Name: Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Öğrenin, otomatik slayt boyayıcı kullanarak yüksek verimli çoklu immünofloresan testleriyle FFPE dokularda hücre tiplerini profillemeyi. Bu yöntem, uzamsal proteomik araştırmalarını hızlandırır ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>McGinnis, L. M., Ibarra-Lopez, V., Rost, S., Ziai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+and+research+applications+of+multiplexed+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Clinical and research applications of multiplexed immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> J Pathol. 254 (4), 405-417 (2021).</li>
<li>Tan, W. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+multiplex+immunohistochemistry%2Fimmunofluorescence+techniques+in+the+era+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Comm%22%5BJournal%5D)">Overview of multiplex immunohistochemistry/immunofluorescence techniques in the era of cancer immunotherapy.</a> Cancer Comm. 40 (4), 135-153 (2020).</li>
<li>Huss, R., Schmid, C., Manesse, M., Thagaard, J., Maerkl, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological+tumor+heterogeneity+and+diagnostic+profiling+for+advanced+and+immune+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Cell+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immunological tumor heterogeneity and diagnostic profiling for advanced and immune therapies.</a> Adv Cell Gene Ther. 4 (3), e113(2021).</li>
<li>Singhal, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kaiso+%28ZBTB33%29+subcellular+partitioning+functionally+links+LC3A%2FB%2C+the+tumor+microenvironment%2C+and+breast+cancer+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Comm+Biol%22%5BJournal%5D)">Kaiso (ZBTB33) subcellular partitioning functionally links LC3A/B, the tumor microenvironment, and breast cancer survival.</a> Comm Biol. 4 (1), 1-13 (2021).</li>
<li>Patil, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+plasma+cells+predict+outcomes+to+PD-L1+blockade+in+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Intratumoral plasma cells predict outcomes to PD-L1 blockade in non-small cell lung cancer.</a> Cancer Cell. 40 (3), 289-300.e4 (2022).</li>
<li>Hong, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+T+cell+therapy+for+MAGE-A4%2B+solid+cancers+in+HLA-A%2A02%2B+patients%3A+a+phase+1+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Autologous T cell therapy for MAGE-A4+ solid cancers in HLA-A*02+ patients: a phase 1 trial.</a> Nat Med. 29 (1), 104-114 (2023).</li>
<li>Robbins, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-institutional+Assessment+of+Pathologist+Scoring+HER2+Immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Multi-institutional Assessment of Pathologist Scoring HER2 Immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 36 (1), 100032(2023).</li>
<li>Ko, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+HER2-Low+a+New+Clinical+Entity+or+Merely+a+Biomarker+for+an+Antibody+Drug+Conjugate%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Ther%22%5BJournal%5D)">Is HER2-Low a New Clinical Entity or Merely a Biomarker for an Antibody Drug Conjugate.</a> Oncol Ther. 12 (1), 13-17 (2024).</li>
<li>Fundytus, A., Booth, C. M., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+low+can+you+go%3F+PD-L1+expression+as+a+biomarker+in+trials+of+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">How low can you go? PD-L1 expression as a biomarker in trials of cancer immunotherapy.</a> Ann Oncol. 32 (7), 833-836 (2021).</li>
<li>Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Introduction+to+Performing+Immunofluorescence+Staining%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An Introduction to Performing Immunofluorescence Staining.</a> Method Mol Biol. 1897, 299-311 (2019).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+Immunofluorescence%3A+A+Powerful+Tool+in+Cancer+Immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Multiplex Immunofluorescence: A Powerful Tool in Cancer Immunotherapy.</a> Int Mol Sci. 24 (4), 3086(2023).</li>
