Yinelemeli Beyazlatma için Optimize Edilmiş İş Akışı, Yüksek Otofloresan Klinik Numunelerin Çok Yönlü Görüntülemesini Genişletir
11 Temmuz 2025
Manuel IBEX yöntemi ile düşük maliyetli, çok yönlü bir foto ışınlama tekniğinin uygulanması, önemli doğal otofloresan ile insan dokusunun en iyi şekilde görüntülenmesini sağlar. Bu protokol, ters çevrilmiş bir mikroskop, yaygın olarak bulunan reaktifler ve görüntü hizalama ve işleme için açık kaynaklı yazılım kullanılarak arşivlenmiş klinik örneklerden çoğullanmış, tam slayt görüntülerinin nasıl elde edileceğini ayrıntılarıyla açıklar.
[Anlatıcı] Nature Methods'un 2024 Yılın Yöntemi olarak adlandırılan uzamsal proteomik kullanılarak, bağışıklık hücrelerinin kesin konumları ve hücre-hücre etkileşimleri dokular içinde haritalandırılabilir. Bu, klinik sonuçlarla bağlantılı mekansal kalıpları ortaya çıkarır. Yüksek endojen floresansa sahip karmaşık antikor panelleri ve görüntüleme dokuları oluşturmak, IBEX ve diğer floresan mikroskobu teknikleri için önemli zaman, kaynak ve uzmanlık zorlukları ortaya çıkarmaktadır. IBEX kullanılarak, yüksek riskli foliküler lenfoma hastalarında ve Human Cell Atlas meslektaşlarıyla birlikte tümöre özgü özellikler belirlendi. İnsan timusunun kapsamlı bir uzamsal haritası oluşturuldu. Çeşitli mikobakteriyel pulmoner patolojiler arasında bağışıklık hücresi bileşimi, uzamsal etkileşimler ve sitokin üretim farklılıkları hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu protokol bu boşluğu dolduruyor. Bu protokol, uzamsal analiz için antikor sinyalini korurken, özellikle zor FFPE örneklerinde geniş spektrumlu doku otofloresansını önemli ölçüde azaltmak için düşük maliyetli, uyarlanabilir bir fotoirışınlama yöntemi sunar. Başlamak için, antijen alımını tamamladıktan sonra slaytları doku ile PBS'ye batırın. PBS'den bir slaytı çıkarın ve dokuya dokunmadan tüm fazla tamponu dikkatlice kurutmak için tüy bırakmayan bir mendil kullanın. Hidrofobik bir kalemle, slayttaki doku bölümünün etrafına bir kenarlık çizin. Kalan slaytlar için işlemi tekrarladıktan sonra hidrofobik bariyerlerin 10 dakika kurumasını bekleyin. Ardından, tüy bırakmayan bir mendil kullanarak, dokuya doğrudan dokunmadan PBS'yi doku bölümünden uzaklaştırın. Şimdi slayta 200 mikrolitre blokaj tamponu ekleyin ve nem odasını kapatın. Hazneyi, sıcaklık düzenleme mekanizmasına sahip, ısıtmasız bilimsel bir mikrodalgaya yerleştirin ve önceden belirlenmiş programı beş döngü çalıştırın. Bloke edici inkübasyon sırasında, birincil antikor boyama solüsyonunu 1 kancalarla ve Fc bloğu içeren bloke edici tamponu hazırlayın. Antikorları birleştirin ve kokteyli yavaşça karıştırın. Mikrodalga döngüsü tamamlandığında, slayt odasını çıkarın ve açın ve dokuya dokunmadan blokaj tamponunu slayttan fitilleyin. Ardından, slayta 200 mikrolitre birincil antikor boyama solüsyonu 1 ekleyin. Odayı mikrodalgaya geri koyun ve birincil antikor programını yaklaşık 30 dakika boyunca tekrar yürütün. Birincil antikor etiketlemesi tamamlandıktan sonra, slaytı