Name: Hibrit sferoidlerin üretilmesi için optik cımbız kullanma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 11 s
Description: Öğrenin, optik cımbız kullanarak hibrit lenfoma sferoidleri üretme yöntemini. Bu teknik, hücre-hücre etkileşimlerini tek hücre düzeyinde incelemek ve 3D hücre kültürü uygulamaları için yeni olanaklar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Agaroz jel bazlı mikro kalıpların imalatı
NOT: Tüm hücre kültürlerini işlerken uygun aseptik teknikler gereklidir. Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Şekil 1A'da gösterildiği gibi tek bir deney için MSC'lerle üç jel hazırlayın.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig01.jpg"> 
Şekil 1: Mezenkimal stromal hücreli (MSC) sferoidlerin hazırlanması. (A) Agaroz mikro kalıplarının hazırlanması adımını gösteren resim. (B) Mezenkimal stromal hücrelerin (MSC'ler) tohumlanması ve mezenkimal sferoidlerin yetiştirilmesi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol>
	<li>Agaroz mikro kalıplarını hazırlayarak başlayın. Mikro kalıp 3D Petri Kabını (Malzeme Tablosuna bakın) deiyonize su (3x) ile durulayın ve sterilizasyonu gerçekleştirmek için 30 dakika UV lambasının altına yerleştirin.</li>
	<li>İlk olarak% 2 agaroz çözeltisi hazırlayın. 1 g yüksek kaliteli saf steril agaroz tozu ölçün (Malzeme Tablosuna bakınız) ve steril 50 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin. Agaroza 50 mL steril% 0.9 sodyum klorür çözeltisi ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve iyice karıştırın. Konik borunun kapağını güvenli hale gelene ancak yine de gevşek olana kadar vidalayın.</li>
	<li>Agaroz tozunu kaynatmak ve tamamen çözmek için mikrodalga fırını kullanın. Her 10 saniyede bir mikrodalgayı durdurun ve agarozun çözünmesini sağlamak için konik tüpü dikkatlice döndürün. Agarozu karıştırırken veya pipetlerken kabarcık oluşturmaktan kaçının. Agarozu yaklaşık 70 °C'ye soğutun. NOT: Yarı saydam çözünmemiş toz kalıntısı olmadığından emin olun. DİKKAT: Erimiş agaroz aşırı sıcaktır ve ciddi cilt yanıklarına neden olabilir.</li>
	<li>Aseptik teknikler kullanarak laminer akış kabininde çalışın. Önceden sterilize edilmiş mikro kalıpları 500 μL agaroz ile doldurarak hidrojeller hazırlayın. Bir pipet kullanarak mikro kalıbın küçük özelliklerine sıkışmış olabilecek baloncukları aspire edin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 15 dakikalık inkübasyondan sonra, agaroz katılaştığında, jelleri mikro kalıplardan steril 6 oyuklu bir plakaya dikkatlice çıkarın. Jel yapısına zarar vermeyin. Bir sonraki adıma geçmeden önce mikroskop altında mikro kalıpların doğru hazırlanıp hazırlanmadığını kontrol edin ve kenarların sağlam olduğundan emin olun. Ortamın sızabileceği herhangi bir boşluk olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Sterilizasyon için plakayı 30 dakika boyunca bir UV lambasının altına yerleştirmeden önce mikro kalıpları tamamen kaplayacak kadar 1x Fosfat Tampon Salin (PBS) ekleyin. NOT: Agaroz mikro kalıpları, buzdolabı koşullarında (4 ° C) 1x PBS ile kaplı konik bir tüpte kullanımdan önce 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Sferoidler üretmek için mikro kalıpları kullanmadan önce, jeli RPMI ortamında (6 oyuklu bir plaka için 4.0 mL / kuyucuk) tamamen kaplayarak dengeleyin ve en az 15 dakika inkübe edin.</li>
</ol>
2. Mezenkimal stromal hücrelerin (MSC'ler) sferoidlerinin hazırlanması
<ol>
	<li>Bir insan mezenkimal stromal hücre hattı olan HS-5 hücre hattını (bkz . Malzeme Tablosu), ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin (bkz. Malzeme Tablosu) ile desteklenmiş RPMI 1640 kültür ortamında kültürleyin ve her 48 saatte bir ortamın değişmesini sağlayın.</li>
	<li>HS-5 hücreleri yaklaşık% 90 birleştiğinde, hücre geçişini aşağıdaki gibi gerçekleştirin:<ol>
		<li>Serolojik bir pipet kullanarak kültür ortamını çıkarın.</li>
		<li>1x PBS ekleyerek ve kalan ortamı çıkarmak için döndürerek ve aspire ederek hücreleri yıkayın.</li>
		<li>Hücre kültürü şişesine 2 mL tripsin-EDTA çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek ve hücre ayrılmasını kolaylaştırmak için 37 ° C'de inkübe ederek hücreleri kültür şişesinin altından ayırın.</li>
		<li>2 mL tam kültür ortamı ekleyerek tripsinizasyonu durdurun.</li>
		<li>5 mL'lik bir pipet kullanarak, hücreleri nazikçe askıya alın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>Hücre süspansiyonunu 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL taze kültür ortamında yeniden süspanse edin.</li>
		<li>10 μL hücre peletini alın ve 0.5 mL'lik bir tüpe aktarın. Ardından, 10 μL% 0.4 Tripan mavisi çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız) ve hücreleri otomatik hücre sayacında sayın (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
		<li>Yukarıda elde edilen hücre yoğunluğuna bağlı olarak, hücreleri 2 x 105 hücre / mL ortama seyreltin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hücre kültürü ortamını agaroz mikro kalıbından çıkarın.</li>
	<li>Yukarıda bahsedilen 190 μL hücre süspansiyonunu (adım 2.2.8) agaroz mikro kalıbının hücre tohumlama odasına dikkatlice tohumlayın. Tek bir kuyu yaklaşık 150 hücre (38.000 hücre/jel) içerecektir.</li>
	<li>Hücreleri, jelin dibine yerleşene kadar 30 dakika boyunca bir inkübatörde (% 5 CO2, 37 ° C, nemli atmosfer) agaroz mikro kalıpta inkübe edin. 30 dakika sonra, mikro kalıp içeren plakayı inkübatörden çıkarın ve jellerin dışına yavaşça ek bir ortam ekleyin, bunları tamamen kaplayın (örneğin, 6 oyuklu plaka için 4.0 mL / kuyucuk). NOT: Ortamı doğrudan jel agaroz mikro kalıbının üzerine değil, yeni şekillendirilmiş sferoidlere zarar vermekten kaçınarak kültür kabına ekleyin.</li>
	<li>Jeli, tek tip sferoidler oluşana kadar 72 saat boyunca% 5 CO2 içeren nemli bir atmosferde 37 ° C'de bir inkübatöre yerleştirin. (Şekil 1B). NOT: Takip eden 3 gün boyunca sferoid oluşumunun ters mikroskop altında gözlemlenmesi önerilir. Genel olarak, mezenkimal stromal hücreler 24 saat içinde sferoidler oluşturmaya başlar, ancak bu süreç farklı hücre geçişleri ve yoğunlukları ile daha hızlı veya daha yavaş olabilir. Agaroz mikroküf üzerinde 72 saatlik inkübasyondan sonra, mezenkimal stromal hücreler nispeten düzgün sferoidler oluşturur; Bununla birlikte, aynı koşullarda inkübe edilmelerine rağmen boyut ve şekil olarak değişebileceklerini belirtmekte fayda var. Ortamın mor-kırmızı renkten sarıya döndüğünde değiştirilmesi gerekir.</li>
</ol>
3. Lenfoma hücrelerinin kültürlenmesi ve optik tuzak için hazırlık
NOT: Lenfoma hücreleri de dahil olmak üzere hematolojik hücre hatları, kültür plakasına veya damarına herhangi bir bağlanma olmaksızın süspansiyon kültürü için tasarlanmış şişelerde kültür ortamında serbest yüzer şekilde büyür. Optimal hücre özelliklerini korumak için, optik cımbız kullanılarak hibrit sferoidleri birleştirme prosedüründen en geç 30 dakika önce numuneyi hazırlamaya başlanması önerilir. Daha da önemlisi, bu bölümde özetlenen protokol Ri-1 insan lenfoma hücre hattı içindir, ancak benzer bir protokol diğer hematolojik kanser hücre hatları için de geçerlidir.
<ol>
	<li>Ri-1 lenfoma hücre hattını (Malzeme Tablosuna bakınız) RPMI 1640 ortamında% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş kültürleyin.</li>
	<li>Lenfoma hücrelerini 37 °C ve %5CO2 ile nemlendirilmiş hava dahil olmak üzere standart kültür koşulları altında inkübatörde tutun. Logaritmik fazda kültürleri 3-5 x 105 hücre / mL arasında tutun ve her 2-3 günde bir geçirin.</li>
	<li>Hücreleri toplayın ve süspansiyonu 15 mL'lik bir polistiren tüpe aktarın. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri oda sıcaklığında 7 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve 10 mL taze ortam ekleyin, homojen bir süspansiyon elde edilene kadar hafifçe pipetleyin.</li>
	<li><li></li></ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67422/67422fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67422/67422fig02large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li><li> </li><li><li> </li><li></li><li><li><li><li> </li></ol><ol><li><li><li><li></li><li><li><li> </li><li><li><li><li> </li></ol><ol><li></li><li><li> </li><li></li></ol>