<li>Taube, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Society+for+Immunotherapy+of+Cancer+statement+on+best+practices+for+multiplex+immunohistochemistry+%28IHC%29+and+immunofluorescence+%28IF%29+staining+and+validation%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation.</a> J ImmunoTher Cancer. 8 (1), e000155(2020).</li>
<li>Myers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+automated+slide+stainers+for+immunohistochemistry+and+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Medl+Lab+Obser%22%5BJournal%5D)">A review of automated slide stainers for immunohistochemistry and in situ hybridization.</a> Medl Lab Obser. 40 (1), 41-44 (2008).</li>
<li>Schwarze, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+administration+of+CD1c+%28BDCA-1%29%2B+and+CD141+%28BDCA-3%29%2B+myeloid+dendritic+cells+in+combination+with+talimogene+laherparepvec+in+immune+checkpoint+blockade+refractory+advanced+melanoma+patients%3A+a+phase+I+clinical+trial%5BTitle%5D)+AND+%22J+ImmunoTher+Cancer%22%5BJournal%5D)">Intratumoral administration of CD1c (BDCA-1)+ and CD141 (BDCA-3)+ myeloid dendritic cells in combination with talimogene laherparepvec in immune checkpoint blockade refractory advanced melanoma patients: a phase I clinical trial.</a> J ImmunoTher Cancer. 10 (9), e005141(2022).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Koppel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+and+validation+of+PD-L1+immunohistochemistry+staining+protocols+using+the+antibody+clone+28-8+on+different+staining+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Mod+Pathol%22%5BJournal%5D)">Optimization and validation of PD-L1 immunohistochemistry staining protocols using the antibody clone 28-8 on different staining platforms.</a> Mod Pathol. 31 (11), 1630-1644 (2018).</li>
<li>Parra, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedural+Requirements+and+Recommendations+for+Multiplex+Immunofluorescence+Tyramide+Signal+Amplification+Assays+to+Support+Translational+Oncology+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Procedural Requirements and Recommendations for Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification Assays to Support Translational Oncology Studies.</a> Cancers. 12 (2), 255(2020).</li>
<li>Surace, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Multiplex+Immunofluorescence+Panel+for+Immuno-oncology+Studies+on+Formalin-fixed+Carcinoma+Tissue+Specimens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Automated Multiplex Immunofluorescence Panel for Immuno-oncology Studies on Formalin-fixed Carcinoma Tissue Specimens.</a> J Vis Exp. (143), e58390(2019).</li>
<li>Hinck, L., Näthke, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+cell+and+tissue+organization+in+cancer+of+the+breast+and+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Changes in cell and tissue organization in cancer of the breast and colon.</a> Curr Opin Cell Biol. 0, 87-95 (2014).</li>
<li>Alturki, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+the+Immune+Checkpoint+Inhibitors+in+the+Context+of+Cancer+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Review of the Immune Checkpoint Inhibitors in the Context of Cancer Treatment.</a> J Clin Med. 12 (13), 4301(2023).</li>
<li>Sun, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+checkpoint+therapy+for+solid+tumours%3A+clinical+dilemmas+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune checkpoint therapy for solid tumours: clinical dilemmas and future trends.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 8 (1), 1-26 (2023).</li>
</ol>

