Farklı Doku Mikroortamlarında GPCR Aracılı T Hücresi Lokalizasyonunu Araştırmak için Verimli Retroviral Transdüksiyon ve Rekabetçi Hedef Arama

Araştırmamız, GPCR'lerin çeşitli doku mikro ortamlarında bağışıklık hücresi kaçakçılığını ve konumlandırmasını nasıl etkilediğini araştırıyor. Laboratuvarımız, bu protokolü ve diğer tamamlayıcı protokolleri kullanarak, bağırsak dışı mukozal dokularda organa özgü bir kemoatraktan eksen tanımlamıştır. Artık mide, akciğer, soluk borusu ve GU kanalına ev sahipliği yapan lenfositlerin nasıl çalıştığını öğrendik. Bireysel GPCR'lerin in vivo T hücresi hareketini nasıl etkilediğini test etmek için etkili ve geliştirilmiş bir yöntem sunuyorum. Bu reseptörleri T hücrelerine sokmak için güvenilir bir yol geliştirdik, bu da artık rekabetçi hedef arama deneylerinde doğrudan yan yana karşılaştırmaya izin veriyor. Artık GPCR'lerin T hücresini in vivo olarak nasıl yönlendirdiğini bildiğimize göre, araştırmacılar reseptör ekspresyonunu bağışıklık fonksiyonuna daha iyi bağlayabilirler. Bu, temel immünoloji ve terapötik araştırmalardaki araştırmacılara yardımcı olacaktır. Bu yaklaşımla, artık daha az bilinen veya karakterize edilmemiş GPCR'lerin T hücresini belirli dokulara yönlendirmede nasıl rol oynadığını sorabiliriz. GPCR sinyallemesinin kanseri veya otoimmüniteyi tedavi etmek için nasıl ince ayar yapılabileceğini öğrenebiliriz. Terapötik yaklaşımlar için T hücrelerinin doğru zamanda doğru yere ulaşmasına yardımcı olabiliriz.

[Anlatıcı] Başlamak için, birinci gün, 10 santimetrelik doku kültürü plakalarını steril suda hazırlanan mililitre başına beş mililitre 50 mikrogram Poli-D-Lizin çözeltisi ile kaplayın. Plakaları oda sıcaklığında 45 dakika inkübe edin, ardından kalıntı kalmadığından emin olmak için plakaları kalsiyum ve magnezyum içermeyen steril PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, üç dakika boyunca 37 santigrat derecede iki mililitre% 0.05 tripsin ve 0.5 milimolar EDTA kullanarak Plat-E hücrelerini ayırın. Tripan mavisi dışlama testini kullanarak hücre canlılığını sağlamak için, eşit hacimde hücre süspansiyonunu tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Daha sonra, antibiyotik içermeyen Plat-E ortamı ile 10 santimetrelik bir doku kültürü Petri kabına 3 milyon canlı hücre tohumlayın. İkinci günde, Plat-E hücre kültürlerindeki ortamı 6.5 mililitre indirgenmiş serum ortamı ile değiştirin. Transfeksiyon karışımını üreticinin talimatlarına göre hazırlayın. Her plaka için, bir tüpte 45 mikrolitre Lipofectamine 2000 ile 210 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ve başka bir tüpte 15 mikrogram DNA'yı 235 mikrolitre indirgenmiş serum ortamı ile karıştırın. Tüplerin içeriğini üç ila dört kez pipetleyerek birleştirin ve karmaşık oluşumu kolaylaştırmak için oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Şimdi karışımı damla damla plakalara ekleyin ve 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Daha sonra, PBS kuyucuğu başına 375 mikrolitrede anti-fare CD28 ve CD3 ile T hücresi aktivasyonu için 24 oyuklu plakaları kaplayın. Plakaları gece boyunca dört santigrat derecede veya dört santigrat dereceye ayarlanmış bir inkübatörde üç ila dört saat inkübe edin. Üçüncü günde, izole edilmiş fare dalaklarını, RPMI ortamı içeren altı oyuklu bir plakaya yerleştirilmiş 100 mikrometrelik bir naylon ağ hücre süzgeci üzerinde nazikçe ezmek için bir şırınga pistonu kullanın. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir naylon ağ hücre süzgecinden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Çözeltiyi 450 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Ardından hücreleri kalsiyum ve magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Ardından, üreticinin talimatlarına göre fare T hücresi CD4 izolasyon kitini kullanarak manyetik negatif seçim yapın. Bir hücre sayacı kullanarak izole edilmiş T hücresini sayın. Kaplanmış T hücresi aktivasyon kuyucuklarındaki T hücrelerini, bir mililitre RPMI 10 ortamında kuyu başına bir ila 1,5 milyon hücre yoğunluğunda kaplayın. Hücreleri 37 santigrat derecede, nemlendirilmiş bir inkübatörde %5 karbondioksit ile 24 ila 48 saat inkübe edin. Dördüncü günde, 10 santimetrelik plakalardan yaklaşık 12 mililitre viral süpernatantı konik bir tüpe toplayın. Ertesi gün ikinci bir transdüksiyon için daha fazla viral süpernatan üretmek için Plat-E kültür plakalarındaki ortamı 10 mililitre antibiyotik içermeyen Plat-E ortamı ile değiştirin. Toplanan viral süpernatanı filtrelemek için 0,45 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin. Filtrelenmiş süpernatanta mililitre başına sekiz mikrogram Polybrene ve bir ila 100 seyreltme HEPES tamponu ekleyin. 24 oyuklu T hücresi plakasını 950 g'da yedi dakika döndürün. Ardından, T hücrelerini yerinden çıkarmadan süpernatanı dikkatlice toplayın ve saklayın. Spinfection yapmak için her kuyucuğa bir mililitre viral süpernatan ekleyin. Plakaları plastik sargıyla kapatın ve plakaları 1,150 santigrat derecede dört saat boyunca 32 g'da döndürün. Spenfeksiyondan sonra, her bir oyuktaki ortamı önceden kaydedilmiş T hücresi süpernatantı ile dikkatlice değiştirin. Altıncı günde, T hücrelerini plakadan konik bir tüpe toplayın ve santrifüjleyin. Peleti kalsiyum ve magnezyum içeren PBS ile yıkayın. Hücreleri, mililitre başına 130 birim fare interlökin-2 ve mililitre fare interlökin-7 başına 10 nanogram içeren yeni bir kültür plakasına aktarın. Hücreleri en az iki gün veya enjeksiyon için gereken hücre sayısına bağlı olarak istenen genişleme seviyesine ulaşana kadar inkübe edin. Sekizinci günde, hücreleri peletlemek için 450 g'da dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. 15 mililitrelik bir tüpe beş mililitre Histopaque-1077 ekleyin. T hücresi peletini kalsiyum ve magnezyum içeren beş mililitre PBS içinde yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu, santrifüj tüpündeki beş mililitre Histopaque-1077'nin üzerine dikkatlice yerleştirin. Numuneyi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 400 ila 500 g'da santrifüjleyin ve santrifüj kırılmasının veya ivmesinin 0'a ayarlandığından emin olun. Santrifüjlemeden sonra, farklı hücre katmanlarının oluşumunu gözlemleyin. İstenilen hücreleri içeren arayüz katmanını bir pipet kullanarak dikkatlice toplayın ve diğer katmanlarla kontaminasyonu önleyin. GPR25 transdüksiyonlu T hücreleri, fonksiyonel reseptör ekspresyonunu doğrulayarak, doldurucu transdüksiyonlu kontrollere göre hCXCL17 ve mCXCL17'ye doğru gelişmiş göç sergiledi. GPR25, tercihen genitoüriner yol, mide ve trakea gibi bağırsak dışı mukozal dokulara lokalize edilmiş hücreleri dönüştürdü ve yedi haftada önemli bir zenginleşme gözlendi, ancak enjeksiyondan bir hafta sonra gözlenmedi. Kısa süreli hedef arama deneyleri, GPR25'in tercihen trakea, mide, dil, safra kesesi ve uterus mukozası gibi Cxcl17 açısından zengin organlara ev sahipliği yapan T hücresini dönüştürdüğünü, Cxcl17 eksikliği olan farelerde birikmediğini gösterdi. GPR25, ağırlıklı olarak bronşlara lokalize hücreleri transdüksiyona tabi tutarken, kontrol hücreleri daha sık damarların yakınında bulundu.