dikey olarak tutun. Slaytı yıkamak için, dokuya 1.000 mikrolitre PBS pipetleyin ve akmasına izin verin. Fazla PBS'yi fitilleyin ve slaytı nem odasında oda sıcaklığında 10 dakika boyunca %1 paraformaldehit ile sabitleyin. Sabitledikten sonra, slaytı üç ila beş kez 1.000 mikrolitre PBS ile iyice yıkayın ve fotoışınlama adımına kadar doku üzerinde bir PBS tabakası bırakın. Fotoışınlama kutusunu hazırlamak için 150 watt'lık bir LED lamba, 40 watt'lık bir RGBW projektör LED lamba, 75 litre veya daha fazla kapasiteli büyük bir plastik kap.71 litre veya daha fazla, taze PBS ve bir Petri kabı. Şimdi slaytı tamamen batırmak için Petri kabını 1x PBS ile doldurun. Lambalardan gelen ısıyı en aza indirmek için fotoışınlama prosedürünü soğuk bir odada gerçekleştirin. Ardından slaytı Petri kabına yerleştirin ve tamamen PBS'ye batırıldığından emin olun. Ardından, 40 watt'lık lambayı, ışık kaynağı slayta doğru bakacak şekilde doğrudan Petri kabının üzerine yerleştirin ve lambayı kırmızı ışık moduna ayarlayın. Son olarak, hem 150 watt'lık hem de 40 watt'lık lambaları açın ve tüm kurulumu plastik kap kapağıyla kapatın. İki saat sonra lambayı yeşil ışığa getirin ve 16 saat inkübe edin. Boya inaktivasyon protokolüyle uyumlu en parlak floroforlar tanımlandı ve sinyal tespitini geliştirmek için düşük eksprese edilen işaretleyicilerle eşleştirildi. Otofloresan, fotoışınlamadan sonra ve daha uzun görüntüleme dalga boylarında önemli ölçüde azaldı. Yüksek oranda eksprese edilen yapısal belirteçleri, alfa-düz kas aktini ve pan sitokeratini hedefleyen doğrudan konjuge antikorlar, 750 nanometrede yakın kızılötesi kanalda değiştirilir. Arka plan sinyali, boyanmamış bir referans görüntüsü ve SimpleITK aritmetiği kullanılarak hesaplamalı olarak çıkarıldı ve gerçek sinyaller eşikleme yoluyla geliştirildi. IBEX ile boyanmış kesitlerin tüm slayt görüntülemesinde nekrotik çekirdekli granülomlar ve CD15 pozitif nötrofiller görüldü. Anti-antijen 85B antikoru kullanılarak granülom nekrotik çekirdeğin yakınında Mycobacterium tuberculosis veya tüberküloz dışı mikobakteriler tespit edildi. Granülomla ilişkili lenfoid doku, CD20-pozitif B hücreleri, CD4-pozitif T hücreleri, birkaç CD8-pozitif T hücresi ve akciğerdeki tüm bağışıklık hücrelerinin CD45 etiketlemesini içeriyordu. IBEX görüntüleme ayrıca bronşiyal epitel hücreleri, arteriyel düz kas ve CD68 pozitif makrofajlar dahil olmak üzere akciğer anatomik özelliklerinin görselleştirilmesini sağladı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, insan dokusunun doğal otofloresansı ile görüntülenmesini artıran düşük maliyetli bir fotoirradiasyon tekniği sunmaktadır. Protokol, yaygın olarak kullanılabilen reaktiflerin ve açık kaynaklı yazılımın kullanımıyla arşivlenmiş klinik örneklerden çoklu, tam slayt görüntülemesine olanak tanır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Immünoloji
- Fluoresan Mikroskopi
Arka Plan
- Mekansal proteomik, dokular içindeki bağışıklık hücrelerinin ve bunların etkileşimlerinin haritalanmasını sağlar.
