Canlı FRET mikroskobu ve immünofloresan ile erken zebra balığı Noonan sendromu modellerinde ERK aktivite modülasyonunu değerlendirmek için etkili bir protokol

Hasta dizilemesini fonksiyonel genomiklerle ilişkilendirerek, varyant yorumunu ve preklinik ilaç testlerini desteklemek için karmaşık gelişimsel hastalıkların zebrafish modeli oluşturuyoruz. Geliştirilmiş FRET sensörlerine rağmen, Ras-MAPK sinyalinde yeterli stime-temporal hassasiyetle ince patojenik değişiklikleri tespit eden sağlam in vivo testler hâlâ eksiktir. Başlamak için, kalıplanmış %2 agaroz içeren özel mikroenjeksiyon plakasını E3 ortamında çalışma platformuna yerleştirin.

Mikroenjeksiyon sırasında yumurta hareketini kısıtlamak için döllenmiş genç zebrafish yumurtalarını plakada uygun yollara yerleştirin ve hizalamayın. İğneye iki mikrolitre enjeksiyon malzemesi ile mikro yükleyici pipet ile geri yükleyin. Her enjeksiyonu iğne ve mikroenjeksiyon cihazındaki embriyo kalitesine göre kalibre etmek için basınç ve zaman ayarlarını ayarlayın.

Çözeltiyi genç zebrafish embriyolarının tek hücreli aşamasına enjekte edin. Mikroenjeksiyonlu ergen embriyolarını kontrollü bakım koşullarında yetiştirin. Biriktirildikten sonraki üç saat içinde bulanık veya dejenerasyon gibi görünen yumurtaları temizleyin.

Döllenmeden yaklaşık dört saat sonra, standart bir floresans stereo mikroskop kullanılarak 465 ila 500 nanometre dalga boyu aralığına ayarlandı. Embriyoları floresan muhabir ifadesi açısından taran. FRET görüntülemesi için ergen pozitif balıkları seçin ve immünohistokimyasal değerlendirmeler için negatif kardeşleri ayırın.

Eşit sayıda embriyo havuzlarını altı kuyruklu bir plakanın farklı kuyularına yerleştirin. Tedaviye başlamak için, embriyoları DMSO veya istenen konsantrasyonda seyreltilmiş MEK olarak araç kontrolü içeren üç mililitre E3 ortamına batırın. Başlamak için, %1,5-2 düşük eriyen agaroz alikotunu bir Termomikserde 50 derece Celsius'ta eritin.

Çözüldükten sonra sıcaklığı yaklaşık 30 derece Celsius'a düşürün. Canlı görüntüleme için 35 milimetrelik cam taban kabin ortasına enjekte edilmiş tek bir genç pozitif embriyoyu yerleştirin. Fazla E3 ortamını çıkarın ve embriyonu hareketsiz hale getirmek için düşük eriyen agaroz damlası ekleyin.

Agarozun oda sıcaklığında polimerleşmesine izin verin. Toplamadan en az bir saat önce kuluçka kontrolörünü açın ve embriyo sağlığını korumak için sıcaklığı 28 derece Celsius olarak ayarlayın. İnkübatör stabil hale geldiğinde, embriyoyu içeren görüntüleme kabını örnek tutucuya yerleştirin ve numuneyi görselleştirmek için 10x kuru bir objektif kullanın.

Argon ion lazerini açın ve lazer gücünü %50'ye ayarlayın. Donanım Ayarlarında, görüntü almak için sekiz bit derinlik çözünürlüğü seçin. Sonra, Acquisition panelinde spektral algılama xy, gamma, lambda, z tarama modunu seçin ve format görüntüsünü 512 x 512 piksel, tarama hızı 400 hertz ve optik yakınlaştırmayı 0.75 olarak ayarlayın. Argon iyon lazerinin 458 nanometrelik lazer çizgisini aktive edin ve yoğunluk değerini %8,5'e ayarlayın. Sonra hibrit bir dedektör seçip hassasiyetini 500 kazanç değerine ayarlayın.

Dedektör çubuğundaki açılır menüden gök camgöbeği floresan proteini veya ECFP emisyon eğrisini seçin. YPET emisyon eğrisini göstermek için ikinci bir dedektör aktive edin. Sonra sarı floresans proteini YFP emisyon eğrisini seçin.

Canlı kayıtlara başlamak için, tespit imlecini en yoğun YFP sinyalinin aralığında konumlandırarak örneği görselleştirin. Z-Stack LASX penceresinde örnek kalınlığının başlangıç ve bitiş konumlarını ayarlayın. Gama tarama aralığı özelliklerini 460 nanometreden başlayıp tespit aralığının 570 nanometresinde sona erecek şekilde ayarlayın.