Yüksek oranda çoğullanmış immünofloresan (mIF), tek bir doku kesiti 1,2 içinde birden fazla protein biyobelirtecinin aynı anda görselleştirilmesini sağlayarak doku analizi alanında devrim yaratan gelişmiş bir tekniktir. Bu yetenek, birden fazla uzamsal ölçekte doku mikro ortamı içindeki karmaşık morfolojilere sahip hücre tipleri arasındaki etkileşimleri anlamak için genellikle çok önemli olan benzersiz bir ayrıntı düzeyi ve uzamsal çözünürlük sağlar3. Teknik, tümör biyobelirteçlerini, protein ilaç hedeflerini, lokal bağışıklık ve kontrol noktası durumunu, farklı hücre tipleri arasındaki etkileşimleri ve hatta doku içindeki ilaç metabolizması ile ilgili hücre altı kolokalizasyon modellerini birlikte lokalize etmek için kullanılabileceği onkoloji araştırmalarında özellikle değerlidir 4,5,6.
Potansiyeline rağmen, çoğu mIF teknolojisi, özellikle çoğullama yetenekleriyle hassasiyet ve verimi dengelemede hala önemli zorluklarla karşı karşıyadır. Bu sınırlama özellikle HER2 ve PD-L1gibi çok düşük ekspresyon gösterebilen klinik biyobelirteçlerin saptanması için kritiktir 7,8,9. Bunun neden olduğunu görmek için, mIF'in diğer modalitelerini anlamak önemlidir. Bu geleneksel yöntemler, daha sofistike mIF platformlarının yolunu açmıştır, ancak kendi avantajları ve sınırlamaları ile birlikte gelirler.
Doğrudan immünofloresan (DIF), doğrudan floroforlara veya floroforları10 alabilen bir oligonükleotite konjuge antikorları kullanır. Bu yöntemin çoğullanması kolaydır, ancak daha düşük hassasiyet ve doku arka planından veya boyama artefaktlarından gelen sinyali çözme zorluğundan muzdariptir.
Dolaylı immünofloresan (IIF), birincil antikora bağlanan ikincil bir antikor kullanır. Bu, birincil tabanlı DIF'ye kıyasla sinyali artırdı. Geliştirilmiş akış hücresi tasarımlarıyla birleştirildiğinde, sıralı IIF, bir testte 40'a kadar biyobelirteç tespit edebilir 2,11. Bununla birlikte, bunlar, immünohistokimya (IHC) tekniklerinde bulunanlar gibi, sinyal amplifikasyonu için enzim bazlı stratejilere kıyasla hala göreceli bir duyarlılık eksikliğinden muzdariptir.
Enzim katalizine dayalı immünofloresan en sık kromojenik (DAB) veya floresan boya birikimi için yaban turpu peroksidaz (HRP) kullanan IHC yöntemlerinde görülür (ör., tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA)). Bu testler aynı katalitik enzime dayandığından, tespit duyarlılıkları benzerdir, bu da çok spektral TSA bazlı mIF testlerini klinik uygulamalar için uygun hale getirir 2,12. DNA tabanlı sinyal amplifikasyonunun avantajı, mükemmel sinyal amplifikasyonu ve modülerliği korurken mümkün olan yüksek derecede çoğullamadır. Buna karşılık, HRP tabanlı yöntemler daha az modülerdir ve optimize edilmesi zordur, ek panel geliştirme ve test döngüleri gerektirir.
DNA barkodlu antikor immünofloresan Burada gösterilen mIF testi, DNA barkodlu antikorları aynı anda amplifiye etmek için bir DNA polimeraz kullanır, ardından görüntüleme turu başına dört floresan oligonükleotid kullanılarak raportör prob boyama ve boyama döngüleri yapılır (Şekil 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
Şekil 1: Multipleks immünofloresan test protokolünün grafiksel gösterimi. Barkodla konjuge antikorlar tek bir adımda eklenir ve barkodlar aynı anda amplifiye edilir. Her döngüde dört floresan probdan oluşan gruplar eklenir ve bu da dört işaretleyicinin aynı anda görselleştirilmesini sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu tek turlu antikor ilavesi ve tek aşamalı amplifikasyon, test protokolünü büyük ölçüde basitleştirir. Proses, klinik çalışmalarda kullanılan çok sayıda numunede slayttan slayta ve partiden partiye tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan otomatik yüksek verimli boyama ve tarama sistemleri ile kolaylaştırılır13.
Bu teknolojinin başlıca avantajlarından biri, kapsamlı çoğullamaya izin verirken yüksek hassasiyeti koruma yeteneğidir2. İş akışı aynı zamanda görüntüleme veriminin yüksek kalmasını sağlar, böylece klinik çalışmalar için yüksek oranda çoğullanmış mIF teknolojilerinin (örneğin, &gt; 8 biyobelirteç) en önemli sınırlamalarından birini ele alır. Bu, hastalar arasında düşük bolluktaki ilaç hedeflerindeki (örneğin, düşük HER2) ince değişikliklerin terapötik yanıta kritik bilgiler sağlayabileceği klinik araştırmalarda özellikle önemlidir.
Bu temel özelliklere ek olarak, bu test aynı zamanda panel yapılandırılabilirliği, yüksek verimli tam slayt görüntüleme yetenekleri ve hücre altı süreçleri ve bölmeleri ve ayrıca makrofajlar ve dendritik hücrelerle ilişkili hücresel çıkıntıları araştırmak için gerekli optik çözünürlüğü de sağlar. Karmaşık hücresel fenotipleri birden fazla uzamsal ölçekte araştırma yeteneği, optik görüntülemenin görüntüleme kütle sitometrisi (IMC) tabanlı yöntemlere karşı kritik bir avantajıdır2.
