Çiğ ve pişirmeye hazır tavuk ürünlerinde salmonella'yı ölçmek için modifiye edilmiş en olası sayı testi

Araştırmamız, gıda kaynaklı patojenler için hızlı tespit, miktar tayini ve karakterizasyon teknolojileri geliştirerek, gerçek dünya ortamlarında bir kontaminasyonu tanımlayarak gıda güvenliğini artırabilecek hassas yöntemlere odaklanmaktadır. Temel zorluklar arasında, düşük maliyetli, ancak ölçeklenebilir çözümlerle hızlı hassas algılama ve karmaşık matrisler elde etmek yer alır. Ayrıca, yanlış pozitifleri azaltma ve çeşitli test ortamlarıyla uyumluluğu artırma konusundaki zorlukları da ele alıyoruz.

Gıda güvenliği için bu, çeşitli gıda matrislerinde düşük konsantrasyonlarda patojenlerin doğru bir şekilde tespit edilmesi anlamına gelir. Protokolümüz, gıda ürünlerindeki kontaminasyon seviyesi için deterministik değerler sağlamak üzere salmonella'nın yaygınlığı, tespiti ve miktarının belirlenmesi arasındaki boşluğu ele almaktadır. Süreç, FSIS protokollerinde kullanılan doğrulanmış tahlilleri içerdiğinden ve ek patojenleri ve gıda matrislerini barındıracak kadar esnek olduğundan minimum düzeyde yıkıcıdır.

Başlamak için, yerel perakendecilerin taze et bölümünden alınan kıyma tavuğunu çalışan bir platforma yerleştirin. Eti aseptik olarak 25 gramlık numunelere bölün. Yerel perakendecilerin dondurulmuş gıda bölümünden pişirmeye hazır tavuk ürünleri satın alın ve aseptik olarak 25 gramlık numunelere bölün.

Bir beyin kalp infüzyon burgu plakası üzerinde çizgi salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 14028. Plakayı gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, 25 mililitre beyin kalp infüzyon suyunu bir koloni taze yetiştirilmiş salmonella ile aşılayın.

100 RPM'de çalkalama ile gece boyunca 37 santigrat derecede aerobik olarak kültür yetiştirin. Bir dizi on kat seyreltme hazırlamak için, 0.5 mililitre kültürü 4.5 mililitre tamponlu peptit suyuna veya BPW'ye aktarın ve iyice karıştırın. Daha sonra, hazırlanan seyreltmeden 0.5 mililitreyi, sonraki her seyreltme için 4.5 mililitre BPW'ye aktarın.

Daha sonra, 25 gram ışınlanmış öğütülmüş tavuğu aseptik olarak steril mide torbalarına aktarın. Numuneyi, istenen kültür seyreltme konsantrasyonunun bir mililitresi ile aşılayın. Steril bir hücre yayıcı kullanarak, aşıyı tavuğun yüzeyine eşit olarak nazikçe dağıtın ve bir saat boyunca dört santigrat derecede beklemelerine izin verin.

Işınlanmış öğütülmüş tavuk örneklerini salmonella kültürü ile bir saat inkübe ettikten sonra, istenen örnek/ortam oranını elde etmek için her bir örnekle 225 mililitre BPW ekleyin. Tavuk örneklerini mideyi kullanarak normal hızda 120 saniye boyunca homojenize edin. 50 mililitrelik bir pipet kullanarak, midenin filtrelenmiş tarafından sıvıyı dikkatlice çıkarın ve iki steril santrifüj şişesine bölün.

Numuneleri 10.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Steril bir spatula kullanarak hücre peletini üç mililitre BPW'de yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş pelete 12 mililitre BPW ekleyin ve steril bir spatula ile karıştırarak iyice karıştırın.

Her iki santrifüj şişesinin içeriğini tek bir şişede birleştirin. Sekiz kopya oluşturmak için 48 kuyucuk bloğunun birinci sütunundaki her bir oyuğa üç mililitre yeniden askıya alınmış numune ekleyin. Sekiz kanallı bir pipet kullanarak bir ila altıncı sütunlar boyunca bir dizi on kat seyreltme hazırlamak için, her bir oyuktan 0,3 mililitre numuneyi bir sonraki sütunda 2,7 mililitre BPW'ye ekleyin ve iyice karıştırmayı sağlayın.

Blokları gece boyunca 37 santigrat derecede 100 RPM'de çalkalayarak inkübe edin. Ertesi gün, çok kanallı bir pipet kullanarak, her seyreltmeden yedi mikrolitre kültürü dörde altı ızgarada beyin kalp infüzyon burgu plakalarına yerleştirin. Plakaları 18 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe etmeden önce 10 dakika kurumaya bırakın.

Kuluçkadan sonra, burgu plakalarını inceleyin, en az bir koloniyi pozitif olarak işaretleyin ve büyümeyi negatif olarak işaretlemeyin. Bir çalışma sayfasına seyreltme sayısını ve seyreltme faktörünü girin. Numunenin uygun hacmini veya ağırlığını girin.

Ardından çoğaltma sayısını belirtin ve pozitif test edilen örnek sayısını girin. Basit maksimum olasılık çözünürlük yöntemini kullanarak açıklamalı pozitif ve negatif sonuçları analiz etmek için sonuçları hesapla'ya tıklayın. Başlamak için, tavuk örnekleri ile aşılanmış salmonella kültürü için 48 kuyulu MPN bloğunu kurun.

Kültürleri 48 oyuklu bir blokta birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Her kültürün 200 mikrolitresini 96 oyuklu bir PCR plakasına aktarın. Plakayı kapatın ve 10 dakika boyunca 6.600 G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve pelete 20 mikrolitre DNA ekstraksiyon kiti reaktifi ekleyin. Peletleri yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Tekrar plakayı kapatın ve 99 santigrat derecede 10 dakika ısıtın, ardından 20 santigrat dereceye kadar soğutun.

Santrifüjlemeden sonra, QPCR karışımını belirlenen protokole göre hazırlamak için iki mikrolitre süpernatan kullanın. Aşağıdaki koşulları kullanarak gerçek zamanlı PCR'yi gerçekleştirin. PCR'den sonra sonuçları dışa aktarın ve döngü eşik değerleri 30'a eşit veya daha küçük olan kuyucukları pozitif ve 30'dan büyük negatif olarak kabul edin.

Kültürleri 48 oyuklu bir blokta birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Her numunenin 20 mikrolitresini moleküler tespit tahlili salmonella kiti sağlanan lizis tüpüne aktarın. Numuneleri 100 santigrat derecede 15 dakika ısıtın.

Daha sonra numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Her lizis tüpünden 20 mikrolitre lizatı bir reaktif tüpüne aktarın ve reaktif tüplerini tutucuya yükleyin. Reaktif tüplü tutucuyu moleküler algılama sistemi cihazına ekleyin.

Moleküler algılama sistemi tahlili için yazılım ayarlarını yapılandırın. Tahlili çalıştırın ve raporu analiz için dışarı aktarın. MDS Çalıştırma raporu, olumlu veya olumsuz olan ayrıntılı çıktı bilgileri sağlar.