Name: Gelişmiş glikasyon son ürünleri, insan duyu benzeri nöron hücrelerini kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışına duyarlı hale getirir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Keşfedin, duyu benzeri nöron hücrelerinde kollajen glikasyonunun TRPV1 kanallarını nasıl duyarlı hale getirdiğini ve kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışını artırdığını. Bu yöntem ağrı mekanizmalarını ve yaşlanmaya bağlı dejeneratif hastalıkları anlamak için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. SH-SY5Y kültürü ve duyu benzeri nöron hücrelerine farklılaşma
NOT 1: Bu bölümde yer alan tüm adımların laminer akış başlığı altında yapılması ve tüm solüsyonların ve sarf malzemelerinin steril olması gerekir.
<ol><li>İlk olarak, 5 mL kültür ortamı ekleyerek bir kültür şişesi (25cm2) hazırlayın. NOT: Bu hücre tipinin çözülmesi, genişletilmesi ve bakımı için bir kültür ortamı karışımı kullanın: Dulbecco Modifiye Eagle's and Ham's Medium F12 (DMEM / F12), ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiştir.</li>
	<li>Ardından, SH-SY5Y hücrelerini içeren kriyotüpü sıvı nitrojenden çıkarın ve buz üzerinde tutun. Hücreleri 37 °C'de 2 dakika su banyosunda çözdürün.</li>
	<li>Kriyoviyal için 1 mL tam kültür ortamı ekleyin, hücreleri 15 mL'lik bir tüpe aktarın, 3 mL tam kültür ortamı ekleyin (% 10 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu ile desteklenmiş DMEM / F12) ve tekrar tekrar çekerek karıştırın ve bir pipet kullanarak tüpe geri dağıtın.</li>
	<li>Hücreleri 15 mL'lik tüpe pipetleyin ve 290 g'da santrifüjleyin. Hücrelerin dondurulması sırasında buz kristali oluşumunu önlemek için kullanılan kriyoprotektif bir ajan olan dimetil sülfoksiti (DMSO) çıkarmak için süpernatanı atın.</li>
	<li>Hücre peletine 1 mL kültür ortamı ekleyin, bir pipet kullanarak iyice karıştırın ve hücreleri genişletmek için 25cm2'lik bir kültür şişesine yerleştirin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde bir inkübatöre yerleştirin. NOT: Hücreler yaklaşık% 80 birleşmeye ulaştıklarında kullanılabilir. Nöronal farklılaşma için, hücre geçişi yirmisine kadar SH-SY5Y hücrelerinin kullanılması önerilir.</li>
	<li>Sıçan kuyruğu tip I kollajeni steril PBS'de seyrelterek hücre dışı kollajen matrisini (100 μg/mL) hazırlayın ve bu solüsyonun 1 mL'sini bir kaplama için bir Petri kabına (35/10 mm) dökün.</li>
	<li>Bunu bir inkübatörde% 5CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde yaklaşık 1 saat inkübe edin.</li>
	<li>Bu süreden sonra, plakayı steril PBS ile iki kez yıkayın, ardından Neubauer odasını kullanarak hücreleri sayın.</li>
	<li>Hücreleri saymak için, önce hücreyi içeren 25cm2'lik kültür şişesini 5 mL steril PBS ile yıkayın ve tüm kültür ortamını çıkarın. Daha sonra steril PBS'yi çıkarın, hücrelere 3 mL% 0.05 tripsin ekleyin ve hücre ayrılmasını tamamlamak için yaklaşık 3-5 dakika boyunca 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Bundan sonra, hücreleri inkübatörden çıkarın, kültür şişesine 6 mL kültür ortamı ekleyin ve bu çözeltiyi 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 290 g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı çıkarın ve hücreleri 1 mL tam kültür ortamında iyice yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Son olarak, bir Neubauer sayma odası kullanarak hücreleri sayın. 20 μL hücre ve 20 μL tripan mavisi karıştırın ve bu karışımın 10 μL'sini bir Neubauer odasına ekleyin. Mavi renkte lekelenmeyen canlı hücreleri sayın.</li>
	<li>Plaka 5 × 10 Daha önce tarif edilen aynı kültür ortamı üzerinde bir Petri kabında (35/10 mm)4 hücre/mL hücre. Plaka başına toplam 1 mL hacim kullanın.</li>
	<li>Ardından, nöronal farklılaşma protokolünü başlatmak için 24 saat bekleyin. Bunun için kültür ortamını çıkarın ve %2 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumu, %1 penisilin-streptomisin ve 10 μM all-trans retinoik asit (RA 10 μM) ile takviye edilmiş 1 mL DMEM/F12 ile değiştirin.</li>