Bu çalışmada, bir otomatik boyama ve tam slayt tarayıcı kullanılarak 8 katlı bir mIF testi için bir protokol sunulmaktadır. Bu test, sekiz birincil antikordan oluşan bir panel içerir: CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1 ve pan-Sitokeratin14. Bu belirteç paneli, tümör dokusunun immünoprofilinin çıkarılmasına ve tümör veya stroma ortamında bulunan hücrelerin tanımlanmasına izin verecektir. Bu protokol, ilk boyama ve prob değişim turları için otomatik bir slayt boyayıcı kullanır ve boyama ve görüntüleme 2 gün içinde tamamlanabilir. Bir mIF tahlilinin doğrulanması ve elde edilen görüntülerin analizinin yapılması yöntemleri de gösterilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Anti-CD3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Klonu BC33 (BioCare). </td></tr><tr><td>Anti-CD4</td><td>Ultivue Clone</td> SP35 ULT50801 <td></td> in <td>(Abcam) bir parçası. </td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone KP1'ULT50801 (BioCare) bir parçası. </td></tr><tr><td>Anti-CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone C8/144B ULT50801 nin (BioCare) bir parçası. </td></tr><tr><td>Anti-sitokeratin + anti-SOX10</td><td>ultivue</td><td></td><td>klonları AE1/AE3 (Bethyl Labs) ve BC34'ün (BioCare) ULT50801 parçasıdır. ULT50801 bir parçası,</td></tr><tr><td>Anti-FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7 (Thermo) karışımı olarak sağlanır. </td></tr><tr><td>Anti-PD1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone CAL20 ULT50801 nin (Abcam) bir parçası. </td></tr><tr><td>Anti-PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 73-10 ULT50801 un (Abcam) bir parçası. </td></tr><tr><td>Axioscan.Z1 Mikroskobunun</td> ULT50801 parçası <td>Zeiss,</td><td></td><td>metinde floresan mikroskobu olarak adlandırılır</td></tr><tr><td>Bond Dewax Çözeltisi</td><td>Leica</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>Bağ Epitop Alma Çözeltisi 2</td><td>Leica</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>Bond Açık Kaplar, 30 mL</td><td>Leica</td><td>OP309700</td><td></td></tr><tr><td>Bond Araştırma Tespit Kiti</td><td>Leica</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>Bond Titrasyon Uçları</td><td>Leica</td><td>OPT9049</td><td></td></tr><tr><td>Bond Titrasyon Kiti</td><td>Leica</td><td>OPT9719</td><td></td></tr><tr><td>Bond Üniversal Örtüler</td><td>Leica</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>Bond Yıkama Solüsyonu 10x Konsantre</td><td>Leica</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX Otomatik Boyama Makinesi</td><td>Leica</td><td></td><td>, metinde "otomatik boyayıcı" olarak adlandırılıyor</td></tr><tr><td>BondRX Yazılımı</td><td>Leica</td><td></td><td>Sürüm 6.0 veya üzeri</td></tr><tr><td>Lameller, #1.5 kalınlık</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 geçirmez</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE doku blokları</td><td>BioIVT</td><td></td><td>doku tipleri değişir</td></tr><tr><td>OmniVUE 8-plex testi (CD3, CD4, CD8, CD68, FOXP3, PD-1, PD-L1, pan-Sitokeratin/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td><td>diğer tüm Ultivue bileşenlerini içerir</td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F(</td><td>2,7 mM KCl ve 137 mM NaCl ile pH 7,4)</td></tr><tr><td>Ultivue</td><td>UltiAnalyzer.AI</td> UltiStacker.AI Ultivue <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> Ultivue Amplifikasyon Tamponu Ultivue <tr><td>metninde "montaj ortamı" olarak adlandırılan</td> <td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Antikor Seyreltici</td><td>Ultivue'nin</td><td></td><td>bir parçası ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Buffer</td><td>Ultivue'nin</td><td>bir parçası Ultivue</td><td></td></tr><tr><td>ULT50801 Değişim Başlatıcısı</td><td>Ultivue'nin</td><td></td><td>bir parçası ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Nötrleştirici</td><td>Ultivue'nin</td><td></td> bir <td>parçası ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Floresan Problar 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Floresan Probları 2'nin</td> bir parçası <td>Ultivue'nin</td><td></td><td>bir parçası ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Ön Amplifikasyon Karışımının</td><td>bir parçası</td><td>Ultivue</td><td></td> ULT50801</tr><tr><td>Ultivue Prob Tamponunun</td> bir parçası <td>Ultivue</td><td></td> ULT50801 Ultra saf su Sigma-Aldrich W4502'nin <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>bir parçası</tbody></table>