<table><tbody><tr><td>&mikro;-Çanak 35 mm, yüksek cam tabanlı</td><td>IBIDI</td><td>81158</td><td></td></tr><tr><td>12-256 miko-kalıp 3D PetriDish&nbsp;</td><td>Microtissue Inc., RI, ABD</td><td>12-256TR</td><td></td></tr><tr><td>3 & m polistiren mikroküreler</td><td>Polysciences</td><td>17134-15</td><td></td></tr><tr><td>anti CD20 antikoru (klon L26)</td><td>Dako</td><td>IS604</td><td></td></tr><tr><td>Otomatik Hücre Sayacı, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>EVE/ EVE-MC</td><td></td></tr><tr><td>Autostainer Link 48</td><td>Dako</td><td>D09634</td><td></td></tr><tr><td>Kamera&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>U-TV0.63XC</td><td></td></tr><tr><td>CelCulture CO2 İnkübatörü</td><td>Esco Technologies, Inc.</td><td>CCL</td><td></td></tr><tr><td>Hücre Sayma Slaytları, EVE</td><td>NanoEntek</td><td>NE-EVS</td><td></td></tr><tr><td>Hücre hattı HS-5</td><td>ATCC</td><td>CRL-3611</td><td></td></tr><tr><td>Hücre hattı Ri-1&nbsp;</td><td>DSMZ&nbsp;</td><td>ACC 585</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Gibco</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>Floresan mikroskobu&nbsp;</td><td>Olympus</td><td>BX43</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ programı</td><td>Ulusal Sağlık Enstitüleri, MD, ABD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Canlı/Ölü reaktif kiti&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Orta</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum klorür çözeltisi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür çözeltisi %0,9, steril</td><td>ITW ReITW Reaktifleri, S.R.L.ajanlar, S.R.L.</td><td>A1671</td><td></td></tr><tr><td>Tripan Mavisi Çözeltisi,% 0.4</td> <td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzim (1X), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.05), fenol kırmızısı</td><td>Gibco</td><td>25300096</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Agaroz</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td></td></tr><tr><td>< güçlü > Optik cımbız kurulumu< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dikroik aynalar</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805R</td><td></td></tr><tr><td>Dijital kamera</td><td>Mikrotron GmbH</td><td>MC1362</td><td></td></tr><tr><td>Galvano-ayna XY tarama sistemi</td><td>Thorlabs</td><td>GVS002</td><td></td></tr><tr><td>Ters mikroskop ve nbsp;</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Lens 1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-050-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Lens 2</td><td>Thorlabs</td><td>AC508-200-B-ML</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 1064 nm lazer</td><td>Lazer Quantum</td><td>Ventus</td><td></td></tr></tbody></table>

