Tek Hücreli Mikrolitre Damlacık Kültürü Omik Sistemini Kullanarak Otomatik ve Yüksek Verimli Mikrobiyal Monoklonal Yetiştirme ve Toplama

Bu araştırma, mikrobiyal izolasyonu, kültivasyonu ve monoklonal taramayı geliştirmek için otomatik bir platform kullanarak mikrobiyal kültür omiklerini araştırıyor. Amaç, insan bağırsağı, mikrobiyom ve uygulamalarının anlaşılmasını geliştirmektir. Mikrobiyom araştırmalarını ilerleten teknoloji uzmanları, mikroakışkanların düşürülmesini, otomatik suş izolasyonu ve tarama platformlarını, makine öğrenimi algoritmalarını ve yüksek gergin kültür omikleri ve mikrobiyom analizi için monoklonal dağıtıcıları içerir.

Orta hücre sistemi, mikrogörüntülemeyi, monoklonal izolasyonu ve renklendirmeyi önemli ölçüde geliştirir, geleneksel yöntemlere kıyasla neredeyse iki kat daha fazla klon üretir, böylece bağırsak mikroview kültür karışımındaki araştırma yeteneğini geliştirir. Bu protokol, düşük maliyetli, yüksek destekli, mikrobiyal tarama platformunun ihtiyacını ele alarak, kültür karışımı araştırmaları için verimlilik ve puanlama kabiliyetindeki geleneksel yöntem sınırlamalarının üstesinden gelir. Laboratuvarımız, teknolojik uygulamaların kapsamını genişletmek için damlacık ayırma ve birleştirme gibi ek damlacık manipülasyon tekniklerinin entegrasyonuna daha fazla odaklanacaktır.

Başlamak için, MISS hücresinin damlacık üretimi ve yetiştirme odası kapısını açın. Mikro boru ve damlacık üreten mikroakışkan çip için koruyucu kapağı dikey olarak çıkarın. Tek kullanımlık bir şırınga kullanarak, haznenin içindeki nemlendiriciye 10 mililitre steril damıtılmış su ekleyin ve koruyucu kapağı yeniden takın.

Mikro boru ve damlacık oluşturma mikroakışkan çipinin steril ambalajını açın ve dikey olarak doğrudan yetiştirme odasının üzerine yerleştirin. Ardından yazılım arayüzünde kuruluma tıklayın. Onay açılır penceresi göründüğünde, kurulumu başlatmak için evet'e tıklayın.

Hava kabarcığı çıkarıcıyı çıkarın ve haznedeki hava kabarcığı çıkarıcı yerleşimine baş aşağı sabitleyin. Hava kabarcığı çıkarıcının damlacık çıkış borusunu altındaki sıkıştırma valfine takın. Damlacık algılama ve toplama odasına giden tüm yol boyunca yönlendirin.

Haznenin kapısını açtıktan sonra, algılama tüpünü dikey olarak algılama soketine yerleştirin. Algılama tüpünün tam olarak yerleştirildiğinden emin olun. Algılama tüpünü sabitleyen vidayı saat yönünde sıkın.

Tam yerleştirmeyi ve emniyete almayı onayladıktan sonra, odanın kapısını kapatın. L1'den L10'a kadar etiketlenmiş mikroakışkan çipten gelen 10 silikon tüpün her birini karşılık gelen numaralı kelepçe valflerine bağlayın. Ardından, uygun bağlantıları izleyerek mikroakışkan çipten gelen hızlı konektörü omik sistemdeki ilgili bağlantı noktasına bağlayın.

Çip kurulumu tamamlandıktan sonra, damlacık borusu sıkıştırma valfi açılır mesajını içeren bir açılır pencere belirir. Mikro boru ve damlacık oluşturma çipi kurulumu tamamlandığında Tamam'a tıklayın. Tüm tüplerin ilgili kelepçe valflerine doğru şekilde takıldığından emin olduktan sonra Tamam'a tıklayın.

Başlatmayı gerçekleştirmeden önce, seçici mod, inkübasyon sıcaklığı, inkübasyon süresi, karıştırıcı hızı, OD algılama dalga boyu ve floresan algılama için uyarma ve emisyon dalga boyu gibi ilgili parametreleri yapılandırmak için ayar arayüzüne tıklayın. Ana arayüze gidin ve başlat'a tıklayın. Onay açılır penceresi görünür, IC sisteminin enjeksiyon pompası, sıcaklık ayarları, atık sıvı boşaltma testi, tarama modülü ve damlacık algılama modülü dahil olmak üzere bileşenlerini kendi kendine kontrol etmesine izin vermek için evet'e tıklayın.

Başlatma tamamlandıktan sonra, açılır pencereden Tamam'a tıklayın. Numuneyi hazırlamak için, mikrobiyal numuneyi alın ve 40 mililitrelik bir numune süspansiyonu elde etmek için mililitrede yaklaşık 50 hücrelik bir konsantrasyon elde etmek için ilgili ortamla seri seyreltme gerçekleştirin. Daha sonra numune şişesinin kapağını sökün ve seyreltilmiş dışkı süspansiyonunu numune ekleme konumuna kadar manyetik bir karıştırma çubuğu ile şişeye dökün.