	<li>48 saat bekleyin ve kültür ortamını 3 gün boyunca her gün değiştirin. Hücreleri 37 ° C'de% 5 CO2 içeren nemlendirilmiş bir atmosferde bir inkübatöre yerleştirin.</li>
	<li>Beşinci günde, ortamı hücrelerden çıkarın ve her plakaya insan beyninden türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF 50 ng / mL) ile takviye edilmiş 1 mL serumsuz kültür ortamı ekleyin. NOT: Farklı şirketlerden BDNF (malzeme tablosuna bakınız) test edilmiştir. Hepsi aynı şekilde çalıştı.</li>
	<li>Farklılaşmanın yedinci gününde, hücreleri bir kez steril PBS ile yıkayın ve deneyler için duyusal benzeri nöron hücreleri kullanın. Bu hücreleri deneyler için hemen kullanmak mümkün değilse, kullanıma kadar canlı tutmak için serum içermeyen bir kültür ortamı ekleyin. NOT: Nöronal farklılaşmanın sonunda, hücre toksisitesini önleyerek kalan BDNF'yi çıkarmak için hücreleri steril PBS ile yıkamak gerekir.</li>
</ol>2. Glikasyonlu kollajen ve glikasyon süreci
NOT: Bu bölümdeki tüm adımlar laminer akış başlığı altında yapılmalı ve tüm solüsyonlar ve sarf malzemeleri steril olmalıdır.
<ol><li>Sıçan kuyruğu fibriller durumundan (3.89 mg / mL) 200 mM D-riboz, 160 mM D-glikoz ve 200 mM D-treoz ile 7 gün boyunca 4 gün boyunca inkübe ederek kollajen glikasyonunu hazırlayın. NOT: Glikasyonlu kollajen hazırlamak için, şekerleri moleküler ağırlıklarına göre tartın ve sıçan kuyruğu fibriller durumundan (3.89 mg / mL) kollajen tip I ile karıştırın.</li>
	<li>Serum ve antibiyotik takviyesi olmadan DMEM/F12 kültür ortamında hazırlanan glikasyonlu kollajen hücre dışı matris (ECM-GC, 100 μg/mL) veya normal kollajen hücre dışı matris (ECM-NC, 100 μg/mL) ile duyusal benzeri nöron hücre kültürünü 24 saat inkübe edin.</li>
</ol>3. Kalsiyum akışı testi
<ol><li>Kalsiyum akışı için, kalsiyum akışı test kitini kullanın ve çözeltileri aşağıda belirtildiği gibi üreticinin talimatlarına göre hazırlayın.</li>
	<li>İlk olarak, 998 μL 1x tahlil tamponuna (HBSS tamponu ve 10x Pluronic F127 Plus karışımı) 2 μL Fluo-8 stok çözeltisi ekleyerek 1 mL Fluo-8 boya yüklemesi hazırlayın. NOT: Bu çalışma çözümü, oda sıcaklığında (RT) en az 2 saat stabildir.</li>
	<li>Daha sonra, bu çözeltinin 250 μL'sini, daha önce farklılaştırılmış ve ECM-NC veya ECM-GC ile muamele edilmiş duyusal benzeri nöron hücrelerinin her bir plakalı kabında, 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 30 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, çanağı kuluçka makinesinden çıkarın ve 30 dakika boyunca RT'de (karanlıkta) tutun. NOT: 2 saatlik inkübasyon tahmin edilirse bu çözelti sitotoksik hale gelir. Kuluçka süresi boyunca kapsaisin çözeltisini hazırlayın.</li>
</ol>4. Kapsaisin indüksiyonu
NOT: Bir TRPV1 agonisti olan kapsaisin, hücrelerde kalsiyum akışını indüklemek için kullanıldı.
<ol><li>Kapsaisini% 1 etanol ve ultra saf su içinde tartın ve seyreltin. Daha sonra, aynı zamanda ultra saf suda seyreltilmiş olan 2 μM'lik bir konsantrasyonda bir çözelti hazırlayın. NOT: Kapsaisin çözeltisi kullanım gününde yapılmalıdır. Kapsaisini önce etanolde ve sonra suda seyreltin; aksi takdirde çökelir.</li>
	<li>Her 35/10 mm'lik Petri kabına 250 μL 2 μM kapsaisin çözeltisi ekleyin, böylece nihai konsantrasyon 1 μM olur. NOT: Daha iyi dağılım sağlamak ve izole edilmiş floresan tepe noktalarından kaçınmak için kapsaisin stok çözelti konsantrasyonu 2 μM idi.</li>
</ol>5. Kalsiyum akışı görüntüleme ve konfokal mikroskopi analizi
NOT: Görüntüleme, 20x/0.75NA objektif ve 488 nm uyarma lazeri (%0.5 yoğunluk) ile donatılmış konfokal mikroskopta gerçekleştirildi. Emisyon 520 nm'de tespit edildi. Hücreler, xy eksenlerinde (512 x 512 piksel) zaman içinde (t) 600 Hz hızında, 433 ms'lik bir edinme aralığı ve toplam 5 dakikalık bir edinme süresi ile tarandı. Mikroskopi yazılımı kullanılarak hücrelerin fizyolojik durumunu korumak için görüntüleme 37 °C'de yapıldı.
<ol><li>250 μL 2 μM kapsaisin çözeltisi içeren bir şırınga hazırlayın (plakadaki son konsantrasyon 1 μM olacaktır) ve bunu bir kafa derisi damar setine bağlayın - Kelebek tipi 23 GA steril. Şırıngayı bir laboratuvar standı ve kelepçe kullanarak sabitleyin.</li>
