HeLa Hücreleri Kullanılarak Anti-MDA5 Otoantikorlarının Tespiti ve Işık Mikroskobu ile İmmünositokimya

Aşağıdaki deneyin temel amacı, anti-MDA5 antikorlarını taramak için immünositokimyayı kullanmaktır. Bu, HeLa hücreleri kullanılarak yapılır ve ardından HeLa hücresini MDA5 yapısıyla transfekte eder. Bu nedenle, HeLa hücreleri, MDA5 antikorları tarafından bağlanabilen MDA5 proteinleri üretecektir.

MDA5 yapısına sahip HeLa hücresi dahil edildikten sonra, Triton reaktifi, anti-MDA5 antikorlarının geçmesine izin verecek olan HeLa hücrelerinin zarını geçirgenleştirmek için kullanılır. Daha sonra anti-MDA5 antikorlarını içeren hasta serumu eklenir. Anti-MDA5 antikorları daha sonra HeLa hücrelerinin içindeki MDA5 proteinlerine bağlanacaktır.

Bundan sonra, yaban turpu peroksidazının bağlı olduğu ikincil antikorlar hücrelere yerleştirilir, ikincil antikorlar daha sonra anti-MDA5 antikorlarına bağlanır. Son olarak, kromojen hücrelere eklenir ve yaban turpu peroksidaz konjuge ikincil antikorların varlığında oksitlenir ve optik mikroskop altında görünür bir renk üretir. Olumlu bir durum sonucu, yukarıdaki resimdeki gibi bir şey gösterecektir.

Bugünkü video gösteriminde, tıbbi araştırmaların kritik bir alanına, anti-MDA5 antikoru olarak da adlandırılan anti-melanom farklılaşmasıyla ilişkili gen beş antikorunun tespitine giriyoruz. Bu otoantikorlar, interstisyel akciğer hastalığı olan hastalar, özellikle de hızla ilerleyen hastalar için basit tanı göstergesinde kritik bir rol oynar. Bu araştırmanın önemi, hasta sonuçları üzerindeki potansiyel etkisinde yatmaktadır. MDA5 otoantikorunun erken ve doğru tespiti, bu ciddi otoimmün hastalığın etkili bir şekilde yönetilmesi için hayati öneme sahiptir.

Gösterdiğimiz yöntemin, anti-MDA5 otoantikorunu taramanın altın yöntemine göre birincil avantajı, geleneksel radyo etiketli immün ziyaret testine kıyasla daha hızlı yapılabilmesi ve zamandan ve emekten tasarruf sağlamasıdır. Bu artan verimlilik, daha fazla numuneyi işlememize ve hızlı bir şekilde sonuç üretmemize olanak tanır. Ayrıca, yöntemimizin yalnızca üstün verimlilik sunmakla kalmayıp, aynı zamanda geçiş immünopresipitasyon testiyle karşılaştırıldığında güvenlik ve maliyet etkinliği açısından da kendisini sunduğunu belirtmek çok önemlidir.

Şimdi nasıl yapıldığını görelim. Araştırma asistanım Teo Kai Fa prosedürü yönetecek. HeLa hücrelerini, nemlendirilmiş %5CO2 atmosferinde 37 santigrat derecede %10 fetal sığır serumu ve %1 antibiyotik antibiyotik içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı ile koruyun.

Hücreleri her iki ila üç günde bir veya hücreler %90 ila %100 birleşmeye ulaştığında geçirin. 24 oyuklu bir plakadan her bir kuyucuğa 70.000 HeLa hücresi yerleştirin. Transfeksiyondan 24 saat önce ve yaklaşık %90 birleşen hücreleri netleştirin.

500 nanogram plazmin ve 1.5 mikrolitre transfeksiyon reaktifinin her birini 25 mikrolitre indirgenmiş serum ortamında seyreltin. Seyreltilmiş DNA ekleyin, bire bir oranında seyreltilmiş transfeksiyon reaktifi yapın. İyice karıştırın ve beş dakika inkübe edin.

Bir gün önce oturan hücrelere karışım ekleyin ve DNA lipid kompleksini hemen karıştırmak için çalkalayın. Hücrelerin %80 ila %90 oranında birleştiğini doğrulayın. Hücreleri 37 santigrat derecede nemlendirilmiş% 5CO2 yarım kürede 40 ila dört saat inkübe edin ve immünositokimyaya geçin.

