Kranial Pencere üzerinden neokorteks Kan Akış 2-Foton Görüntüleme Bir Yöntem
25 Şubat 2008
Kortikal kan akımı dinamikleri 2-foton mikroskobu ile kemirgen kuyruk damar içine enjekte görüntüleme floresan dekstran boyalar in vivo olarak incelenebilir. Bu video görüntü kan akışını dinamikleri ile farelerin bir cam kaplı kafatası pencere hazırlama neokorteks nasıl gösterir.
Serebral vaskülatürü görüntüleme ve canlı kemirgenlerin sağlam beynindeki kan akış dinamiklerini kaydetme yeteneği, serebral iskemi veya normal beyin fizyolojisi çalışmalarına uygulanabilecek güçlü bir tekniktir. Burada, kuyruk damarına enjekte edilen floresan boyaları kullanarak canlı farelerin neokorteksindeki kan akış dinamiklerini görüntülemek için iki foto mikroskobun nasıl kullanılacağını göstereceğiz. Bu teknik ilk olarak David Kleinfeld tarafından Winfred Dank'ta geliştirilmiştir.
Merhaba, ben California Los Angeles Üniversitesi Nöroloji Bölümü'ndeki Carlos Porter Cayo Laboratuvarı'ndan Ricardo Mota. Önceki bir videoda, in vivo kronik görüntüleme deneyleri için bir kraniyal pencere implante etme yöntemini gösterdik. Bugün size serebral korteksteki kan akış dinamiklerini bir kraniyal pencereden görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.
Bu hazırlık çok faydalıdır çünkü foton lazer mikroskobu kullanarak beynin derinliklerinde görüntü elde edilmesini sağlar. Öyleyse başlayalım. Serebral vaskülatürü görüntülemek için, Hayvanlara floresan bir boya ile intravenöz olarak enjekte edilmelidir.
Dexter konjuge boyalarını kullanıyoruz çünkü dekstron moty, boyanın kan-beyin bariyerini geçmesini ve kan damarlarından dışarı sızmasını engelliyor. Fareler, indüksiyon için% 4 ve% 1.5 ila% 2 oranında flor ile anestezi altına alınır. Daha sonra, kuyruk, 26 gauge iğne ile% 70'lik üç çubukla dezenfekte edilir, tuzlu su içinde çözülmüş% 5'lik bir R domin Dekstran çözeltisinin 75 ila yüz mikrolitresi kuyruk damarından enjekte edilir.
Kuyruk hayvanlarının şaftının ortasında, kuyruk damarı enjeksiyonundan hemen sonra, kalıp idrarla atılana kadar görüntülenebilir, bu da ERO domin boyası kullanılırsa pembeye dönecektir Floresan Dexter boya enjeksiyonunu takiben yaklaşık iki saat içinde, Fare flor isofi ile uyuşturulur. Yine, indüksiyon için %4, görüntüleme için bir ila %1.5. Fare, hayvanı sıcak tutmak için termal ayarlı bir ısıtma yastığı içeren mikroskop aşamasına titanyum çubuk kullanılarak sıkıca tutturulur.
Gözleri nemli tutmak için bir miktar göz merhemi sürülür. Kafatası penceresinin kapak camı %70 alkol ile temizlenir. Pencere, odak düzlemine paralel olarak konumlandırılır ve görüş alanında ortalanır.
Dört x objektif altında, bir dijital kamera ile beyin yüzeyi damarlarının fotoğrafını çekmek en iyisidir. Bu resim, görüntü bölgesini günden güne tekrar tekrar bulmak için sonraki görüntüleme oturumlarında referans görüntü olarak kullanılacaktır. Dört x objektif daha sonra suya daldırma 40 x objektif ile değiştirilir.
Sahneyi hareket ettirmeden, görüntünün dijital resmi çekilir. Yine, sahne manipülatörünün koordinatları sıfır olarak ayarlanmıştır. Görüntü elde etme yazılımı olarak tarama görüntüsünü kullanıyoruz.
Bu, Carls Voto'nun laboratuvarında Tom Paul Rudo ve Bernardo Sabatini tarafından MATLAB'da yazılmıştır. Daha sonra diğer tüm ekipmanları, lazeri, güç ölçeri, foto çarpan tüplerini, amplifikatörleri vb. açıyoruz. Pencerenin görüntülenmeye uygun alanı, en iyi bölgeleri bulmak için düşük büyütmede kısa bir süre taranır.
Bunlar tanımlandıktan sonra, görüntü için seçilen bölgenin düşük büyütme yığını alınır ve XY koordinatları, küçük damarlarda veya kılcal damarlarda kan akış dinamiklerini kaydetmek için açıklanır. İlgilenilen geminin en az 40 mikronu boyunca çizgi taramaları kullanıyoruz. Bir saniye süren bu tek taramalar, mümkün olduğunca az lazer gücü kullanılarak yapılır ve taramanın koordinatları ve açısı yazılır.
