Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir

[Anlatıcı] Nature Methods'un 2024 Yılın Yöntemi olarak adlandırılan uzamsal proteomik kullanılarak, bağışıklık hücrelerinin kesin konumları ve hücre-hücre etkileşimleri dokular içinde haritalandırılabilir. Bu, klinik sonuçlarla bağlantılı mekansal kalıpları ortaya çıkarır. Yüksek endojen floresansa sahip karmaşık antikor panelleri ve görüntüleme dokuları oluşturmak, IBEX ve diğer floresan mikroskobu teknikleri için önemli zaman, kaynak ve uzmanlık zorlukları ortaya çıkarmaktadır. IBEX kullanılarak, yüksek riskli foliküler lenfoma hastalarında ve Human Cell Atlas meslektaşlarıyla birlikte tümöre özgü özellikler belirlendi. İnsan timusunun kapsamlı bir uzamsal haritası oluşturuldu. Çeşitli mikobakteriyel pulmoner patolojiler arasında bağışıklık hücresi bileşimi, uzamsal etkileşimler ve sitokin üretim farklılıkları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu protokol bu boşluğu dolduruyor. Bu protokol, uzamsal analiz için antikor sinyalini korurken, özellikle zor FFPE örneklerinde geniş spektrumlu doku otofloresansını önemli ölçüde azaltmak için düşük maliyetli, uyarlanabilir bir fotoirışınlama yöntemi sunar. Başlamak için, antijen alımını tamamladıktan sonra slaytları doku ile PBS'ye batırın. PBS'den bir slaytı çıkarın ve dokuya dokunmadan tüm fazla tamponu dikkatlice kurutmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Hidrofobik bir kalemle, slayttaki doku bölümünün etrafına bir kenarlık çizin. Kalan slaytlar için işlemi tekrarladıktan sonra hidrofobik bariyerlerin 10 dakika kurumasını bekleyin. Ardından, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak, dokuya doğrudan dokunmadan PBS'yi doku bölümünden uzaklaştırın. Şimdi slayta 200 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin ve nem odasını kapatın. Hazneyi, sıcaklık düzenleme mekanizmasına sahip, ısıtmasız bilimsel bir mikrodalgaya yerleştirin ve önceden belirlenmiş programı beş döngü çalıştırın. Bloke edici inkübasyon sırasında, birincil antikor boyama solüsyonunu 1 kancalarla ve Fc bloğu içeren bloke edici tamponu hazırlayın. Antikorları birleştirin ve kokteyli yavaşça karıştırın. Mikrodalga döngüsü tamamlandığında, slayt odasını çıkarın ve açın ve dokuya dokunmadan blokaj tamponunu slayttan fitilleyin. Ardından, slayta 200 mikrolitre birincil antikor boyama solüsyonu 1 ekleyin. Odayı mikrodalgaya geri koyun ve birincil antikor programını yaklaşık 30 dakika boyunca tekrar yürütün. Birincil antikor etiketlemesi tamamlandıktan sonra, slaytı dikey olarak tutun. Slaytı yıkamak için, dokuya 1.000 mikrolitre PBS pipetleyin ve akmasına izin verin. Fazla PBS'yi fitilleyin ve slaytı nem odasında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %1 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabitledikten sonra, slaytı üç ila beş kez 1.000 mikrolitre PBS ile iyice yıkayın ve fotoışınlama adımına kadar doku üzerinde bir PBS tabakası bırakın. Fotoışınlama kutusunu hazırlamak için 150 watt'lık bir LED lamba, 40 watt'lık bir RGBW projektör LED lamba, 75 litre veya daha fazla kapasiteli büyük bir plastik kap.71 litre veya daha fazla, taze PBS ve bir Petri kabı. Şimdi slaytı tamamen batırmak için Petri kabını 1x PBS ile doldurun. Lambalardan gelen ısıyı en aza indirmek için fotoışınlama prosedürünü soğuk bir odada gerçekleştirin. Ardından slaytı Petri kabına yerleştirin ve tamamen PBS'ye batırıldığından emin olun. Ardından, 40 watt'lık lambayı, ışık kaynağı slayta doğru bakacak şekilde doğrudan Petri kabının üzerine yerleştirin ve lambayı kırmızı ışık moduna ayarlayın. Son olarak, hem 150 watt'lık hem de 40 watt'lık lambaları açın ve tüm kurulumu plastik kap kapağıyla kapatın. İki saat sonra lambayı yeşil ışığa getirin ve 16 saat inkübe edin. Boya inaktivasyon protokolüyle uyumlu en parlak floroforlar tanımlandı ve sinyal tespitini geliştirmek için düşük eksprese edilen işaretleyicilerle eşleştirildi. Otofloresan, fotoışınlamadan sonra ve daha uzun görüntüleme dalga boylarında önemli ölçüde azaldı. Yüksek oranda eksprese edilen yapısal belirteçleri, alfa-düz kas aktini ve pan sitokeratini hedefleyen doğrudan konjuge antikorlar, 750 nanometrede yakın kızılötesi kanalda değiştirilir. Arka plan sinyali, boyanmamış bir referans görüntüsü ve SimpleITK aritmetiği kullanılarak hesaplamalı olarak çıkarıldı ve gerçek sinyaller eşikleme yoluyla geliştirildi. IBEX ile boyanmış kesitlerin tüm slayt görüntülemesinde nekrotik çekirdekli granülomlar ve CD15 pozitif nötrofiller görüldü. Anti-antijen 85B antikoru kullanılarak granülom nekrotik çekirdeğin yakınında Mycobacterium tuberculosis veya tüberküloz dışı mikobakteriler tespit edildi. Granülomla ilişkili lenfoid doku, CD20-pozitif B hücreleri, CD4-pozitif T hücreleri, birkaç CD8-pozitif T hücresi ve akciğerdeki tüm bağışıklık hücrelerinin CD45 etiketlemesini içeriyordu. IBEX görüntüleme ayrıca bronşiyal epitel hücreleri, arteriyel düz kas ve CD68 pozitif makrofajlar dahil olmak üzere akciğer anatomik özelliklerinin görselleştirilmesini sağladı.