiketli RNA moleküllerinin birleştirilmiş görüntüsü. (B) (Solda) verici ve alıcı yoğunluklarının zaman içinde dalgalanmadığı statik bir RNA molekülünün ve (sağda) verici ve alıcı yoğunluklarının antikorreli olduğu dinamik bir RNA molekülünün tipik smFRET yörüngeleri, FRET verimlilikleri sarı renktedir. Tek moleküller MASH-FRET17 kullanılarak lokalize edilir ve analiz edilir. Doğrudan uyarma, kanama ve γ faktörlü düzeltmeler uygulanır. Kısaltmalar: smFRET = tek moleküllü Förster Rezonans Enerji Transferi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67391/67391fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) excels in studying dynamic biomolecules by allowing precise observation of their ...

fluorescent-end-labeling-encapsulation-long-rnas-for-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Bu yazıda, nasıl bir otomatik tarama konfokal mikroskop kullanılarak bir yüzeye immobilize bireysel DNA molekülleri izleri FRET elde açıklar.

Yüzey immobilize Biyomoleküller Tek Molekül Floresans Ölçümler için Otomatik Sistem

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

Biyomoleküllerin in vivo çalışmaları, biyolojik bağlamda moleküler işlevi anlamak için çok önemlidir. Burada, DNA veya proteinler gibi floresan biyomoleküllerin canlı mikroorganizmalara içselleştirilmesine izin veren yeni bir yöntemi açıklıyoruz. Floresan mikroskobu ile kaydedilen in vivo verilerin analizi de sunulmakta ve tartışılmaktadır.

Elektroporasyon yoluyla Yaşam Mikroorganizmalar içinde içselleştirilmesi ve Floresan biyomoleküllerin Gözlem

Bu el yazması ile DNA probları fluorescently etiketli tek molekül Floresans in situ hibridizasyon (smFISH) E. colideneylerde kullanmak için bireysel mesajcı RNA (mRNA) Tutanaklar etiketleme yöntemi açıklar. smFISH eş zamanlı algılama, Yerelleştirme ve miktar tek mRNA molekülleri sabit tek tek hücreleri içinde izin veren bir görselleştirme yöntemidir.

Transkript bireysel Escherichia coli hücrelerdeki tek molekül Floresans In Situ hibridizasyon deneyleri için etiketleme yöntemi

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Burada geleneksel epi-floresan görüntüleme, tek molekül algılama tabanlı süper kararlılık düşsel ve çok renkli tek molekül algılama birleştiren, bir tümleşik mikroskobu sistem inşaat pratik bir rehber mevcut de dahil olmak üzere tek molekül floresans rezonans enerji görüntüleme, maliyet-etkin bir şekilde bir set-up içine aktarın.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Tek moleküllü floresan enerji transferi ribozomal protein sentezi sırasında tRNA dinamiklerini izleyen bir yöntemdir. Bireysel ribozomları izleyerek, mekanizmalara ışık tutan inhomogeneöz popülasyonlar tanımlanır. Bu yöntem, diğer birçok karmaşık biyosistemdeki dinamik işlev ilişkilerini ortaya çıkarmak için genel olarak biyolojik konformasyon değişikliklerini izlemek için kullanılabilir. Tek molekül yöntemleri, ortalama etki nedeniyle geleneksel topluluk yöntemleriyle erişilemeyen oransız...

Ribozom Protein Sentezinin Tek Molekül floresan Enerji Transferi Çalışması

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Dinamin süper aile proteinlerinin işlevleri, GTP hidrolizi ile birleşen konformasyonel değişikliklere bağlıdır. Farklı nükleotid yükleme durumlarında dinnamin benzeri GTPaz atlastininin konformasyonel dinamiklerini izlemek için tek moleküllü FRET (smFRET) tekniği kullanılarak bir sistem tanımlanmıştır.

Dinamin Benzeri GTPaz Atlastininin Konformasyonel Dinamiklerini Gözlemlemek için Tek Moleküllü FRET Görüntüleme

Bu protokolün amacı, in vitro, canlı memeli hücrelerinde ve üç boyutlu hücresel modellerde tekrarlanabilir RNA görüntüleme iş akışları için Riboglow problarının nicel floresans ömür ölçümünü sağlamaktır. Tarafsız floresan ömür ölçümlerini çıkarmak için örnek hazırlama, prob teslimatı, veri toplama ve nicel analiz iş akışlarını özetliyoruz.

Riboglow Problarının In Vitro Olarak Canlı Memeli Hücrelerinde Floresans Ömür Boyu Görüntülemenin Temeli Olarak Karakterize Edilmesi ve Üç Boyutlu Hücresel Modeller

Öğrenin, tek moleküllü FRET-TIRF mikroskobisi için uzun RNA'ların çift renkli uç etiketlemesi ve fosfolipid veziküllerde kapsüllenmesi yöntemini. Bu protokol, RNA katlanma dinamiklerinin gerçek zamanlı izlenmesini sağlar.

Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Daha fazla video keşfet