hibrit sferoidlerin üretilmesi için optik cımbız kullanma

Using Optical Tweezers for the Generation of Hybrid Spheroids

Önceki sonuçlarımız, lenfoma hücreleri ile kültürlenen mezenkimal stromal hücrelerin, kanser hücrelerinin düzgün bir şekilde bağlandığı homojen stromal çekirdeği oluşturduğunu gösterdi18. Bu çalışmada, mezenkimal stromal hücreler ve lenfoma hücrelerinden oluşan insan hibrit sferoidini, özel yapım optik cımbız kullanarak başarıyla tasarladık. Şekil 2B , optik cımbız sisteminin önemli bir parçası olan parlak alan mikroskobunda temsili bir sferoidi göstermektedir. Buna k...

Hibrit sferoidlerin üretilmesi için optik cımbız kullanma

Two-dimensional (2D) cell culture is still among the most commonly used models in preclinical cancer research. However, the three-dimensional (3D) in ...

using-optical-tweezers-for-the-generation-of-hybrid-spheroids

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Spheroids, 2B hücre kültürü tek katmanlı modellere kıyasla bir hücrenin ortamını daha doğru bir şekilde temsil etmek için kullanılan bir tür 3B hücre kültürü modelidir. Örnek protokolde, bilim adamlarının bir kolorektal kanser hücre hattından sferoidler ürettiğini ve sferoidlerin büyümesini izlemek için canlı hücre görüntüleme uyguladığını göreceğiz.

Hücre Hatlarından Küresel Üretim: Üç Boyutlu (3D) Bir Hücre Kültürü Yöntemi

Source: Huang, Y. et. al., Optik Koherens Tomografi Kullanarak Üç Boyutlu Tümör Sferoidlerinin Boylamsal Morfolojik ve Fizyolojik İzlemesi. J. Vis. Exp. (2019)Bu video, yüksek çözünürlüklü kesitsel görüntüler yakalayarak çok kuyulu bir plakadaki tümör sferoidlerini izlemek için optik koherens tomografinin (OCT) kullanımını göstermektedir. OCT, hücresel yapılardan gelen ışık yansımalarını analiz ederek, boyut ve şekil gibi morfolojik özellikleri değerlendirmek için 3D modeller oluştururken, aynı...

