Manuka balı ile tedavi edilen yaraya neden olan bakterilerde canlı ancak kültürlenemeyen hücreleri ölçmek için canlı/ölü boyama

Bu araştırma projesi, Manuka balının bakteri fizyolojisi üzerindeki etkisini araştırmayı amaçlamaktadır. Son çalışmalar, Manuka balının bakteri fizyolojisi üzerindeki anti-mikrobiyal etkileri hakkında daha fazla bilgi sağlamıştır. Ön bulgularımız, Manuka balı bakterilerinin antibiyotiğe dirençli, canlı ancak kültürlenemeyen uyku hali durumuna girdiğini, ancak geleneksel antibiyotiklerle tedavi edilenlerden daha az ölçüde olduğunu göstermektedir.

Deneylerimize dayanarak, Manuka balı ve geleneksel antibiyotik kaynaklı VBNC'lerin ekspresyon profillerini karşılaştırmak ilginç olacaktır. Başlamak için, donmuş bakteri suşları içeren şişeleri alın. Her birini sırayla açın ve az miktarda donmuş bakteriyi uygun şekilde etiketlenmiş Luria-Bertani veya LB agar plakasına kazımak için steril bir çubuk kullanın.

Flakon kapağını değiştirin ve hızlı bir şekilde dondurucuya yerleştirin. Bakteri kültürlerini 37 santigrat derecede 18 ila 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, iki mililitre LB suyunu iki steril test tüpüne aktarmak için serolojik bir pipet kullanın.

Aşılama halkasını Bunsen brülör alevinde sterilize edin. Daha sonra, LB agar plakasından çeyrek halka dolusu bakteriyi LB suyu içeren uygun şekilde etiketlenmiş test tüpüne aktarın. Test tüpünü aerobik koşullar altında, 18 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede yaklaşık 250 RPM'de çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin.

Manuka balı ve bakterilerin antibiyotik tedavilerinin kurulumu için, mililitre başına yaklaşık 10 ila altıncı koloni oluşturan birimlere sahip olan bakteri kültürünün 1: 1.000 seyreltmesini elde etmek için 10 mililitre Mueller Hinton suyuna 10 mikrolitre bakteri kültürü ekleyin. Her bakteri türü için üç numune, işlenmemiş bir kontrol, bir Manuka balı ile muamele edilmiş numune ve bir antibiyotikle muamele edilmiş numune hazırlamak için seyreltilmiş kültürleri kullanın. Manuka balı ve antibiyotiği uygun tüplere ekleyin.

İşlenmemiş numunenin 0,1 mililitre ve 0,5 mililitresini canlı plaka sayımı için steril mikro santrifüj tüplerine aktarın ve T için canlı/ölü boyama sıfır numuneye eşittir. Daha sonra, işlenmemiş kontrolü, Manuka balı ile muamele edilmiş ve antibiyotikle muamele edilmiş numuneleri, aerobik koşullar altında 37 santigrat derecede, 250 RPM'de 24 saat boyunca çalkalanan bir inkübatörde inkübe edin. Canlı plaka sayımı için sayılabilir sayıda hücre elde etmek için LB suyunda T'nin on kat seri seyreltmesi sıfır işlenmemiş numuneye eşittir.

Her seyreltilmiş numuneden 50 mikrolitreyi bir LB agar plakasının yarısına yayın. Agar plakalarını aerobik koşullar altında 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Ertesi gün, LB agar plakalarını inkübatörden çıkarın.

Yaklaşık 25 ila 150 koloni içeren seyreltme plakasını tanımlayın ve tam koloni sayısını sayın. Mililitre başına kültürlenebilir hücre sayısını belirlemek için koloni oluşturan birim formülünü kullanın. Üçüncü günde, 0,5 mililitre T'ye 0,5 mililitre %0,85 sodyum klorür ekleyin, işlenmemiş sıfır canlı/ölü boyama kontrol numunesine eşittir.

Numune başına 1,5 mikrolitre SYTO 9 ve 1,5 mikrolitre propidyum iyodürü birleştirin. Daha sonra her numuneye üç mikrolitre karışım ekleyin. Numuneleri karanlıkta 21 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Lekeli, hafifçe karıştırılmış numunenin altı mikrolitresini tek kullanımlık bir hemositometreye aktarın ve bir floresein izotiyosiyanat veya FITC filtresi ve bir 40X objektif lens kullanarak bir floresan mikroskop altında görüntüleyin. Hem hemositometre ızgara çizgilerini hem de yeşil hücreleri gösteren bir görüntü yakalayın. Hacim başına yeşil hücre sayısını hesaplamak için ızgara boyutlarına dikkat ederek örnek başına altı alandaki yeşil hücreleri sayın.

Son olarak, canlı/ölü boyama kullanılarak elde edilen mililitre başına canlı hücre sayısından canlı plaka sayısı kullanılarak elde edilen mililitre başına kültürlenebilir hücre sayısını çıkararak canlı ancak kültürlenemeyen hücrelerin sayısını hesaplayın. Dördüncü günde, işlenmemiş, Manuka balı ile muamele edilmiş ve antibiyotikle muamele edilmiş bakteri kültürlerini inkübatörden çıkardıktan sonra, canlı plaka sayısı ve canlı / ölü boyama için her numuneden 0.1 mililitre ve 0.5 mililitre mikro santrifüj tüplerine toplayın. Bu şekil, S.aureus ve P.aeruginosa kültürleri için canlı plaka sayısı ve canlı/ölü boyama kullanılarak belirlenen kültürlenebilir ve canlı hücre sayısını göstermektedir.

Sonuçlar, işlenmemiş ve Manuka balı ile muamele edilmiş kültürlerde tespit edilen canlı ve kültürlenebilir hücrelerin sayısının önemli ölçüde farklı olmadığını göstermektedir. Tobramisin ile tedavi edilen S.aureus kültürleri, canlı hücrelerden daha az kültürlenebilir hücreye sahipti, ancak bu fark önemli değildi. Sadece meropenem ile tedavi edilen P.aeruginosa, canlı hücrelere kıyasla kültürlenebilir hücrelerde istatistiksel olarak anlamlı bir azalma gösterdi.