	<li>Petri kabını mikroskop aşamasına koyun ve çok dikkatli bir şekilde kafa derisi iğnesini Petri kabına yerleştirin, alt kısımla temastan kaçının, iğnenin ucu sıvıya batırılmamalıdır. NOT: Kafa derisi pozisyonunu sabitlemek için yapışkan bir bant kullanılabilir.</li>
	<li>Yeterli sayıda hücreye (20'den fazla) sahip bir alan bulun ve parlak alan ışığını kullanarak odağı ayarlayın.</li>
	<li>488 nm lazerle Canlı modu başlatın ve odak ve aydınlatma parametrelerini ayarlayın.</li>
	<li>Edinme kaydını başlatın ve başlangıç süresinden sonra (t = 0 ila t = 60 saniye), 250 μL 2 μM kapsaisin uygulayın ve hücrelere kalsiyum akışını uyarmak için şırınga pistonunu hafifçe itin. NOT: Son kayıt alma süresi plaka başına yaklaşık 300 s idi.</li>
</ol>6. İşlem sonrası/veri analizi
<ol><li>Kantifikasyon modunda mikroskopi yazılımını kullanarak hücre analizini gerçekleştirin. İlk olarak, kapsaisin uyaranından önce ve sonra floresan spike hücrelerini analiz edin.</li>
	<li>Her duyarlı hücrede bir ilgi alanı (ROI) oluşturun, yani kapsaisinden sonra bir floresan artışı gösteren hücreler. Yukarıda gösterildiği gibi tüm hücre alanında ROI çizdiğinizden emin olun (Şekil 1).</li>
	<li>Sonraki çözümleme için verileri virgülle ayrılmış değerler (CSV) dosyasında dışa aktarın.</li>
	<li>Alternatif olarak, ücretsiz olarak sunulan FIJI7 (https://fiji.sc) yazılımını kullanarak analizi gerçekleştirin.<ol><li>Görüntü dosyalarını açmak için, Dosya &gt; İçe Aktar &gt; Biyo-Formatlar'a gidip dosyayı seçerek Bio-Formats eklentisini kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Ardından, yakınlaştırmak için Büyüteç aracını ve duyarlı hücrelerin etrafına bir İlgi Alanı (ROI) çizmek için Serbest El Seçimi aracını kullanın.</li>
	<li>Her bir ROI'yi çizdikten sonra, ROI Yöneticisi'ne eklemek için T tuşuna basın. İlgilendiğiniz tüm hücreler için bu işlemi tekrarlayın (Şekil 2).</li>
	<li>Tüm ROI'ler eklendikten sonra, ROI Yöneticisi penceresine gidin, tüm ROI'leri seçin ve ardından ana menüde Analiz Et &gt; Ölçümleri Ayarla'ya gidin.</li>
	<li>Ardından, ROI Yöneticisi'ne dönün ve tüm karelerdeki yoğunluğu ölçmek için Daha Fazla &gt; Çoklu Ölçüm'ü seçin. Sonuçlar yeni bir pencerede görünecektir; Dosya &gt; Farklı Kaydet'e giderek CSV dosyası olarak dışa aktarın. NOT: CSV dosyası Excel, Google E-Tablolar ve GraphPad yazılımında analiz edilebilir. Fluo-8 Kalsiyum Akısı Test Kiti ile elde edilen floresan yoğunluğu değerlerini kalsiyum akışı değişiminin göreceli bir ölçüsüne dönüştürmek için ΔF/F0 = (F(t) - F0)/F0 denklemini kullanın. Burada, F0 , kapsaisin ile stimülasyondan önce t = 0 s ile t = 60 s arasında yakalanan görüntülerden elde edilen ortalama yoğunluk olarak hesaplanan temel floresansı temsil eder. F(t), uyarandan sonra gözlemlenen maksimum floresan yoğunluğunun değeridir ve bu, en yüksek kalsiyum akışının değerlendirilmesine izin verir. Bu yaklaşım, ΔF/F0'daki bir artışın hücre içi kalsiyum seviyesinin yükseldiğini gösterdiği taban çizgisine göre floresanstaki artışı vurgular.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig01v2.jpg"> Şekil 1: LAS X yazılımında kalsiyum akışı analizi için seçilen hücrelerdeki ROI örneği. (A) Niceleme modunda LAS X arayüzü. Pembe dikdörtgen, niceleme sekmesini gösterir. Sarı dikdörtgen çoklu çizgi çizme aracını, camgöbeği dikdörtgen ise uzaklaştırma ve yakınlaştırma araçlarını gösterir. (B) Görüş alanı (FOV) yakalandı. (C) Tüm hücrede ROI çizimini kolaylaştırmak için FOV'u yakınlaştırın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5.jpg"> Şekil 2: FIJI yazılımında kalsiyum akışı analizi için seçilen hücrelerdeki ROI örneği. (A) Ana menüyü ve aracı gösteren FIJI arayüzü. Kırmızı kare büyüteç aracını, yeşil kare ise Serbest El seçimini gösterir. (B) Yakınlaştırma ve çizilmiş bir ROI ile yakalanan görüş alanı (FOV). (C) ROI yöneticisi penceresi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68036/68036fig2v5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
