Küçük hacimli bir odada yüksek çözünürlüklü respirometri

Bu çalışmada, 0.5 mililitreye kalibre edilen küçük hacimli odacığın, Oroboros platformundaki iki mililitrelik klasik hacim için elde edilen doğruluktan ödün vermeden respirometrik tahlillerde kullanılıp kullanılamayacağını araştırmak istiyoruz.

Küçük hacimli odayı geliştirmemiz ve hassas OXPHOS analizi kullanarak titiz kalite kontrol ile yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirmemiz, gelişmelere, yeni inovasyonlara, yani bir numara, 12 odacıklı bir O2k respirometre, iki numara, OXPHOS analizi için uygulanan karmaşık protokollerdeki maddelerin otomatik titrasyonları için bir robota giden yolu açtı. Bu uygulamalar, mitokondriyal analitiklere doğru daha da genişlemede, mitokondriyal hastalıkların teşhisinde, ilaçların hem mitokondriyal fonksiyon için faydalarına hem de mitokondriyal fonksiyonu istemsiz olarak bozan hedef dışı etkilere odaklanan ilaç gelişmelerinin değerlendirilmesinde çok önemli olacaktır. Ekibim 30 yıldan daha uzun bir süre önce yüksek çözünürlüklü respirometri geliştirdiğinde, mitokondri, mitokondri, mitokondri gibi bir paradigma vardı. Belki kas ve karaciğer mitokondrileri arasında bir fark vardı, ama hepsi buydu. Bu paradigmaların dışında hiç kimse mitokondri ile gerçekten ilgilenmiyordu. Yüksek çözünürlüklü respirometri için geliştirdiğimiz protokollerimizle, çok çeşitli mitokondriyal fonksiyonlar gösterdik. Bu, çeşitli hücre tiplerinde, dokularda ve türlerde mitokondriyal solunum kontrolünü yeni bir gözle değerlendirmemizi sağlar. 30 yıl önce, bunu takdir eden yaklaşık 10 yayın vardı. Şimdi, cihazımızla bu protokolleri kullanan 1.500'den fazla cihazımız var.

Küçük hacimli haznede, klasik iki mililitrelik hazneye kıyasla dört kat daha az numune gerekir. Düşük solunum hızlarına sahip numune söz konusu olduğunda, ölçümün belirsizliğini azaltmak için hacim spesifik oksijen akışlarını artırmak için aynı miktarda numune kullanılabilir.

