Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Hızlı ve hassas multipleks immünofloresan testleri için kitler geliştiriyoruz. Buradaki amaç, araştırmacıların FFPE dokusunda görünen farklı hücre tiplerinin profilini çıkarmasına yardımcı olmaktır

İmmünofloresan yaygın olarak boya etiketli veya peroksidaz etiketli ikincil antikorlar kullanılarak gerçekleştirilir. İmmünohistokimya düşük pleks olma eğilimindedir. Boya etiketli ikincil antikorlar daha düşük sinyalden muzdariptir. Tiramid sinyal amplifikasyon testlerinin optimize edilmesi zahmetlidir ve çalıştırılması birkaç saatten birkaç güne kadar sürer.

Tahlillerin belirteçleri önceden optimize edilmiş olarak gelir ve diğer tekniklerden önemli ölçüde daha hızlıdır. Dört belirteç ayakta durmak sekiz saatten az sürer ve her ek dört biyobelirteç için yaklaşık üç saat daha sürer.

Multipleks immünofloresanı daha hızlı çalıştırma yeteneği, uzamsal proteomiklerin daha yaygın olarak uygulanmasını sağlayacak ve dokunun uzamsal dokusunu anlamanın önündeki engeli azaltacaktır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, tüm kit reaktiflerini oda sıcaklığında çözün. Antikor konjugatlarını, amplifikasyon enzimini, değişim başlatıcısını ve değişim nötrleştiricisini kullanılana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Çözülmüş bir antikor seyrelticisi girdap. Antikor seyrelticiyi bir kaba pipetleyin. Kısaca santrifüjleyin ve tüm antikorları antikor boyama solüsyonu 1 kabına ekleyin. Sağlanan antikor seyrelticiyi 1 ila 100 seyreltmede ekleyin. Ardından, girdaplaşmayı önleyerek çözeltiyi nazikçe karıştırmak için bir pipet kullanın. İyice karıştırmak için çözüldükten sonra ön amplifikasyon karışık çözeltisini girdaplayın. Ardından çözeltiyi ilgili karıştırma kabına ekleyin. Amplifikasyon tamponunu girdap haline getirin ve amplifikasyon enzimini pipetle karıştırın. Amplifikasyon tamponunu oluşturmak için amplifikasyon enzimini amplifikasyon tamponunda 1 ila 10 oranında seyreltin. Girdaplaşmayı önleyerek pipetleyerek nazikçe karıştırın. Daha sonra sağlanan nükleer karşı leke çözeltisini girdaplayın ve santrifüjleyin ve ultra saf suda 1 ila 100 oranında seyreltin. Daha sonra, floresan probları 1 çözeltisini prob tamponunda 1 ila 20 oranında seyreltin. Reaktif hacimlerinin ölçülmesine izin vermek için tam reaktif çubuğunu cihaza yerleştirin. Tüm reaktifler hazırlandıktan sonra otomatik boyama yazılımının üst kısmındaki Slayt kurulumu sekmesine gidin. Çalışma ekle düğmesine tıklayın ve çalışma kimliğini, çalışma adını ve gerektiği gibi çalışma yorumlarını girin. Dağıtım hacmi altında, 150 mikrolitreyi seçin ve hazırlama yöntemi olarak *Dewax 4 Steps'i seçin. Açılır menüde mevcut değilse, Protokol kurulumu menüsünü açın, bunun için tercih edilen onay kutusunu işaretleyin ve Tamam'a tıklayın. Etüt oluşturulduktan sonra Slayt kurulum ekranının sağ tarafında bulunan Slayt ekle butonuna tıklayın. Slayt yorumları'nın altına slayt için benzersiz bir ad girin. Doku türü'nü Dokuyu uygun alanda test et olarak ayarlayın. Ardından Dağıtım hacmi için 150 mikrolitre seçin ve Boyama modunu sol açılır menüde Tek ve sağ açılır menüde Rutin olarak ayarlayın. İşlem altında, IHC'yi seçin ve İşaretleyici'yi antikor boyama çözeltisi olarak ayarlayın. Ekle slayt penceresinin Protokoller bölümünde, Boyama için Boyama Deneyi 1'i, Hazırlık için *Hazırlık için 4 Adım Dewax ve HIER için ER2 ile *HIER 20 dakika'yı seçin. Enzyme protokolünü yıldız çizgisine ayarlı bırakın ve tüm alanlar tamamlandığında Slayt ekle'ye tıklayın. Tüm slaytları ekledikten sonra, Slayt ekle penceresini kapatın ve slayt etiketlerini her birini ilgili doku bölümüne yapıştırarak yazdırın. Etiketli her slaydı tepsiye