Ticari olarak temin edilebilen bir faktör kullanıyoruz. Daha fazla bilgi malzeme tablosunda bulunabilir. Transfeksiyon etkinlikleri %50'dir Transfeksiyon başarısı ve hedef proteinin ekspresyonu, hücrelerin plazmit eksprese eden donmuş protein ile transfekte edilmesi ve hedef proteinin ekspresyonunu görselleştirmek için batı kanının iletilmesiyle belirlenebilir. İnkübasyondan sonra, kalan ortamı çıkarmak için hücreleri PBS ile iki kez yıkayın.

Yıkama, plaka veya orbital çalkalayıcı çalkalanarak gerçekleştirilebilir. PBS Dikkatinde hücreleri %4 paraformaldehit ile sabitleyin. Paraformaldehit zehirlidir.

Uygun kullanım yönergelerini kullanın. Hücreleri oda sıcaklığında 15 dakika bekletin. Ardından, fiksatif reaktifi atın.

Hücreyi iki kez yıkamak için PBS'yi kullanın. Triton reaktifini uygulayın ve ardından hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika bekletin. Triton X 400'ü PBS'de %0,3 konsantrasyonda kullandık 10 dakika sonra Triton reaktifini atın.

Hücreleri bir kez yıkamak için PBS ekleyin. Bir sonraki adım, PBS'de %10 fetal sığır serumu ile blokaj gerçekleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında bir saat bekletin, Bloke edici reaktifi çıkarın. Ardından, hücreleri bir kez yıkamak için PBS ekleyin.

Seyreltilmiş hasta plazmasını hücrelere ekleyin. Kullanmadan önce hasta plazmasını PBS'de bir ila 5.000 seyreltme oranında seyrelttiğinizden emin olun. Tarafsız sonuçlar elde etmek için sinyali geliştirmek veya arka planı gerektiği gibi azaltmak için seyreltmeyi ayarlayın.

Testi yapan personel, hangi örneklerin hastalara, hangilerinin sağlıklı bireylere ait olduğu konusunda hiçbir bilgiye sahip değildi. Bir numuneyi dört santigrat derecede 12 ila 16 saat inkübe edin. İnkübasyon süresinin ardından hastanın örneğini çıkarın ve hücreleri PBS ile üç kez yıkayın.

Hücreleri, PBS'de bir ila 250 seyreltme oranında seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz konjuge keçi, anti-insan IgG ile tedavi edin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat bekletin. Bir saat sonra ikincil antikoru atın.

PBS ile üç kez durulayın. Hücreleri yıkadıktan sonra, hücreleri kuyu başına 300 mikrolitre DAB çalışma solüsyonu ile boyayın. DAB çalışma çözümü, üreticinin talimatları izlenerek eksik DAB promosyon konsantresi ve DAB seyreltici ile hazırlanır.

Hücreyi beş dakika boyadıktan sonra boyayı çıkarın. Boyayı çıkardıktan sonra iyonize damıtılmış su ile durulayın ve beş dakika çalkalayın. Hücre çekirdeğini seyreltilmiş hematoksin ile boyayın.

Hemotoksin kullanıyoruz 10 kat seyreltmede. Boyama işlemi için beş dakika bekleyin. Beş dakika sonra hemotoksini atın, ardından analiz edilen damıtılmış su ile her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın.

Son adım, boyama sonuçlarını optik mikroskop altında gözlemleyin. Anti-MDA5 otoantikorları için immünositokimya test sonuçlarımızı yorumlayalım. Olumlu bir sonuç.

Gerçek bir pozitif, HeLa'nın içinde MDA5'i eksprese eden güçlü kahverengi lekelenme gösterir. Bu, hastanın örneğindeki anti-MDA5 otoantikorlarını doğrular. Olumsuz bir sonuç.

Negatif bir sonuç, kahverengi lekelenme olmayan HeLa hücrelerini gösterir, bu da anti-MDA5 otoantikorlarının olmadığını gösterir. Yanlış pozitif sonuç. Kritik olarak, yanlış pozitif, MDA5 ekspresyonundan bağımsız olarak tüm hücrelerde yoğun kahverengi lekelenme gösterir.

Otoimmün durumlarda görülen bu nonspesifik boyanma, yanlış tanıyı önlemek için gerçek bir pozitiften ayırt edilmelidir. Yöntemimiz, anti-MDA5 organ antikorlarını tespit etmek için daha hızlı, daha güvenli ve daha uygun maliyetli bir yol sunar. Bu, interstisyel akciğer hastalığının tedavisinde hasta sonuçlarını önemli ölçüde etkileme potansiyeline sahiptir.

Bu videoyu izledikten sonra, immünositokimya prosedürünü nasıl uygulayacağınızı ve test sonuçlarıyla ilgili klinik olarak nasıl belirleyeceğinizi öğrenmiş olacaksınız.