Tek Moleküllü FRET-TIRF Mikroskobu için Uzun RNA'ların Floresan Uç Etiketlemesi ve Kapsüllenmesi

Araştırmamız, katalitik aktif RNA'ların dinamiklerine ve bu dinamiklerin farklı çevresel koşullar altında nasıl değiştiğine odaklanmaktadır. Tek değerlikli ve iki değerlikli orta hatlar, şaperon proteinleri ve kalabalık ajanlar gibi faktörlerin RNA dinamikleri üzerindeki etkisini incelemek için tek moleküllü FRET kullanıyoruz. RNA yapısını ve işlevini bozmadan verici ve alıcı floroforları hassas bir şekilde birleştirmek zordur.

Ek olarak, büyük bir dinamik RNA'nın katlanmasını izlemek zordur. Bununla birlikte, yerleşik etiketleme ve kapsülleme protokolü, fonksiyonel RNA'nın zaman içindeki katlanma dinamiklerini izlememize izin verir. Protokolümüz, büyük, katalitik olarak aktif RNA'ları gerçek zamanlı olarak ve neofizyolojik koşullar altında gözlemlemenin zorluğunu ele almaktadır.

Daha sonra yüzey hareketsiz hale getirilen RNA ve vezikülleri kovalent olarak etiketleyerek ve kapsülleyerek, RNA fonksiyonunu tek Moleküllü TIRF ile izleyebiliriz. Uzun katalitik RNA'ların ve özellikle grup II intronların kovalent FRET etiketlemesine odaklanıyoruz. Bu, yapısal karmaşıklıkları nedeniyle bir zorluktur.

Veziküller içinde kapsüllendiğinde, RNA'yı TIRF mikroskobu için buharlaşan alan içinde tutabiliriz ve yine de RNA serbestçe yüzebilir. Bu şekilde smFRET, RNA'nın dinamik davranışını herhangi bir engel olmadan ortaya çıkarabilir. Çok teknikli bir yaklaşım kullanarak ribozomların, riboswitchlerin ve diğer düzenleyici RNA'ların yapı-işlev ilişkisine ve dinamiklerine odaklanarak doğanın gerçekte nasıl çalıştığını anlamaya çalışmaya devam edeceğiz.

Bu nedenle, fizyolojik ve hücresel koşullar altında araştırmalara doğru ilerlemek, gelecekteki çalışmalarımızın önemli bir vurgusu olacaktır. Başlamak için, 55 mikrolitre çift damıtılmış suda tüp başına 50 ila 75 mikrogram RNA'ya sahip olan ilgili RNA'yı çıkarın, ardından RNA'ya 45 mikrolitre EDC/NHS sodyum asetat pH 6 karışımı ekleyin. Karışımı 500 RPM'de çalkalarken 25 santigrat derecede dört saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, aktive edilmiş RNA peletini 95 mikrolitre 100 milimolar MOPS tamponu pH 7.5'te yeniden süspanse edin. Daha sonra aktive edilmiş RNA'ya beş mikrolitre iki milimolar sülfonatlı siyanin-3 amin ekleyin ve floroforu aktive edilmiş 5-prime fosfata bağlamak için 500 RPM'de 16 saat boyunca 25 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, ayırmayı iyileştirmek için 200 mikrolitre çift damıtılmış su ekleyin.

Daha sonra 5 asal fosfat etiketli RNA'yı etanol çökeltme ile saflaştırın. Saflaştırmadan sonra, etiketli RNA'yı 100 mikrolitre 100 milimolar tris HCl'de yeniden süspanse edin ve 25 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Daha sonra serbest boyaları çıkarmak için, etiketli RNA'yı santrifüjlü filtrasyon ile çift damıtılmış suda yıkayın.

Çift uçlu etiketleme için, 90 mikrolitre çözeltide tüp başına yaklaşık 50 ila 75 mikrogram RNA'ya sahip olan 5 asal uç etiketli RNA'yı alikot edin. Beş mikrolitre bir molar sodyum asetat tamponu pH 5.5 ekleyin. Daha sonra dört mikrolitre taze hazırlanmış 500 milimolar sodyum metaperiodat stok çözeltisi ekleyin.

3 ana uçlu tek etiketleme için sekiz mikrolitre metaperiodat stok çözeltisi ekleyin. Çözeltileri karanlıkta iki saat inkübe ettikten sonra, reaksiyonu durdurmak için 30 mikrolitre% 50 gliserol pipetleyin. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, 400 mikrolitre buz gibi soğuk etanol sodyum asetat çökeltme karışımı ekleyin.

Oksitlenmiş RNA peletini 95 mikrolitre 50 milimolar sodyum asetat tamponu pH altı içinde yeniden süspanse edin. Çift uç etiketli RNA'yı, daha önce gösterildiği gibi etanol çökeltme ve santrifüj filtrasyonu ile saflaştırın. Saflaştırılmış RNA'yı çift damıtılmış suda elute edin.

Her adımdan sonra elde edilen süpernatan ve pelet renklerini görsel olarak karşılaştırın. UV görünür bir spektrofotometrede RNA ve konjuge boya konsantrasyonlarını hesaplayın. Floresan jel elektroforezi, RNA'nın floroforlarla birlikte göç etmesiyle gösterildiği gibi, RNA'nın başarılı tek ve çift etiketlemesini doğruladı.

FRET verimliliği, RNA katlanmasını gösteren metal iyonlarının varlığında artmıştır, bu da donör emisyonunda bir azalmaya ve alıcı emisyonunda bir artışa yol açmıştır. Mikroakışkan bir oda hazırlamak için, iki kanal oluşturmak üzere kuvars kızaklarında dört delik açmak için bir elmas delici kullanın. Delinmiş kuvars slaytları ve yaklaşık iki kat daha fazla lameli bir kapaklı cam Coplin boyama kavanozuna yerleştirin.