Oroboros Ar-Ge Laboratuvarı'ndaki çalışmalarımızın odak noktası, enstrümantal geliştirme ve akademik araştırmayı birleştirmektir. Mitokondriyal solunum fonksiyonu ve biyogenetik profillemeleri çoklu sensör analizleri ile değerlendiriyoruz. Bu, solunum, redoks potansiyelleri, membran potansiyeli, kalsiyum alımı, hidrojen peroksit üretimi ve biyogenetik profil ve mitokondriyal fonksiyon ve işlev bozukluğu hakkında daha derin bir kavrayışa sahip olmamızı sağlayan diğer çeşitli parametreleri ölçmektir.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, Küçük Hacmi veya SV odasını Oroboros'a monte edin. Ardından Oroboros'u açın ve Oroboros'u DatLab yazılımına bağlamak için Bağlan'a tıklayın. Hazneleri tamamen kuruttuktan sonra, SV haznesine 0,54 mililitre su eklemek için bir pipet kullanın. Ardından karıştırıcıları açın. Hazneyi kapatmadan önce, kılcal damarı kuru tutarak tıpaların O-ringlerini nemlendirin. Hacim kalibrasyon halkasını gevşetin, ardından durdurucu kılcal damarı sıvı dolana ve üst kılcal uçtaki yuvada bir menisküs oluşana kadar durdurucuyu aşağı doğru itin. Konumunu sabitlemek için hacim kalibrasyon halkasını sıkın ve ardışık yerleştirmeler için kalibre edilmiş hacim tutarlılığını sağlayın. Başlamak için, odaları solunum ortamı MiR05 ile doldurun DatLab yazılımını başlatın. Enstrümantal arka plan testi için uygun protokolü seçin. Karıştırma dönüş hızını 550 RPM'ye, hazne hacmini 0,5 mililitreye, veri kayıt aralığını iki saniyeye ve deney sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın. Karıştırıcı testini ve hava kalibrasyonunu çalıştırın. Shift tuşunu basılı tutarken imleci hareket ettirerek oksijen konsantrasyonu grafiğinde R1 işaretini ayarlayın. Bazen, sıfır oksijen kalibrasyonu yapın. Hava kalibrasyonu sırasında, O2-Sıfır Tozunu 50 milimolar fosfat tamponu içinde SV için 2,5 milimolar konsantrasyona çözerek taze bir sodyum ditiyonit stok çözeltisi hazırlayın. Hava kalibrasyonunu tamamladıktan sonra hazneyi kapatın. Oksijen sinyalini yaklaşık 60 ila 120 dakika boyunca izleyin ve oksijen konsantrasyonunun hava doygunluğundan yaklaşık 150 mikromolar kısma düşmesine izin verin. Oksijen eğimi negatif grafiğinde J01 ila J04 etiketli dört işaret ayarlayın. İsteğe bağlı olarak, bir Hamilton şırınga kullanarak, oksijen konsantrasyonunu 100 mikromolar olarak ayarlamak için sodyum ditiyonit çözeltisini titre edin ve J05 işaretini ayarlayın. DatLab'da aletsel oksijen arka plan eğimini hesaplamak için Akı Eğimi'ni seçin. Ardından, oksijen arka plan düzeltme penceresini açın ve oksijen arka plan verilerinin kaynağı olarak Aktif dosya'yı seçin. Doğrusal regresyonun hesaplanması için tüm J0 işaretlerinin kullanıldığını kontrol edin. Ardından oksijen arka plan düzeltmesi için Uygula'ya tıklayın. Başlamak için, Oroboros odalarını deiyonize suyla yıkayın ve odaya taze MiR05 ortamı ekleyin. Enstrümantal arka plan testinden sonra, yeni bir DatLab sekmesi açın ve insan trombosit deneyleri için SUIT-003 protokolünü seçin. Protokol kenar çubuğunda görünen DatLab protokolüne genel bakışı kullanarak kimyasal stok çözeltilerini seçin. Ardından kimyasallara göre Hamilton şırıngalarını seçin. Şırıngaları, SUIT protokolüne göre sırayla etiketlerle şırınga rafına yerleştirin. Kısmi hacim değişimi için, kılcal ölü hacmi hesaba katarak, açık haznedeki gerçek hacimden çıkarılan V hacmine eşdeğer hacim V'yi hesaplayın. Ardından tam olarak yerleştirilmiş durdurucuyu çıkarın ve rafa yerleştirin. Stok hücre süspansiyonunun hücre tipine ve konsantrasyonuna bağlı olarak MiR05'ten hesaplanan hacim V'yi hazneden çıkarın. Şimdi, bilinen bir hücre konsantrasyonuna sahip eşdeğer bir hacimde stok hücre süspansiyonunu hazneye pipetleyin. Buna karşılık, tam hacim değişimi için, tüm ortamı hazneden sifonlayın. SV odasına 0.54 mililitre izole kardiyak mitokondri stoğu ekleyin. Hazneyi kapatın ve fazla s'yi sifonlayın.ampdurdurucu yuvasından çözelti. Bir Substrat Birleştirici İnhibitör Titrasyonunu veya SUIT protokolünü başlatmak için, titrasyon hacimlerini görselleştirmek üzere DatLab'da Olay penceresini açın. Hamilton mikro şırıngayı kullanarak, kimyasal stok çözeltilerini hazneye titre edin. Ardından etkinliği DatLab'da ayarlayın. Titrasyondan sonra akı stabilizasyonuna izin verin. Veri analizi için, grafiğin temsili ve sabit kısmı üzerinde bir işaret ayarlayın. Hava doygunluğundaki arka plan oksijen akışı, 0.5 mililitrelik odada, 2.0 mililitrelik odaya kıyasla 3.9 kat daha yüksekti, bu da hacme özgü arka plan oksijen akışında teorik olarak beklenen dört kat farkla tutarlıydı. Enstrümantal arka plan akılarının değişkenliği, iki oda hacminde neredeyse aynıydı. Canlı trombositlerin, geçirgen fibroblastların ve izole mitokondrinin solunum hızları, uygun arka plan düzeltmesi uygulandığında her iki oda tipinde de yakından korelasyon gösterdi. Oksijen akışı, iki mililitrelik odada, yeniden oksijenlenme sonrası 0,5 mililitrelik odaya göre daha hızlı stabilize oldu. Kompleks III inhibisyonu sonrası artık oksijen tüketimi, enstrümantal tespit limiti ile uyumlu olarak iki oda arasında tutarlıydı.