translasyonel araştırmalar için yüksek verimli otomatik multipleks İmmünofloresan testleri

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

Yukarıdaki protokolü takiben, FFPE dokusu birden fazla hedefle boyanacak ve dörtlü gruplar halinde tüm belirteçlerin yüksek kaliteli görüntüleri elde edilmiştir (Şekil 3A,B). Görüntü ortak kayıt yazılımı, Şekil 3C'de görüldüğü gibi aynı slayttaki görüntülerin birleştirilmesine ve birlikte kaydedilmesine olanak tanır. Kolorektal kanser (CRC) doku lamı için Şekil 4'te benzer sonuçlar gösterilmiştir.
Protokol başarısı, beklenen boyama paterni değerlendirilerek belirlenmelidir. Gösterilen CRC örneğinde, boyanmış hedeflerin her biri beklenen hücre altı bölmede, örneğin nükleer FoxP3, membranöz CD3, sitoplazmik CD68'de ifade edilir (Şekil 4B-D). Fonksiyonel hedeflerin her biri, sırasıyla tükenmiş T hücreleri ve immün baskılayıcı makrofajları gösteren PD1 ve CD3'ün veya PDL-1 ve CD68'in birlikte lokalizasyonu örneğinde gösterildiği gibi, uygun hücre tipinde ifade edilir. Gerçek pozitif sinyalin potansiyel arka plan gürültüsünden başarılı bir şekilde ayırt edilmesini sağlayan iyi sinyal-arka plan oranının değerlendirilmesi, genellikle lekelenmenin kalitesini onaylayan ve başarılı görüntü analizine izin veren patologlar veya görüntü analizi uzmanları tarafından kalitatif olarak gerçekleştirilir. Boyama kalitesini ve performansını daha fazla doğrulamak için, seri kesitlerde altın standart IHC (kromojenik DAB) ile karşılaştırma eklenebilir (Şekil 5'teki örneğe bakınız) ve ayrıca çoğu bağışıklık hedefi için insan bademcik gibi pozitif bir kontrol dokusu örneği eklenebilir, boyama çalışmasının başarısını doğrulamak için yararlı olabilir. Kanserlerin insan bademciklerinden daha düşük hedef ekspresyonu gösterebileceğini unutmayın16.
Sonuçlar kalitatif olarak doğrulandıktan sonra kantitatif analiz yapılabilir. Bu çalışmada, esas olarak, belirli bir hedefi veya hedefleri ifade eden farklı fenotiplerin hücre yoğunluğunun (hücre sayısı/mm2) hesaplanmasının yanı sıra, geniş bir dinamik ifade aralığı gösterebilen fonksiyonel hedeflerin ortalama yoğunluk seviyelerinin hesaplanmasından oluşur. mIF tahlillerinin kesinliğini değerlendirirken, aynı markörlerle boyanmış seri kesitler, Şekil 6'da kalitatif olarak görülebilen slaytlar arasında karşılaştırılabilir sinyaller göstermelidir. Farklı doku tiplerindeki tek belirteç yoğunluklarının örnek kantitatif sonuçları Şekil 7'de gösterilmiştir. Bu görüntüler üzerindeki görüntü analizi, pozitif hücrelerin tanımlanmasını sağlar ve her bir işaretleyici için karşılık gelen bir pozitif hücre yoğunluğunun yanı sıra pozitif hücre başına ortalama sinyal yoğunluğu hesaplanabilir. Bu, çoğullama testinin hassasiyetini değerlendirmek için her bir belirteç için bir değişkenlik katsayısının (CV) hesaplanmasına izin verir (Tablo 4).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
Şekil 3: 8-plex immünofloresan protokolünde ardışık boyama turlarından elde edilen bir doku mikroarray (TMA) çekirdeğinin görüntüleri. (A) CD8, PD1, PD-L1 ve CD68 işaretleyicilerini içeren ilk görüntüleme turundan elde edilen görüntü. Değişim protokolünden sonra, (B) CD3, CD4, FoxP3 ve CK/SOX10 işaretçilerinin ikinci turu için aynı slaytta ikinci görüntüleme turunu gösterir ve (C) (A) ve (B) görüntülerini birleştiren ortak kayıtlı bir görüntüyü gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