Optik Koherens Tomografi ile Tümör Sferoidlerinin Morfolojik ve Fizyolojik İzlenmesi 

Burada, hücre agregasyonu yoluyla 3B hücre sferoidlerinin oluşumu için hızlı ve esnek bir protokol açıklıyoruz. Bu, birden fazla hücre tipine kolayca uyarlanır ve hücre göçü, istila veya anoikis tahlilleri dahil olmak üzere çeşitli uygulamalarda ve hücre-matris etkileşimlerini görüntülemek ve ölçmek için uygundur.

3D Sfero Üretim için bir Verimli ve esnek Hücre Toplama Yöntemi

Optik koherens tomografi (OCT), üç boyutlu görüntüleme teknolojisi, izlemek ve çok hücreli tümör pulcuklarının büyüme kinetik karakterize etmek için kullanıldı. Tümör pulcuklarının yaklaşım ve içsel optik zayıflama Karşıtlık'dayalı pulcuklarının etiket içermeyen ölü dokuyu algılama sayma Voksel kullanarak hassas hacimsel miktar gösterdi.

Boyuna morfolojik ve fizyolojik izleme optik koherens tomografi kullanarak üç boyutlu tümör pulcuklarının

Biz hücre küresel leri yetiştirmek için bir motor destekli santrifüj mikroakışkan cihaz satıyoruz. Bu cihazı kullanarak, tek veya birden fazla hücre tiplerinin küresel leri yüksek yerçekimi koşullarında kolayca cokültüre edilebilir.

Çok Hücreli Üç Boyutlu Spheroidler Üretmek için Lab-on-a-CD Platformu

Protokol, standart bir floresan mikroskobunda oksijenasyonlarının ve hücre ölümlerinin çok parametrik analizini kullanarak biyobaskı için yüksek verimli sferoid üretimini tanımlar. Bu yaklaşım, sferoidlerin yaşayabilirliğini kontrol etmek ve 3D doku, tümör mikroçevresi ve başarılı (mikro) doku biyofabrikasyonunun modellenmesinde önemli olan standardizasyonu gerçekleştirmek için uygulanabilir.

Çok Hücreli Sferoidlerin Uygun Fiyatlı Oksijen Mikroskobu Destekli Biyofabrikasyonu

Bu protokol, üç farklı sferoid tipinin üretimi için bir yöntemi, onları büyük ölçekli yüksek içerikli tarama ve analiz için uygun hale getirecek şekilde detaylandırmaktadır. Ek olarak, küresel ve bireysel hücre seviyelerinde nasıl analiz edilebileceğini gösteren örnekler sunulmaktadır.

Yüksek İçerikli Tarama ve Analiz Uygulamaları için Büyük Ölçekli Sferoid Üretimi için Sağlam Bir Yöntem

Mevcut protokol, 3D baskılı damga benzeri bir cihaz kullanarak uygun maliyetli bir şekilde büyük ölçekte doku sferoidleri üretmek için bir tekniği açıklamaktadır.

3D baskılı damga benzeri bir cihaz aracılığıyla doku sferoidlerinin üretilmesi

Tümör sferoidleri, tümör hücresi-mikroçevre etkileşimlerini ve tedavi yanıtını değerlendirmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Mevcut protokol, hızlı optik temizleme kullanarak 3D tümör sferoidlerinin yarı yüksek verimli görüntülenmesi için sağlam ama basit bir yöntemi tanımlamaktadır.

Tümör Sferoidlerinin Yarı Yüksek Verimli Analizi için Hızlı Optik Temizleme

Bu çalışma, agaroz kalıplarında mikro kuyular oluşturmak için damga tabanlı bir sistem kullanarak 3D hücre yapıları oluşturmak için uygun maliyetli ve verimli bir metodoloji sunmaktadır. Sistem, tek tip sferoidlerin/organoidlerin oluşumunu teşvik eder, böylece hücre etkileşimlerini iyileştirir. Bu yaklaşım deneysel değişkenliği azaltır ve ilaç testi ve doku mühendisliğindeki uygulamaları destekler.

Yeni Bir Damga Cihazı Kullanılarak İki Boyutlu Hücre Kültürlerinden Üç Boyutlu Sferoidlerin/Organoidlerin Üretilmesi

Öğrenin, optik cımbız kullanarak hibrit lenfoma sferoidleri üretme yöntemini. Bu teknik, hücre-hücre etkileşimlerini tek hücre düzeyinde incelemek ve 3D hücre kültürü uygulamaları için yeni olanaklar sunar.

Hibrit sferoidlerin üretilmesi için optik cımbız kullanma

Daha fazla video keşfet