7. Sorun Giderme
<ol><li>Görüntü odak dışındaysa, aşağıdakileri deneyin:<ol><li>Bandın yapışmasını kontrol edin; Gevşemişse, bu iğnenin kaymasına ve odağı etkilemesine neden olabilir.</li>
		<li>Daha fazla stabilite için iğneyi ek bantla yeniden takın.</li>
		<li>Standart iğnelerin değiştirilmesi. Plaka üzerindeki hizalamayı iyileştirmek için önceden bükülmüş diş iğne uçları kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Hücreler doymuş bir sinyal sergiliyorsa, aşağıdaki adımları deneyin:<ol><li>Lazer yoğunluğunu azaltın ve ayarları kazanın.</li>
		<li>Reaktif inkübasyon süresini doğrulayın. Üreticinin tavsiyesini aşarsa, sinyal doygunluğuna yol açarak kalsiyum akışı tespitini zorlaştırabilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Sorun giderme için şu ek önerileri izleyin:<ol><li>Düzenli Kalibrasyon: Odak ve sinyal algılama kalitesini korumak için görüntüleme ekipmanının düzenli olarak kalibre edildiğinden emin olun.</li>
		<li>Belge değişiklikleri: İleride başvurmak ve sorun gidermeyi kolaylaştırmak için protokolde yapılan tüm ayarlamaların kaydını tutun.</li>
		<li>Reaktif ayarlamalar: Sorunlar devam ederse, farklı reaktif konsantrasyonları veya alternatif sinyal algılama yöntemleriyle test etmeyi düşünün.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Bierhaus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+RAGE%2C+the+receptor+for+advanced+glycation+end+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Understanding RAGE, the receptor for advanced glycation end products.</a> J Mol Med. 83 (11), 876-886 (2005).</li>
<li>Hudson, B. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+receptor+for+advanced+glycation+endproducts%3A+A+new+target+for+therapeutic+intervention+in+diabetic+complications+and+inflammatory+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">Blockade of receptor for advanced glycation endproducts: A new target for therapeutic intervention in diabetic complications and inflammatory disorders.</a> Arch Biochem Biophys. 419 (1), 80-88 (2003).</li>
<li>Dandia, H., Makkad, K., Tayalia, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycated+collagen+-+a+3D+matrix+system+to+study+pathological+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomater+Sci%22%5BJournal%5D)">Glycated collagen - a 3D matrix system to study pathological cell behavior.</a> Biomater Sci. 7 (8), 3480-3488 (2019).</li>
<li>Bufalo, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+sensory+neuron-like+cells+and+glycated+collagen+matrix+as+a+model+for+the+screening+of+analgesic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Human sensory neuron-like cells and glycated collagen matrix as a model for the screening of analgesic compounds.</a> Cells. 11 (2), 247(2022).</li>
<li>Frias, B., Merighi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capsaicin%2C+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Capsaicin, nociception and pain.</a> Molecules. 21 (6), 797(2016).</li>
<li>Lam, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAGE-dependent+potentiation+of+TRPV1+currents+in+sensory+neurons+exposed+to+high+glucose%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">RAGE-dependent potentiation of TRPV1 currents in sensory neurons exposed to high glucose.</a> PLoS One. 13 (2), e0193312(2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Li, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+activity+and+substance+P+release+are+required+for+corneal+cold+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">TRPV1 activity and substance P release are required for corneal cold nociception.</a> Nat Commun. 10 (1), 5678(2019).</li>
<li>Mickle, A. D., Shepherd, A. J., Mohapatra, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+TRP+channels%3Athe+key+transducers+of+nociception+and+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Mol+Biol+Transl+Sci%22%5BJournal%5D)">Sensory TRP channels:the key transducers of nociception and pain.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 131, 73-118 (2015).</li>