Görüntüleme seansı sona erdiğinde, hayvan anesteziden kurtulabileceği sıcak bir odaya taşınır. Burada, kuyruk damarından r Domine dekstran enjekte edilen beş aylık bir farenin somatosensoriyel korteksi üzerine yerleştirilmiş bir kraniyal pencereden iki foton mikroskobumuzla çekilen yüz görüntüden oluşan bir yığını gösteriyoruz. Bu görüntü dizisi, Kılcal damarlar da dahil olmak üzere büyük ve küçük kan damarlarının karmaşık ağını göstermektedir.
Az önce size bir kraniyal pencereden in vivo olarak kan akış dinamiklerini görselleştirmek için bir yöntem gösterdik. Bu, örneğin inme sonrası kan akışındaki değişiklikleri araştırmak için kortikal vaskülatürdeki serebral kan akış dinamiklerini görüntülemek için son derece güçlü bir yöntemdir. Floresan boyanın tekrarlanan kuyruk damar enjeksiyonları kullanılarak BUL'lerde çeşitli zamanlarda çoklu hayal gücü yapılabilir.
Bu prosedürü yaparken, mümkün olan en temiz ve daha steril koşullarda çalışmayı ve çok sağlam bir elin olmasını unutmamak önemlidir. Tamam, bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneyinizde iyi şanslar.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, iki-foton mikroskopi kullanarak yaşayan farelerin neokorteksindeki kan akımı dinamiklerini görüntüleme tekniğini gösterir. Kuyruk damarına enjekte edilen floresan dekstran boyaları, serebral vaskülatürün in vivo gözlemini mümkün kılar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Vasküler Görüntüleme
- In Vivo Teknikler
Arka Plan
- Serebral kan akışını görüntülemek, beyin fizyolojisini anlamak için kritik öneme sahiptir.
- Bu teknik, serebral iskemi çalışmalarına uygulanabilir.
- İki-foton mikroskopi, kan akış dinamiklerinin detaylı görüntülemesine olanak tanır.
- Floresan boyalar, kan damarlarını görselleştirmek için kontrast sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Neokorteksdeki kan akış dinamiklerinin görüntülemesini göstermek.
- Kronik görüntüleme için bir kraniyal pencerenin kullanımını sergilemek.
- Bu teknikle ilgilenen araştırmacılar için görsel bir rehber sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Farelere kuyruk damarına floresan dekstran boyalarının enjeksiyonu.
- Görüntüleme için iki-foton mikroskopinin kullanımı.
- Neokortekse erişim için cam kaplı bir kraniyal pencerenin hazırlanması.
- Yaşayan kemirgenlerde kan akış dinamiklerinin in vivo görüntülemes.
Ana Sonuçlar
- Neokorteksteki kan akış dinamiklerinin başarılı görselleştirilmesi.
- Kraniyal pencere hazırlamasının etkinliğinin gösterilmesi.
- Görüntülemede floresan boyaların uygulamasının gösterilmesi.
- Serebral vaskülatür ve kan akış regülasyonu hakkında bilgiler.
Sonuçlar
- Bu teknik, beyin fizyolojisi hakkında değerli bilgiler sağlar.
- Bu teknik, serebral kan akışını içeren çeşitli çalışmalara uygulanabilir.
- Yöntem, serebral iskemi ve ilgili durumlar hakkındaki anlayışımızı geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
In vivo 2-photon imaging of blood flow in the neocortex through a cranial window enables high-resolution, quantitative assessment of cerebral microvascular dynamics in living rodents. This capability is critical for mechanistic de-risking and target validation in neurovascular and neurodegenerative disease research pipelines. The method supports predictive confidence at early discovery and preclinical inflection points, informing portfolio decisions for CNS-targeted therapeutics.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of vascular responses to experimental perturbations in disease-relevant brain regions.
- Supports functional target validation by quantifying blood flow changes in response to candidate interventions.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular targets to physiological vascular outcomes.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vivo system for quantitative measurement of blood flow dynamics.
- Enables reproducible imaging of the same cortical region across multiple sessions for longitudinal studies.
- Supports assay standardization through controlled dye administration and imaging protocols.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling measurement of vascular function in models of stroke, neurodegeneration, and brain tumors.
- Facilitates continuity from discovery to preclinical validation by providing quantitative endpoints relevant to human disease.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by enabling robust, physiologically relevant readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a bridge between molecular target identification and functional validation in living systems.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on neurovascular mechanisms and target engagement.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible blood flow measurements for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of blood flow parameters across experimental groups and timepoints.
- Translational Research: Provides endpoints aligned with clinical imaging biomarkers of cerebral perfusion.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse CNS vascular studies across therapeutic programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neurovascular research.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions with quantitative, physiologically relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS therapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in small animal surgery, in vivo imaging, and quantitative analysis.
- Demands access to 2-photon microscopy, image acquisition software, and animal support infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of dye preparation, injection, and imaging protocols.
- Adaptation to other rodent models or brain regions may require protocol optimization.
- Imaging depth and dye clearance kinetics may limit applicability for certain experimental designs.