Şekil 4: Kolorektal kanser (KRK) dokusunun 8-plex immünofloresan boyama ile temsili boyanması. Şekil, aynı hücrede birden fazla hedefin birlikte lokalize edilmesiyle tanımlanabilen hücresel fenotipleri göstermektedir. (yukarıya) CRC dokusunun tam slayt görüntüsü. (altta) (A) T-reg hücreleri (CD3 + / CD4 + / FOXP3 +), (B) PD-1 ve PD-L1 eksprese eden hücreler, tümör ve stroma içindeki hücreler, (C) tükenmiş sitotoksik T hücreleri (CD3 + / CD8 + / PD-1), (D) immün kaçan tümör hücreleri (PD-L1 + / CK +) ve immün baskılayıcı makrofajlar (CD68 + / PDL1 +). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
Şekil 5: İmmünohistokimya (IHC) ile immünofloresan (IF) boyamanın kalitatif karşılaştırması. Tek belirteçli immünohistokimya boyası (DAB, üst sıra), tek belirteçli immünofloresan (ISP monoplex) ve multipleks immünofloresanın (ISP multipleks) tek kanallı görünümü ile boyanmış seri kesitler, farklı boyama yöntemleri arasında kalitatif uyumu göstermektedir. Ölçek çubukları = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
Şekil 6: Seri kesit boyama. (A) Çok dokulu bir TMA'nın düzenini gösteren diyagram. (B) TMA'daki her doku tipinin doku çekirdeklerinin temsili 8-plex görüntüleri. (C) Tek bir çalışmada boyanmış altı seri TMA bölümü boyunca bir bademcik çekirdeğindeki CD8'in temsili görüntüleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
Şekil 7: TMA'ya dahil edilen doku tipi başına tek işaretli yoğunluk ölçümü. Doku başına yoğunluklar, TMA lamı üzerindeki her doku tipinin üç temsili çekirdeği boyunca ortalama yoğunluklardır. Y ekseni, x eksenindeki farklı doku tiplerinde, pozitif hücre/mm2 birimlerinde tek işaretleyici yoğunluklarını temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
Şekil 8: Bu protokolde açıklanan güçlendirilmiş ISP mIF'yi dolaylı IF ile karşılaştıran bağıl floresan sinyalinin ilgi bölgesi (ROI) analizi. (A) Beş ROI belirtilmiş CK (solda) veya PD-L1 (sağda) için boyanmış temsili slayt. (B) CK (üstte) ve PD-L1 (altta) için temsili ROI görüntüleri. Her biri 100 μm x 100 μm ölçülerinde ve yaklaşık 200 hücre içeren beş ROI boyunca (C) CK ve (D) PD-L1 için güçlendirilmiş mIF (mor) ve dolaylı IF (mavi) ile elde edilen ortalama sinyal yoğunluğu. Y ekseni değerleri rastgele floresan birimleri gösterir ve hata çubukları standart sapmaları gösterir (n=3). (E) Güçlendirilmiş ISP mIF (mor) ve dolaylı IF (mavi) ile elde edilen bağıl sinyal yoğunluğu, tüm ROI'lerde ortalama güçlendirilmiş mIF sinyalinin ortalama dolaylı IF sinyaline oranı alınarak hesaplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 4: Hesaplanan varyans katsayısı (CV). Bademcik görüntüleri için pozitif hücre yoğunluğunun CV'si ve ortalama sinyal yoğunluğu Şekil 6'da gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">Bu Tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Multiplex immunofluorescence (mIF) is an advanced technique that allows for detailed, spatially resolved analysis of tissue samples by visualizing ...