<li>Iseppon, F., Linley, J. E., Wood, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+imaging+for+analgesic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Pain%22%5BJournal%5D)">Calcium imaging for analgesic drug discovery.</a> Neurobiol Pain. 11, 100083(2022).</li>
<li>Vetter, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+Nav+types+endogenously+expressed+in+human+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Characterisation of Nav types endogenously expressed in human SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Biochem Pharmacol. 83 (11), 1562-1571 (2012).</li>
<li>Dekker, L. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+human+Nav1.8+expressed+in+SH-SY5Y+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Analysis of human Nav1.8 expressed in SH-SY5Y neuroblastoma cells.</a> Eur J Pharmacol. 528 (1-3), 52-58 (2005).</li>
<li>Lam, P. M. W., Hainsworth, A. H., Smith, G. D., Owen, D. E., Davies, J., Lambert, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+recombinant+human+TRPV1+receptors+expressed+in+SH-SY5Y+human+neuroblastoma+cells+increases+%5BCa2%2B%5Di+initiates+neurotransmitter+release+and+promotes+delayed+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Activation of recombinant human TRPV1 receptors expressed in SH-SY5Y human neuroblastoma cells increases [Ca2+]i initiates neurotransmitter release and promotes delayed cell death.</a> J Neurochem. 102 (3), 801-811 (2007).</li>
<li>Koplas, P. A., Rosenberg, R. L., Oxford, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+calcium+in+the+desensitization+of+capsaicin+responses+in+rat+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of calcium in the desensitization of capsaicin responses in rat dorsal root ganglion neurons.</a> J Neurosci. 17 (10), 3525-3537 (1997).</li>
<li>Tominaga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cloned+capsaicin+receptor+integrates+multiple+pain-producing+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli.</a> Neuron. 21 (3), 531-543 (1998).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>All-trans retinoik asit</td><td>Tocris</td><td>695</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Tocris</td><td>TOCR-2837</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3795</td><td></td></tr><tr><td>Kelebek tipi 23GA steril</td><td>Beckton Dickinson Asepto</td><td>38833814</td><td>Kafa derisi damar seti</td></tr><tr><td>Kapsaisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2028</td><td></td></tr><tr><td>D-glikoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>Gibco</td><td>12500062</td><td>Bazal ortam</td></tr><tr><td>D-riboz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7500</td><td></td></tr><tr><td>D-treoz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7392</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-8 Kalsiyum Akı Test Kiti</td><td>Abcam</td><td>ab112129</td><td>Yıkama yok</td></tr> Isı <tr><td>ile inaktive edilmiş fetal sığır serumu</td><td>Gibco</td><td>A5670801</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek İçerik Gösterim&nbsp;</td><td>Moleküler Cihazlar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LASX yazılımı</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Mikroskopi yazılımı</td></tr><tr><td>Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica TCS SP8</td><td>Konfokal mikroskop</td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140130</td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı (35/10 mm)</td><td>Greiner bio-one</td><td>627965</td><td></td></tr><tr><td>Sıçan kuyruğu tip I kollajen</td><td>Corning</td><td></td><td></td>354236</tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>Merck</td><td>94030304-1VL</td><td>Nöroblastom hücre hattı</td></tr></tbody></table>

