FEN1 Nükleaz Aktivitesinin Floresan Bazlı Tespiti ve Küçük Moleküllü İnhibitörlerin Taranması

FEN1 nükleaz aktivitelerini tespit etmek ve küçük moleküllü inhibitörleri taramak için floresan bazlı bir yöntem geliştirdik, böylece teşhis ve hedefe yönelik terapötik araştırmaları ilerlettik.

Mevcut ifade zorlukları, geleneksel yöntemlerin karmaşıklığı ve güvenlik endişelerinin yanı sıra mevcut floresan bazlı teknikler için gereken yüksek maliyet ve özel ekipmanı içerir.

Bu protokol, geleneksel radyolojik yöntemin ve yüksek maliyetli floresan tekniklerinin eksikliğini gidererek daha güvenli, verimli ve kullanımı kolay bir tespit çözümü sağladı.

Laboratuvarımız, kanser tedavisinde FEN1 inhibitörlerinin in vivo uygulamalarını ve mekanizmalarını araştırmak için yüksek verimli bir tarama platformunun optimizasyonuna odaklanacaktır.

[Eğitmen] Başlamak için, FEN1'in spesifik bölünme aktivitesine dayalı olarak DNA oligonükleotid zincirleri tasarlayın. Tek sarmallı DNA oligonükleotitlerini bir tavlama tamponunda karıştırın. Toplam hacim 50 mikrolitre olacak şekilde 10 mikrolitre tavlama tamponu ve deiyonize su ekleyin. Daha sonra reaksiyon karışımını metal bir banyoda 100 santigrat derecede bir dakika ısıtın. Tüpü hemen 72 santigrat dereceye aktarın ve 10 dakika inkübe edin. Ardından, ısı kaynağını kapatın ve tam çift sarmallı DNA substratını oluşturmak için çözeltinin kademeli olarak oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. FEN1 nükleaz aktivite tahlili için, önce reaksiyon tamponunda iki mikrolitre DNA substratını FEN1 nükleaz ile birleştirin. Reaksiyon karışımını metal bir banyoda 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 20 mikrolitre 2X sonlandırma tamponu ekleyin. Daha sonra, sonlandırılmış numunenin 20 mikrolitresini önceden hazırlanmış %12 denatüre edici poliakrilamid jel üzerine yükleyin. Jeli 60 dakika boyunca 100 voltta elektroforez edin. Tamamlandığında, elektroforez sonuçlarını bir floresan görüntüleme sistemi altında görselleştirin. Bir pipetle iki mikrolitre dimetil sülfoksiti 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Tüpe iki mikrolitre FEN1 nükleaz ve 10 mikrolitre 2X reaksiyon tamponu ve altı mikrolitre deiyonize su ekleyin. Çözeltiyi iyice karıştırın, ardından buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 20 mikrolitrelik bir nihai reaksiyon hacmine ulaşmak için iki mikrolitre DNA substratını pipetleyin. Daha sonra, dimetil sülfoksit içinde bir molar stok çözeltisinden iki kat seri seyreltme gerçekleştirerek FEN1 nükleaz inhibitörü FEN1-IN-4'ün çalışan bir seyreltmesini hazırlayın. Her biri iki mikrolitre FEN1 nükleaz ve seyreltilmiş FEN1-IN-4 inhibitörünü yeni bir 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Ardından, 10 mikrolitre 2X reaksiyon tamponu ve dört mikrolitre deiyonize su pipetleyin. Yavaşça karıştırın ve karışımı buz üzerinde 10 dakika inkübe edin. Şimdi, son hacmi 20 mikrolitreye çıkarmak için tüpe iki mikrolitre DNA substratı ekleyin. Reaksiyon karışımını metal bir banyoda 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından, 20 mikrolitre sonlandırma tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Yaklaşık 45 kilodaltonluk berrak bir protein bandı, FEN1 nükleazın indüklenmiş ekspresyondan başarılı bir şekilde saflaştırıldığını doğruladı. Floresan etiketli çift sarmallı DNA substratı 80 kilodaltonda ortaya çıktı ve 59 kilodaltondaki tek sarmallı substrata kıyasla başarılı sentezi doğruladı. FEN1 nükleaz, 80 nükleotid, çift sarmallı DNA substratını doza bağlı bir şekilde parçaladı ve mikrolitre başına 0.5 mikrogramda tam bölünme gözlendi. FEN1-IN-4 bileşiği, 80-nükleotid bandının tutulmasıyla gösterildiği gibi, çift sarmallı DNA substratının FEN1 tarafından bölünmesini önemli ölçüde inhibe etti. FEN1-IN-4, FEN1 nükleaz aktivitesini, 14.03 mikromolar yarı maksimum inhibitör konsantrasyon ile konsantrasyona bağlı bir şekilde azalttı.