Tek Hücreli Analizler için İnsan Fallop Tüpü Epitelinin Çıkarılması İçin Etkili Bir Yöntem

Araştırma odak noktamız, yumurtalık kanserlerinde kemoterapi direncini anlamak ve bunlarla mücadele etmektir. Bu agresif popülasyonları ortadan kaldırmak için direnci ve yeni hedefleri yönlendiren mekanizmaları ve hücre alt popülasyonlarını keşfetmeyi amaçlıyoruz.

Tek hücreli RNA dizilimi, heterojen over tümörlerinde alt popülasyonların karakterizasyonunu kolaylaştırır. Yumurtalık kanseri analizleri için kanserli olmayan fallop tüpü epitel hücrelerini normal orijinli hücre olarak kullanıyoruz.

Fallop tüpü epitel hücrelerinin zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyona verimli bir şekilde izole edilmesi, yüksek dereceli seröz over kanseri hastalığının başlangıcının daha iyi anlaşılmasına yardımcı olacaktır. Bu mekanik ve enzimatik sindirim tekniği, canlı fallop tüpü epitel hücrelerinin zenginleştirilmiş tek hücreli bir süspansiyonunun çıkarılması için daha verimli bir süreç sunar.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, ayrışma ortamı içeren 15 veya 50 mililitrelik bir tüpte taze insan fallop tüplerini toplayın ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Fallop tüplerini taze ayrışma ortamı içeren steril bir Petri kabına aktarın ve numuneyi bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin. Şimdi, ince uçlu forseps ve Vannas-Tübingen makası kullanarak yağ, bağ dokusu ve tüpleri çevreleyen tüm damarları inceleyin. Daha sonra, üç ila beş milimetre çapında küçük silindirler oluşturmak için fallop tüplerinin koronal düzlemini makasla kesin. Keserken dokuyu stabilize etmek için ince=nokta forseps kullanın. Ayrışma ortamını, doku parçalarını içeren tabaktan dikkatlice aspire edin. Kağıt mendil parçalarını iki mililitre soğuk 1x PBS ile iki kez yıkayın ve plakayı hafifçe döndürün. PBS'yi aspire ettikten sonra, doku parçalarını oda sıcaklığında soğuk beş milimolar EDTA'da beş dakika inkübe edin. Doku parçalarını soğuk% 1 Tripsin Hanks Dengeli Tuz Çözeltisinde askıya alın ve 40 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. % 1 Tripsin Hanks Dengeli Tuz Çözeltisini aspire edin ve tripsini etkisiz hale getirmek için doku parçalarını soğuk ayrışma ortamında iki kez yıkayın. Doku parçalarını iki mililitre ayrışma ortamında 0.4 miligram DNaz ile oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe edin. Hala DNaz ortamındayken, diseksiyon mikroskobu altında, fallop tüpünün bir parçasını forseps ile tutun, böylece lümen çanak tabanına paralel olur. Epitel hücrelerini lümenden çıkarmak için dokuya tekrar tekrar bastırmak için forseps kullanın. Doku çevresinde bir hücre halesinin serbest bırakıldığını onaylayın. Ortam içeren hücreleri steril 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Petri kabını ayrışma ortamı ile iki kez yıkayın ve yıkamaları aynı tüpte birleştirin. Kalan stromal tüp parçalarını atın. Hücreleri hasat etmek için, beş dakika boyunca 500 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peleti bir mililitre ayrışma ortamında yeniden süspanse edin. Şimdi, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu eşit hacimde tripan mavisi ile karıştırın. Karışımın 10 mikrolitresini bir hazne sayma slaytına pipetleyin ve hücre sayısını belirlemek için bir hücre sayacına yerleştirin. Hücreleri, kollajenaz tip bir ve DNaz içeren dokuz mililitre ayrışma ortamında yeniden süspanse edin. 37 santigrat derecede 30 ila 45 dakika boyunca 200 RPM'ye ayarlanmış bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin. Hücreleri hasat etmek için 500 g'da beş dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, kollajenazı yıkamak için peleti beş mililitre ayrışma ortamında yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 50 mililitrelik bir tüpe geçirin ve süzüntüyü beş dakika boyunca 500 g'de santrifüjleyin. Hücre peleti kırmızı görünüyorsa, kırmızı kan hücrelerini parçalamak için bir RBC lizis tamponu hazırlayın. Ortamı peletten aspire edin, seyreltilmiş RBC lizis tamponundan beş mililitre ekleyin ve numuneyi buz üzerinde üç dakika inkübe edin. RBC lizizini durdurmak için, tüpe 45 mililitre 1x PBS ekleyin. Tüpü 500 g'da beş dakika santrifüjleyin. Hücreleri bir mililitre ayrışma ortamında hasat ettikten ve yeniden süspanse ettikten sonra, 10 mikrolitre hücre süspansiyonunu eşit hacimde tripan mavisi ile karıştırın. Karışımın 10 mikrolitresini bir hazne sayma slaytına pipetleyin ve hücre sayacına yerleştirin. Akış sitometri analizi, fallop tüpü dokusundan canlı ve zenginleştirilmiş bir epitel hücre popülasyonunun ortalama %82 canlılık ile izolasyonunu doğruladı. CD45 pozitif immün hücreler çıkarıldıktan sonra, EpCAM pozitif epitel hücreleri numunenin ortalama %80'ini oluştururken, CD10 pozitif stromal hücre kontaminasyonu %7.8 ile minimaldi. İzole edilmiş epitel hücreleri, dört ila altı günlük kaplamadan sonra 2D kültürde yapışık parke taşı benzeri kümeler oluşturdu ve epitel kimliğini doğruladı. İmmünokimya, kültürlenmiş hücrelerin çoğunun sadece birkaç vimentin pozitif hücre ile EpCAM ve PAX8'i eksprese ettiğini ortaya koydu. Kültürde kirpikli hücreler mevcuttu.