Pankreatik Duktal Hücre Hattında pH Değişiklikleri ile Onkogen Ekspresyon Analizi

AIG hastanelerinde, azalmış pankreas duktal sekresyonlarının ve düşük pH'ın pankreas duktal hücrelerindeki gen ekspresyonlarını nasıl etkilediğini araştırıyoruz, özellikle onkogenlere odaklanarak, asidik mikro ortamlara hücresel adaptasyon olasılığını araştırıyoruz. Buradaki zorluk, pankreas tümörlerinin heterojenliğidir ve bu da tedaviyi ve deneysel yaklaşımları zorlaştırır. Bu nedenle, düşük pH koşulları altında pankreas duktal hücrelerinin RNAC analizini yaptık ve pankreas duktal hücrelerinde asidik ortam ile onkogen ekspresyonu arasındaki potansiyel bağlantıları vurgulayan üç onkogenin ekspresyonunun arttığını bulduk.

Çalışmamız, düşük pH koşulları altında onkogen ekspresyonuna ışık tutmuştur ve bu sistem, inflamasyon koşulları altında pankreas duktal adenokarsinomunu incelemedeki araştırmamızı ilerletebilir. Bu nedenle bu çalışmanın gelecekteki kapsamı, kronik pankreatit gibi inflamatuar koşullar altında tümörlerin başlangıcında artmış onkogen ekspresyonlarının rolünü değerlendirmektir. Başlamak için, insan normal pankreas duktal hücre hattını temin edin.

Hücreleri bir su banyosunda 37 santigrat derecede çözdürün. Şimdi taze hazırlanmış komple ortamı bir şırınga filtresinden süzün. Yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe altı mililitre tam ortam ekleyin.

Daha sonra çözülmüş hücre süspansiyonunu tüpe aktarın ve iyice karıştırın. Süspansiyonu altı dakika boyunca 1.800 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hafifçe karıştırmadan önce pelete bir mililitre kültür ortamı ekleyin.

Daha sonra, 60 milimetrelik bir Petri kabına dört mililitre tam ortam ekleyin. Ardından hücre süspansiyonunu şişeye damla damla pipetleyin. Kültürü% 5 karbondioksit takviyesi altında 37 santigrat derecede inkübe edin.

Kültür ortamının pH'ını değiştirmek için önce pH değerleri 6.0, 6.5 ve 7.0 olan 100 mililitre 0.5 molar sodyum fosfat tampon stok çözeltileri hazırlayın. PH'ı bir pH metre ile kontrol edin ve bir molar hidroklorik asit veya bir molar sodyum hidroksit kullanarak ayarlayın. Daha sonra süzün, 0.45 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak tamponları laminer bir hava akımı başlığında sterilize edin.

Daha sonra, farklı pH'lı ortamlar hazırlamak için ilgili pH'da 20 mililitre steril 0.5 molar sodyum fosfat tamponunu 80 mililitre kültür ortamına ekleyin. Değiştirilmiş pH'lı ortamı, %85 ila 90 birleşik insan pankreas duktal hücrelerine ekleyin. Parlak alan mikroskobu altında altı saat boyunca bir saatlik aralıklarla morfolojik değişiklikleri gözlemleyin.

RNA'yı kültürden izole etmek için önce kültür ortamını aspire edin ve hücreleri bir mililitre PBS ile durulayın. 60 milimetrelik kabı buzun, ardından 60 milimetrelik tabağa bir mililitre PBS'yi yerleştirin ve hücreleri bir hücre kazıyıcı ile kazıyın. Şimdi süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın.

10 dakika boyunca 8.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Daha sonra, pelete beta-merkaptoetanol içeren 600 mikrolitre lizis tamponu ekleyin. Süspansiyonu buz üzerinde beş ila 10 dakika yukarı ve aşağı pipetleyin.

Lizata eşit hacimde %70 etanol ekleyin ve iyice karıştırmak için süspansiyonu pipetleyin. Çözeltiyi bir silika membran kolonuna aktarın. Daha sonra sütunu 30 saniye boyunca 8.000 G'den fazla santrifüjleyin ve akışı atın.

Ardından, numuneye 500 mikrolitre yıkama tamponu ekleyin ve tekrar santrifüjleyin. Boş tüpü bir dakika boyunca 8.000 G'den fazla santrifüjleyin ve son olarak, kolona 30 ila 50 mikrolitre nükleaz içermeyen su ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir inkübasyondan sonra, sütunu beş dakika boyunca 8.000 G'den daha yüksek hızlarda tekrar santrifüjleyin.

Normal bir ortamda tutulan hücrelere kıyasla asidik ortamda hücre boyutunda önemli bir azalma ve sünek hücrelerin büzülmesi gözlenmiştir. Hücre ölümündeki en belirgin değişiklikler, altı saatlik inkübasyondan sonra meydana geldi ve hücre sayısında daha fazla azalma ve 22 saatte hücresel stres belirtileri görüldü. Yukarı regüle edilmiş genlerin sayısı 148 gen ile pH 6.5'te en yüksekti, bunu 109 gen ile pH yedi ve 90 gen ile pH altı izledi.

Aşağı regüle edilmiş genler, pH altıda 20, pH 6.5'te 14 ve pH yedide 23 ile daha azdı. Üç onkogen, LCK, FGR ve ASAP üçü, test edilen tüm pH seviyelerinde yukarı regüle edildi ve bu da asidik koşullar altında hücre çoğalmasında bir rol olduğunu düşündürdü.