Tespit bant genişliğini beş nanometre ve tarama adım boyutunu beş nanometre olarak tanımlayın. z-stack edinmeye başlayın. Spektral sızmayı dışlamak için Yapılandırma penceresinde bulunan boya veritabanına CFP ve YFP için iki uyarlanmış referans emisyon spektrumunu ekleyin ve kaydedin.

Görüntüleme oturumundan çıkan spektral görüntü dosyasını seçin ve işlem penceresini açın. Sonra, boya ayırma aracında Spektral Boya Ayırma seçeneğini seçin ve boya ayırma ayarlarını yapılandırın. Diyalogun sol tarafındaki açılır menü listelerinde, ilk konumda yeni CFP emisyon spektrumunu ve spektrum veritabanından yeni YFP emisyon spektrumunu seçin.

Görüntülerin gama taramasında, en yüksek sinyal yoğunluğuna sahip görüntüyü tespit edin. Sonra z-tarama boyunca ilerleyerek marj bölgesindeki ilgi alanını vurgulayan optik bölümü seçin. Hayvan kutbunun kenar bölgesindeki ROI seçim modunu etkinleştirerek en iyi spektruma sahip alanı tanımlayın.

Ekran penceresinde ROI nişangahına tıklayın ve referans ROI'nin boyutunu ölçüm alanındaki 40 voxel olarak ayarlayın. İki ayrı kanalı içeren yeni oluşturulan dosyayı açın. Maksimum yoğunluk projeksiyonunu kullanarak üç boyutlu görüntü serisinden iki boyutlu bir projeksiyon görüntüsü oluşturun.

Süreç penceresinde, kanalları iki ayrı dosyaya ayırmak için kırpı seçin: kanal bir ve kanal iki kanal. Süreç penceresinde Görüntüleri Birleştir'i seçin, ardından kanal iki dosyasını seçip ilk seçeneğe ekleyin. Sonra kanal bir dosyayı seçip ikinci seçeneğe ekle.

Beş katlı bir yeniden ölçeklendirme ayarlayın ve oran işlemini seçin. Oran metrik görselini içeren yeni dosyayı oluşturmak için Uygula'ya tıklayın. Dosyayı veri analizi için kaydedin.

Spektral görüntüleme ve boya ayırma görüntü dosyalarını analiz için açık kaynak Fiji yazılımına aktarın. Fiji'de okuma ölçümleri için parametreleri Analyze and Set Measurements kullanarak yapılandırın. İlgi parametreleri olarak alan, entegre yoğunluk ve ortalama gri değeri seçin.

Araç çubuğundaki çokgen seçim aracını kullanarak, gastrula'nın marjina karşılık gelen ilgi alanını seçin. Sıralıca, ROI xy özelliklerini kaydetmek için Analyze, Tools ve ROI Manager seçeneklerine tıklayın. Seçilen bir yatırım getirisi ile ölçümler yapmak için Analiz ve Ölç seçeneğine tıklayın.

FRET'i, her ROI için CFP oran değerlerine göre bir çalışma sayfasında deneysel gruplar sütunlarda, ham değerleri sıralarda düzenleyin. Tek bir biyolojik çoğaltma için, her grubun bir sütunla tanımlandığı bir grup değişkeniyle bir sütun tablosu oluşturun. Gastrulasyonun sonunda, embriyoları oda sıcaklığında PBS'de hazırlanmış %4 paraldehit içine batırarak sabitleyin.

Fiksasyondan sonra embriyoları PBS ile birkaç kez yıkayın. Pastor pipeti kullanarak, embriyoları taze PBS içeren 12 kuyruklu bir plakanın tek bir kuyusunda yanlara yönlendirin. 2.7x büyütme objektefiyle stereo mikroskop kullanarak, 0.63x tarama hedefi ve 8.6 zoom faktörüyle görüntüleri parlak alan modunda yakalayarak oval şeklin varlığını değerlendirir.

Yakalanan embriyo görüntüsünü Fiji yazılımına aktarın. Embriyonun eksenlerinin uzunluğunu ölçmek için, araç çubuğundan düz aracı seçip Analyze'a tıklayın, ardından Ölçüt'e tıklayın. Seçilen ölçümleri yaptıktan sonra, bunları ROI yöneticisi listesine ekleyin ve ROI dosyasını kaydedin.

Verileri bir çalışma sayfasına aktarın. Eksenlerin oranını, ana eksenin uzunluğunu küçük eksenin uzunluğuna bölerek hesaplayın. Ortalamayı, ortalamanın standart sapmasını veya farklı kopyaların ortalamasının standart hatasını hesaplayın.

Zebrafish'teki canlı FRET boru hattımız, patojenik ERK sinyal aktivasyonunun erken hassas tespitini, varyant yorumunu ve MEK inhibitörü verimlilik testini destekler.