high-throughput-automated-multiplex-immunofluorescence-assays-for

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Burada örnek sınırlı miktarda çalışma, özellikle microRNA (miRNA) ekspresyon düzeyleri için bir maliyet ve zaman etkili yüksek verimli bir tarama aracı olarak mikroakışkan platformu ile birlikte optimize edilmiş bir multiplex ters transkriptaz kantitatif PCR (QRT PCR) protokolü açıklamak.

Yüksek Verimli MicroRNA Profil: Optimize edilmiş, Multiplex QRT-PCR Fluidigm Dinamik ArrayTM IFCS Nanoliter Ölçeğinde

Luminex Corporation Xmap mikroküre teknolojisini kullanarak, çeşitli laboratuvar hayvanı türlerinin serosurveillance için Multiplexed Florometrik immunoassay (MFIA) geliştirdik. MFIA antijeni, doku kontrolü veya immünglobulin kovalent renk kodlu polistiren mikroküreler bağlantılı bir süspansiyon mikroarray olduğunu. MFIA test yöntemi hem de çeşitli giderme konularını ele almaktadır.

Multiplexed Florometrik immunoassay Test Metodolojisi ve Sorun Giderme

Biz bu çalışmada bir transgenik fareden türetilen lenfositlerin kullanılarak yeni floresans bazlı analiz sunuyoruz. Bu deney, inhibe veya lenfosit aktivasyonunu teşvik ya kapasitesine sahip küçük moleküller, yüksek verimli tarama (HTS) için uygundur.

Küçük moleküllerin yüksek verimli tarama için uygun bir floresan bazlı lenfositi analizi

Detaylı bir iletişim kuralı için bir altı-marker multiplex ayirt panel en iyi duruma getirilmiş ve gerçekleştirilen, daha tutarlı sonuçlar ve daha kısa işlem süresi için bir otomatik stainer kullanarak. Bu yaklaşım doğrudan IMMUNO-Onkoloji araştırmalar amaçlı herhangi bir laboratuvar tarafından adapte edilebilir.

IMMUNO-Onkoloji araştırmalar Formalin sabit Karsinomu doku örnekleri Multiplex ayirt Panel otomatik

Burada tarif biz multiplex floresan immunohistokimyasal boyama ve lenfoma içinde birden fazla kanser ilişkili antijenleri eş zamanlı yerelleştirme için görüntüleme için bir iletişim kuralı. Bu iletişim kuralı tüm doku bölümleri içinde biyolojik colocalization analizine genişletilebilir.