- Antikor panelleri oluşturmada ve yüksek endojen floresansı olan dokuları görüntülemede zorluklar mevcuttur.
- IBEX tekniği, yüksek riskli lenfoma hastalarında tümöre özgü özellikleri tanımlar.
- Mikobakteriyel pulmoner patolojilerde bağışıklık hücreleri kompozisyonu hakkında çok az şey bilinmektedir.
Çalışmanın Amacı
- Dokunun otofloresansını azaltırken antikor sinyallerini koruyan bir protokol sağlamak.
- Karmaşık doku örneklerinde bağışıklık hücrelerinin mekansal analizini kolaylaştırmak.
- Çeşitli patolojilerde bağışıklık hücreleri etkileşimlerinde bilgi boşluklarını doldurmak.
Kullanılan Yöntemler
- Antijen geri kazanım sonrası dokulu slaytlar PBS'ye batırılır.
- Engelleme tamponu ve primer antikor çözeltileri hazırlanır ve uygulanır.
- Otofloresansı azaltmak için özel LED lambaları kullanarak fotoirradiasyon gerçekleştirilir.
- Bağışıklık hücre etkileşimlerini ve doku özelliklerini görselleştirmek için tam slayt görüntüleme yapılır.
Ana Sonuçlar
- Fotoirradiasyon sonrası otofloresansta önemli bir azalma sağlandı.
- Granülomlar ve bağışıklık hücre tipleri akciğer dokusunda görselleştirildi.
- Spesifik antikorlar nekrotik çekirdeklerin yakınında Mycobacterium tuberculosis'i tespit etti.
- IBEX görüntüleme, akciğer dokularının ayrıntılı anatomik özelliklerini ortaya çıkardı.
Sonuçlar
- Protokol, karmaşık dokuların görüntülenmesini geliştirerek otofloresansı en aza indirir.
- Çeşitli hastalıklarda bağışıklık hücre etkileşimlerinin incelenmesi için değerli bir araç sağlar.
- Bu yöntem, geniş bir klinik uygulama yelpazesine uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Multiplexed imaging of highly autofluorescent clinical samples is a persistent bottleneck in translational research, limiting the ability to resolve spatial immune cell phenotypes in archived tissues. The optimized IBEX workflow with iterative bleaching and photoirradiation directly addresses this challenge, enabling high-resolution, quantitative spatial proteomics in FFPE samples using accessible instrumentation. This capability enhances predictive confidence in target validation and supports robust biomarker discovery across diverse disease-relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables deep phenotypic mapping of immune cell populations within intact tissue architecture.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying spatial relationships and cell-cell interactions in disease contexts.
- Facilitates functional target validation through quantitative, multiplexed readouts in clinically relevant samples.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, low-autofluorescence tissue sections for downstream multiplexed imaging workflows.
- Improves assay reproducibility and quantitative signal detection by minimizing background interference.
- Enables scalable, whole-slide imaging for high-content screening of immune and structural markers.
Translational & Preclinical Research
- Aligns spatial proteomics outputs with translational biomarker strategies in pulmonary and infectious disease models.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis of archived clinical specimens.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by delivering high-content, spatially resolved data from challenging samples.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling spatial proteomics in FFPE tissues, supporting both early mechanistic studies and translational biomarker validation.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification through spatially resolved immune profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative multiplexed imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-content, whole-slide data for robust statistical comparison of immune cell distributions and tissue features.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in archived clinical samples.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable imaging protocol for diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in spatial immune profiling.
- Operational Value: Standardizes imaging workflows and enhances reproducibility across sample types.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by enabling robust data generation from archived samples.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in antibody panel design and fluorescence imaging.
- Needs access to widefield microscopy and LED-based photoirradiation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for antibody validation and image analysis workflows.
- Adaptable to various FFPE tissue types but may require protocol optimization for different sample matrices.
- Practical limitations include potential epitope loss and spectral overlap, necessitating careful panel design and validation.