Slaytları ve lamelleri beş dakika boyunca çift damıtılmış suda sonikleştirin. Daha sonra, kavanozu 50 santigrat derecede 30 dakika boyunca% 10'luk bir laboratuvar cam eşya temizleme solüsyonunda sonikleştirin. Kavanozu çift damıtılmış su ile duruladıktan sonra, bir molar potasyum hidroksit çözeltisinde 30 dakika sonikat yapın ve gece boyunca çözelti içinde bırakın.

Damıtılmış su ile tekrarlanan durulama ve sonikasyondan sonra, nitrojen gazı akışı kullanarak slaytları ve lameller kurutun. Kurumuş slaytları ve lamellere 30 dakika boyunca bir oksijen plazma temizleyici uygulayın. Temiz slaytları ve lamelleri% 3 AP testi etanol çözeltisi içeren bir Coplin boyama kavanozuna yerleştirin, bir dakika boyunca Sonicate ve ardından 30 dakika inkübe edin.

Slaytları ve lamelleri her biri mutlak etanol ve çift damıtılmış su ile üç kez durulayın, ardından nitrojen gazı akışı altında kurutun. Ardından, boş bir pipet ucu kutusunu yarıya kadar çift damıtılmış su ile doldurarak nemli bir kutu hazırlayın. Slaytları, tedavi edilecek tarafı yukarı bakacak şekilde kutunun içine yerleştirin.

Her iki kanalı da kaplayacak şekilde sürgünün ortasına 30 mikrolitrelik taze hazırlanmış bPEG/mPEG karışımı damlacıkları ekleyin. Damlacığı temiz bir lamel ile örtün ve nemli kutuyu kapatın. PEGilasyon için kutuyu gece boyunca karanlıkta inkübe edin.

Ertesi gün, PEG ile pasifleştirilmiş ve biyotinile edilmiş slaytları ve lameller çift damıtılmış su ile durulayın ve işlenmiş yüzeylerin hidrofobikliğindeki değişimi gözlemleyin. Çift taraflı çıkartmayı slayta yapıştırın ve çıkartmanın ilgilenilen alanı kapladığından emin olun. Ardından, PEGile yüzeyleri birbirine bakacak şekilde hizalayarak lameli dikkatlice sürgünün üzerine yerleştirin.

Monte edilmiş hazneyi 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpü nitrojen gazı ile doldurun. Başlamak için, steril temiz iki mililitrelik bir tüpün kapağında içten dışa bir delik açmak için steril bir iğne kullanın. Tüpe 109 mikrolitre bPE-DMPC karışımı ekleyin.

Tüp tutucu görevi görmesi için bir mikrotüp saklama kutusundan 500 mililitrelik bir Schlenk şişesine bir karton hücre bölme eki yerleştirin. Uzun cımbız kullanarak, lipit karışımını içeren tüpleri dikkatlice tüp tutucusuna yerleştirin. Kloroformu gece boyunca düşük nitrojen gazı akışı altında buharlaştırın.

Kurutulmuş lipit tabakasını elde ettikten sonra, delikleri kapatmak için tüpleri parafilm ile kapatın. Ekstrüderi 100 nanometre polikarbonat membran ve 10 milimetre polyester drenaj diski kullanarak monte edin. Şırıngayı ve zarları yanıp sönme önleyici tampon ile dengeleyin.

Çift uç etiketli RNA'yı yanıp sönme önleyici tamponla karıştırdıktan sonra, lipit kekini RNA yanıp sönme önleyici tampon karışımı ile 30 santigrat derecede nemlendirin. 1.400 RPM'de beş dakika, ardından 700 RPM'de 15 dakika çalkalayın. Karışımı 13.000 G'de iki dakika santrifüjleyin ve süpernatanı 250 mikrolitre yanıp sönme önleyici tampon ile seyreltin.

Şırıngayı RNA lipid süspansiyonu ile doldurun ve çift uçlu etiketli RNA'yı 100 nanometre çapındaki fosfolipid veziküllerde kapsüllemek için bir ısıtma bloğu üzerinde 30 santigrat derecede 35 kez ekstrüde edin. Hazneyi oda sıcaklığında 200 mikrolitre 5X standart tamponla iki kez yıkayın. Hazneyi mililitre streptavidin çözeltisi başına 50 mikrolitre 20 mikrolitre ile doldurun ve beş dakika inkübe edin.

Ardından hazneyi 200 mikrolitre standart tampon ve 100 mikrolitre yanıp sönme önleyici tampon ile yıkayın. 75 mikrolitre vezikül süspansiyonu ekleyin ve kapsüllenmiş RNA'nın yüzeyde hareketsiz hale getirilmesi için 10 dakika inkübe edin. İmmobilizasyondan sonra, hazneyi 200 mikrolitre yeni hazırlanmış görüntüleme tamponu ile yıkayın.

Veri toplama için, odayı TIRF mikroskobuna monte edin ve alternatif lazer uyarımı ile smFRET verilerini alın. TIRF mikroskobu kullanılarak yapılan tek moleküllü FRET görüntüleme, tek tek RNA moleküllerini izledi ve FRET verimliliğindeki gerçek zamanlı değişiklikleri tespit etti. Dinamik Tek Molekül izleri, verici ve alıcı sinyaller arasında anti-korelasyon dalgalanmaları gösterdi ve bu da RNA'daki doğrulayıcı değişiklikleri gösterdi.