Bakteriyel Fotodinamik İnaktivasyonda Fotoaktif Moleküllerin Değerlendirilmesi için LED Tabanlı İn Vitro Tarama

Araştırmam, hem doğal hem de sentetik flavylium bileşikleri ailesinden farklı molekülleri keşfetmeye odaklanmıştır ve UV fotokoruma bağlamında biyoaktivitelerini incelemeye ve fotodinamik terapi uygulamaları için ışığa duyarlılaştırıcılar olarak potansiyellerini değerlendirmeye temel bir ilgi duymaktadır. Araştırma grubumuzdaki son bulgular, amino bazlı flavylium boyalarının ışıkla aktive olan özelliklerini gösterdi ve onları umut verici yeni bir ışığa duyarlılaştırıcı sınıfı olarak belirledi. Bu bileşikler, daha fazla keşif için önemli bir potansiyel sergilemekte ve bu alanda yenilikçi uygulamaların önünü açmaktadır.

96 oyuklu mikroplaka ve ışık paneli sistemini kullanarak, kontrollü bir ortamda ışığa duyarlılaştırıcıların yüksek verimli bir taramasını elde edebilir, bu da fotodinamik tedavi için farklı adaylar arasındaki tanımlamayı ve karşılaştırmayı basitleştirir. Başlamak için, Staphylococcus aureus bakterisini durdurma kültüründen Mueller-Hinton agar plakasına tanıtın. Taze kültür elde etmek için plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Agar plakasından iki ila üç taze koloni toplayın ve bunları pH 7.4'te altı mililitre önceden ısıtılmış steril filtrelenmiş PBS ile seyreltin. Numuneyi homojenize etmek için aşıyı üç ila dört döngü boyunca dakikada 1.200 devirde vorteksleyin ve homojenize edilmiş aşılamanın üç mililitresini tek kullanımlık bir küvete çekin. Optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçtükten sonra, numuneyi PBS kullanarak 0.1'lik optik yoğunluğa uyacak şekilde seyreltin.

DMSO veya PBS gibi uygun bir çözücü içinde ışığa duyarlılaştırıcı bileşiğin bir stok çözeltisini hazırlayın. Çalışma çözeltisini oluşturmak için stok çözeltisini PBS'de seyreltin ve bakteri kültürü ortamı bileşenlerinin ışık emilimini engellemediğinden emin olun. Tam homojenizasyonu sağlamak için çalışma solüsyonunu vorteksleyin.

Başlamak için, Staphylococcus aureus süspansiyonunu ve ışığa duyarlılaştırıcı bileşik çalışma solüsyonunu hazırlayın. Biri ışığa maruz kalma, diğeri karanlık kontrol için tasarlanmış iki ayrı 96 oyuklu plaka hazırlayın. Her plakada, ışığa duyarlılaştırıcı solüsyonun ve bakteri süspansiyonunun her birine 100 mikrolitre dağıtın.

Solüsyonları pipetle 5 ila 10 kez karıştırın. Işığa duyarlılaştırıcının bakteri hücreleri ile etkileşime girmesine izin vermek için plakaları 37 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, plakaları inkübatörden çıkarın.

Plakalardan birini karanlık kontrol olarak ışığa maruz kalmaktan koruyun. Diğer 96 oyuklu plakayı dikdörtgen 50 watt LED panelin üzerine yerleştirin. Protokol tekrarları arasında tutarlı bir yerleştirme sağlamak için plakanın kenarlarını LED yüzeyinde işaretleyin.

Plakayı yaklaşık 15 dakika LED ışığına maruz bırakın. Kontroller, ışınlanmamış ve ışınlanmış kuyular dahil olmak üzere numunelerin seri seyreltmelerini hazırlamak için başka bir 96 oyuklu plaka kullanın. Numune sayısına göre her kuyucuğa 180 mikrolitre PBS ekleyin.

Işınlanmış ve ışınlanmamış plakalardaki her kuyucuktan 20 mikrolitreyi PBS dolgulu plakanın ilk sütununa alikot. Çok kanallı bir mikro pipet kullanarak, kuyu 1'den 6'ya kadar basit bir seri seyreltme gerçekleştirin. Bir agar plakasını altı eşit bölüme ayırın ve her bölüm seyreltmelerden birine karşılık gelir.

Her bir oyuktan 10 mikrolitreyi agar plakasının ilgili bölümüne alikot edin. Plakayı 18 ila 20 saat inkübe edin. Agar plakasını inkübatörden çıkarın ve koloni sayımı için uygun alanları belirleyin.

Burgu plakasının her bir bölümünde, koloni oluşturan birimlerin sayısını sayın. Görünür ışık aralığı spektrumu, 400 ila 700 nanometre arasında üç farklı tepe gösterdi. Karanlık koşullar altında, test edilen flavylium bileşiklerinin hiçbiri sitotoksik etki göstermedi.

Buna karşılık, ışığa maruz kaldıktan sonra, test edilen bileşikler, 6 ve 12 mikromolar konsantrasyonlarda gözlenen önemli etkilerle Staphylococcus aureus canlılığında doza bağlı bir azalmaya neden oldu.