Çoğaltılmış floresan immunohistokimyasal boyama, görüntüleme ve analiz lenfoma histolojik örneklerinde

Multiplex floresan immünhistokimya, bozulmamış formalin-sabit, parafin katıştırılmış (FFPE) dokusu içinde birden fazla hücre türlerinin görselleştirilmesini sağlayan gelişmekte olan bir teknolojidir. Sunulan başarılı bir 7-renk Multiplex antikor ve reaktifler optimize etmek için talimatlar, slaytlar, tasarım ve ortak sorunları önlemek için ipuçları hazırlanması sağlamak için yönergeler vardır.

Manuel Multiplex floresan Immünhistokimya 'da optimizasyon, tasarım ve kaçınarak tuzaklar

Biz dondurulmuş dokularda multispektral görüntüleme gerçekleştirmek için hızlı bir boyama yöntemi açıklar.

Dondurulmuş Doku Kesitlerinin Multispektral Floresan Görüntülemesi için Hızlı Bir Yöntem

Çok kuyulu mikro plakalar kullanan otomatik tahliller, tek bir deneyde çok sayıda koşulun değerlendirilmesine izin vererek yol düzenleyicilerini tanımlamak için avantajlı yaklaşımlardır. Burada, köklü makropinozom görüntüleme ve niceleme protokolünü 96 kuyulu bir mikro plaka formatına uyarladık ve çok modlu bir plaka okuyucu kullanarak otomasyon için kapsamlı bir anahat sağladık.

Floresan Etiketli Makropinozomların Nicelleştirilmesi için Otomatik Görüntüleme ve Analiz

Bu makalede, manuel tiramid sinyal amplifikasyonu (TSA) multipleks immünofloresan (mIF) protokolü ile birlikte görüntü analizi ve uzamsal analiz anlatılmaktadır. Bu protokol, laboratuvarda bulunan slayt tarayıcısına bağlı olarak slayt başına iki ila altı antijenin boyanması için formalin sabit parafin gömülü (FFPE) bölümlerle birlikte kullanılabilir.

Multipleks İmmünofloresan, Tümör Mikroçevresinin Klinik ve Biyolojik Değerlendirmesi için Uzamsal Görüntü Analizi ile Kombine Edildi

Manuel IBEX yöntemi ile düşük maliyetli, çok yönlü bir foto ışınlama tekniğinin uygulanması, önemli doğal otofloresan ile insan dokusunun en iyi şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, ters çevrilmiş bir mikroskop, yaygın olarak bulunan reaktifler ve görüntü hizalama ve işleme için açık kaynaklı yazılım kullanılarak arşivlenmiş klinik örneklerden çoğullanmış, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılarıyla açıklar.

Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir

Çoklu immünoflüoresans, doku mimarisi ve hücre popülasyonlarının mekansal analizini desteklemek için tek bir doku bölümünde birden fazla antikor belirteçinin ardışık olarak etiketlenmesini sağlar. Burada, yaşlanma ile ilişkili, yapısal ve bağışıklık belirteçlerinin çoklu algılanması için manuel ve otomatik slayt hazırlığı, yinelemeli görüntüleme ve dijital patoloji yazılımı kullanılarak tek hücre analizi dahil olmak üzere bir iş akışı sunulmaktadır.

Yaşlanma Belirteçlerinin Mekansal Değerlendirmesi İçin Multipleksli İmmünoflüoresans Testi

Öğrenin, otomatik slayt boyayıcı kullanarak yüksek verimli çoklu immünofloresan testleriyle FFPE dokularda hücre tiplerini profillemeyi. Bu yöntem, uzamsal proteomik araştırmalarını hızlandırır ve tekrarlanabilir sonuçlar sunar.

Translasyonel Araştırmalar için Yüksek Verimli Otomatik Multipleks İmmünofloresan Testleri

Daha fazla video keşfet