Kapağı vidalayın ve iyice sıkın. Ardından, numune yükleme işlemini tamamlamak için hızlı konektör A'yı hızlı konektör B'ye takın. Numune şişesini belirlenen konuma yerleştirdikten sonra, numune şişesinden A ve B hızlı konektörlerini ayırın.

Numune şişesinin hızlı bağlantı A'sını omic sistemdeki O3 bağlantı noktasına bağlayın. Mikroakışkan çip üzerindeki C3 konektörünü hızlı konektör B'ye bağlayın ve odanın kapısını kapatın. Yazılımın ana arayüzünde, oluşturulacak istenen sayıda damlacık hortumunu seçin ve tek hücreli damlacık üretimini başlatmak için üret'e tıklayın.

Damlacık oluşturma işleminin tamamlandığını gösteren açılır pencereyi bekleyin ve Tamam'a tıklayın. Üç konektördeki kelepçeyi kapatın ve numune şişesini çıkarın. Yazılımın ana arayüzünde, damlacık üretimi sırasında kullanılanla aynı damlacık boru numarasını seçin.

Kültür'ü tıklayın. Yetiştirme süresini ve sıcaklığını onaylayın ve işleme başlayın. Damlacık yetiştiriciliğinin tamamlandığını gösteren açılır pencereyi bekleyin.

Ultraviyole UV ışığını açmak için omik sistemdeki UV düğmesine basın. Damlacık algılama ve toplama haznesini kapatmadan önce 30 dakika ışınlayın. Süper temiz bir tezgahta, damlacık toplama için kullanılan 96 kuyulu plakanın tümünü açın ve bunları aşağıdan yukarıya doğru sırayla numaralandırarak kapaksız olarak üst üste istifleyin.

Üst kuyu plakasının bir kapakla kapatıldığından emin olun. Damlacık algılama ve toplama odasının kapısını açın ve kuyu plakalarını belirlenen konumlara yerleştirin. Kapağı üst kuyu plakasından çıkarın, ardından hazne kapısını kapatın.

İkincil sterilizasyonu gerçekleştirmek için omik sistemdeki UV ışığını 30 dakika boyunca tekrar açın. Ardından, hava kabarcığı çıkarıcıyı yerleştirme konumundan çıkarın. Kapağı sökün ve kelebek şeklindeki vidayı kapaktan çıkarın.

Hava kabarcığı çıkarıcıya 200 mililitre hava kabarcığı giderme yağı dökün. Kapağı sıkıca sabitleyin, ardından hava kabarcığı çıkarıcıyı belirlenen yerine baş aşağı sabitleyin. Ev arayüzünde, sıralama için damlacık tüpünü seçin.

Sıralama'yı tıklayın. Toplanacak kuyucuk plakalarının sayısını girin ve sıralama işlemini başlatın. Damlacık optik yoğunluğunun veya floresan değerlerinin gerçek zamanlı ölçümleri için proses görüntüleme alanını gözlemleyin.

OD değerini kontrol etmek için yaklaşık 20 ila 30 damlacığı analiz edin. Çoğu damlacığın OD'si yaklaşık 0,2 ise, alt OD eşiğini 0,5'e ve üst OD eşiğini dörde ayarlayın. Sistem, bu aralıktaki damlacıkları otomatik olarak 96 kuyulu plakaya toplayacaktır.

Damlacık sıralama ve toplama işleminin tamamlandığını gösteren açılır pencereyi bekleyin ve ardından Tamam'a tıklayın. Damlacık algılama ve toplama odasının kapısını açın. Kuyu plakası kapağını üst kuyu plakasına yerleştirin ve plakaları birlikte çıkarın.

Toplanan damlacık sinyali verilerini kaydetmek için verileri dışa aktar'a tıklayın. Isı haritası'na tıklayın. Damlacık toplama veri dosyasını seçin ve mikroplaka formatında görüntülenen OD'yi gözlemleyin.

Bu OD değerlerini, renk yoğunluğunun kuyulardaki OD dağılımına karşılık geldiği ve net ve sezgisel bir temsil sağladığı bir ısı haritası olarak görselleştirin. Omik sistemden, solid plak yönteminden ve ilk dışkı örneğinden elde edilen insan bağırsak mikrobiyotasının tür çeşitliliği aile düzeyinde karşılaştırıldı. 34 mikrobiyal aile, hem katı plaka yöntemi hem de gösterilen omik yöntemi ile zenginleştirildi ve omik sistem ayrıca dört aileyi zenginleştirdi.

Omik sistem ayrıca düşük bolluktaki ailelerin bazılarını etkili bir şekilde zenginleştirdi. Cins düzeyinde, her iki yöntem de 74 mikrobiyal cinsi zenginleştirirken, MISS hücre yöntemi ayrıca 13 cinsi zenginleştirdi. Ayrıca, başlangıçta düşük bollukta bulunan iki cins, OMIC sistemi kullanılarak etkili bir şekilde zenginleştirildi.

Bu sonuçlar, MISS hücre kültürü yönteminin, düşük oranlarda bulunan veya orijinal mikrobiyal süspansiyonda düşük büyüme performansına sahip olan suşlar için daha iyi büyüme koşulları sağladığını gösterdi.