yerleştirin ve kapak döşemelerini her bir doku bölümünün üzerine yerleştirin. Kaydırma tepsisini cihaza yerleştirin ve yazılım ekranının sağ tarafından ilgili otomatik boyayıcıyı seçin. Toplu ve hazırlanmış reaktifler de dahil olmak üzere üç slayt tepsisinin ve tüm reaktif bilgilerinin görünür olduğunu onaylayın. Yığın reaktif kaplarının yeterince doldurulduğunu ve atık kaplarının çalışmayı tamamlamak için yeterli hacme sahip olduğunu kontrol edin. Ardından, boyama işlemini başlatmak için oynat düğmesine basın ve prosedür tamamlandıktan sonra slaytların otomatik boyayıcıdan zamanında çıkarılmasını sağlayın. Lekeli slaytları PBS tamponuna yerleştirin ve montaj ortamını kullanarak lamel uygulayın. Slaytları bir floresan mikroskobu veya tahlil boyalarıyla uyumlu filtrelere sahip tüm slayt tarayıcı kullanarak görüntüleyin. Değişim tahlili için, değişim tamponunu oda sıcaklığında çözün. Değişim nötrleştiricisini ve değişim başlatıcısını kullanıma hazır olana kadar eksi 20 santigrat derece sıcaklıkta saklayın. İki reaktif titrasyon kabı hazırlayın ve değişim protokolü sırasında kullanmak üzere algılama kitini alın. Değişim arabelleğini girdaplayın. Ve değişim başlatıcısını pipet karıştırın. Gerekli hacimlerde değişim başlatıcısı ve değişim arabelleğini karıştırarak değişim çözümünü belirlenen kabında hazırlayın. İçeriği yalnızca pipetleyerek karıştırın. Şimdi floresan problar 2 çözeltisini ilgili kapta seyreltilmiş değişim tamponu ile birleştirin. Sadece prob tamponunu ve floresan probu karıştırın ve nihai çözeltiyi pipetleyin. Hazırlanan tüm reaktiflerle birlikte tam reaktif çubuğunu otomatik boyayıcıya yerleştirin. Makinenin tüm reaktifler üzerinde bir daldırma testi yapmasına izin verin. Slaytları ekledikten sonra işaretçiyi *Negatif olarak ayarlayın. Hazırlık, HIER ve Enzim için, değişim protokolü için mum alma veya antijen alımı gerekmediğinden yıldız işareti seçeneğini seçin. Tamamlandığında Slayt ekle'yi tıklayın. Tüm slaytlar eklendikten sonra, Slayt ekle penceresini kapatın ve ilgili doku bölümlerinin her birine yapıştırılacak slayt etiketlerini yazdırın. Her sürgüyü tepsiye yükleyin ve tepsiyi otomatik boyayıcıya yerleştirmeden önce her doku bölümünün üzerine bir kapak döşemesi yerleştirin. Şimdi koşuyu başlatmak için oynat düğmesine basın. Sekiz pleks immünofloresan protokolü kullanılarak iki boyama turu boyunca yakalanan bir doku mikroarray çekirdeğinin görüntüleri, her turda farklı bağışıklık belirteçleri gösterdi ve başarılı görüntü ortak kaydı, her iki turu birleşik bir kompozitte birleştirdi. Kolorektal kanser dokusunun tüm slayt görüntülemesi, düzenleyici T hücreleri, tükenmiş T hücreleri ve immün baskılayıcı makrofajlar dahil olmak üzere belirteçlerin kolokalizasyonuna dayalı immün fenotiplerin tanımlanmasını sağlamıştır. İmmünofloresan boyama, regülatör T hücrelerinde CD3, CD4 ve FoxP3'ün birlikte ekspresyonunu gösterdi. Tümör ve stromal hücrelerde PD1 ve PDL1. Tükenmiş sitotoksik T hücrelerinde CD3, CD8 ve PD1. Ve immün baskılayıcı makrofajlarda CD 68 ve PDL1. Tek belirteç immünohistokimyası ile tek veya multipleks immünofloresan karşılaştırıldığında, tüm belirteçlerde boyama paternlerinde kalitatif uyum doğrulandı. Farklı doku tiplerinde seri kesit boyama, başarılı boyama ve minimum değişkenlik gösteren, temsili doku çekirdekleri ile immün belirteçlerin tutarlı ekspresyon modellerini doğruladı. CD8 için altı seri slaytta boyanan bademcik bölümleri, tüm görüntülerde neredeyse aynı sinyal dağılımı ile yüksek tekrarlanabilirlik gösterdi. Doku tipleri arasında belirteç pozitif hücre yoğunluklarının ölçülmesi, bademcik ve lenf nodunda en yüksek yoğunlukları ve melanom ve kolonda en düşük yoğunlukları gösterdi.