Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin Anormal Büyüme ile İlgili Genlerinin CRISPR/Cas9 Teknolojisi ile Hücre Sayımı ile Birleştirilerek Değerlendirilmesi

Araştırmanın kapsamı lösemi patogenezidir. CRISPR/Cas9 ile CCK-8 tahlilleri ile birleştirerek anormal HSPC proliferasyonu için kritik olan genleri tanımlamayı, tümörogenezdeki rollerini ve ilaç hedefleri olarak potansiyellerini ortaya çıkarmayı amaçlıyoruz.

CRISPR / Cas-9 tabanlı gen düzenleme, ökaryotik hücrelerinizde gen nakavtını elde etmek için basit ve verimli bir yaklaşım sağlar. Mevcut deneysel zorluk, CRISPR / Cas-9 nakavt verimliliğini daha da artırmaktır.

Protokolümüz, kemik iliği hücrelerine danışma Cas-9 ekspresyonu sağlamak için Cas-9 farelerini kullanır, böylece SGI'lerin hücrelere viral olarak verilmesi, böylece deneysel verimliliği büyük ölçüde artırır.

[Sunucu] Başlamak için, ötenazi yapılmış deneysel fareden femur ve tibia alın. Steriliteyi korumak için uyluk kemiği ve tibiayı çıkarıldıktan hemen sonra laminer akış başlığına aktarın. Bir mililitrelik steril bir şırınga kullanarak, kemik iliği hücrelerini toplamak için kemik iliği boşluğunu% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın. Kemik iliği hücrelerini tek hücrelere dağıtmak için 30 ila 50 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre karışımını 50 mililitrelik bir tüpe aktarın ve iyice karıştırmak için girdap yapın. 40 mikrolitre eritrosit lizis tamponuna 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve eritrositleri parçalamak için beş dakika boyunca buzun üzerine koyun. Ardından 50 mikrolitre Tripan mavisi çözeltisi ekleyin. İyice karıştırın ve canlı hücreleri sayın. Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 800 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra hücreleri, ön stimülasyon ortamı olan kemik iliğinde mililitre başına altı hücrenin gücüne bir ila iki kez 10 konsantrasyonda yeniden askıya alın. Ve 10 mililitre süspansiyonu 10 santimetrelik bir tabağa koyun. Çanağı 37 santigrat derecede 24 saat inkübe edin. Ertesi gün önceden uyarılmış hücreleri toplamak için,% 2 FBS içeren beş ila 10 mililitre PBS ekleyin ve plakayı kuvvetlice durulayın. Hücreleri yeni bir tüpe aktarın ve hücrelere Tripan mavisi ekleyin. Karışımdaki canlı hücreleri sayın. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri mililitre başına altı hücrenin gücüne yaklaşık 10 ila 10 konsantrasyonda taze hazırlanmış spinfection çözeltisinde yeniden süspanse edin. Altı oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna dört mililitre süspansiyon tohumlayın. Plakayı parafilm ile kapatın ve 32 santigrat derecede 90 dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, ortamı değiştirmeden hücreleri bir pipetle nazikçe yeniden askıya alın. Plakayı dört ila altı saat inkübe edin. İlk transfeksiyon için, her bir oyuktan yaklaşık üç mililitre süpernatan ortamı bir tüpe aspire edin ve eşit hacimde kemik iliği ön stimülasyon ortamı ekleyin. Hücreler yanlışlıkla aspire edilirse, santrifüjleme ve yeniden süspansiyon adımlarını daha önce açıklandığı gibi tekrarlayın. İkincil transfeksiyon için, ertesi gün, her oyuktan iki ila üç mililitre ortam çıkarın ve uygun miktarlarda hepas ve poligreen ile birlikte eşit hacimde taze çözülmüş retroviral stok çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 santigrat derecede 90 dakika boyunca 1.500 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri yavaşça yeniden askıya alın ve dört ila altı saat inkübe etmeye devam edin. Şimdi, ortamı daha önce açıklandığı gibi değiştirin ve 24 saat inkübe edin. Plakayı% 2 FBS içeren PBS ile yıkayın ve hücreleri toplayın. Tripan mavisi kullanarak canlı hücreleri saymadan önce hücreleri 70 mikrometrelik bir elekten süzün. Daha sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 800 G'de santrifüjleyin. % 10 FBS ve murin interlökin-3, interlökin-6 ve kök hücre faktörü içeren DMEM'deki hücreleri yeniden askıya alın. Beş dakika boyunca 800 G'de altı hücrenin gücüne yaklaşık 0,5 ila 1x10 santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Genomik DNA ekstraksiyonu için hücre peletini -80 santigrat derecede saklayın. Şimdi, 96 oyuklu bir plakaya oyuk başına dört hücrenin gücüne 1x10 ekleyin ve grup başına altı kopya kuyu yapın. Daha sonra çevredeki kuyucuklara 100 mikrolitre steril PBS ekleyin ve 0, 24, 48 ve 72 saatlik farklı zaman noktalarına kadar inkübe edin. Ortamı her zaman noktasında aspire edin ve kuyucuklara 1/10 hacim CCK-8 çözeltisi içeren 110 mikrolitre ortam ekleyin. Karışımı bir saat inkübe edin. Son olarak, bir mikroplaka spektrofotometresi kullanarak absorbansı 450 nanometrede ölçün. Trp53 nakavt, CCK-8 testi ile ölçülen 24, 48 ve 72 saatlik kontrollere kıyasla fare, hematopoietik kök ve progenitör hücrelerin proliferatif kapasitesini önemli ölçüde artırdı. Trp53 düzenleme verimliliğinin TIDE analizi kullanılarak %7,3 olduğu tahmin edilmiştir. Ve yeni nesil dizileme, genin farklı pozisyonlarında meydana gelen mutasyonları ortaya çıkardı.