gelişmiş glikasyon son ürünleri, insan duyu benzeri nöron hücrelerini kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışına duyarlı hale getirir

Advanced Glycation End-Products Sensitize Human Sensory-Like Neuron Cells to Capsaicin-Induced Calcium Influx

SH-SY5Y hücrelerinin duyu benzeri nörona farklılaşması Yüksek içerikli tarama görüntüleri, nöronal farklılaşma protokolünün SH-SY5Y hücre morfolojisini değiştirdiğini göstermektedir. Duyusal benzeri nöron hücreleri (farklılaşmış hücreler), geniş bir nörofilament ağını yansıtan yuvarlak bir hücre gövdesi sergiler. Olgun nöron özellikleriyle tutarlı olan çevredeki nöronları birbirine bağlayan daha uzun nörit çıkıntılarının dallarını oluştururlar (Şekil 3)4...

Gelişmiş glikasyon son ürünleri, insan duyu benzeri nöron hücrelerini kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışına duyarlı hale getirir

Increased collagen-derived advanced glycation end products (AGEs) are consistently linked to painful diseases, including osteoarthritis, diabetic ...

advanced-glycation-end-products-sensitize-human-sensory-like-neuron

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Soğuk Plantar Testi (CPA), 30 °C ile 5 °C arasındaki soğuğa tepkiyi ölçer ve ayrıca soğuk adaptasyonunu da ölçebilir. Bu protokol, farelerde soğuk aşırı duyarlılığı, analjezi ve adaptasyonu ölçmek için CPA'nın nasıl kullanılacağını açıklar.

Fareler Soğuk Hassasiyeti ve Uyum belirlenmesi için Basit ve ucuz Yöntem

Bu el yazması, yama kelepçesi kayıtları için sağlam dorsal kök gangliyonlarının nasıl hazırlanacağını açıklar. Bu hazırlık, nöronlar ve uydu glial hücreler için mikro çevreyi korur, böylece ayrışmış DRG nöronları kullanılarak görülen fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerden kaçınır.

Yetişkin Rats gelen bozulmamış Dorsal Kök Ganglia üzerinde Patch Kelepçe Kayıtlar

Bu çalışmada deneysel bir model saf küçük fiber nöropati ile resiniferatoxin (RTX) kurar. RTX benzersiz bir doz (50 µg/kg) hasta özellikleri taklit eden bir küçük fiber nöropati modeli geliştirmek için en uygun ve nöropatik ağrı altında yatan nosiseptif moleküler önemini araştırmak yardımcı olabilir.

Saf küçük Fiber nöropati bir fare modeli ile geçici reseptör potansiyel Vanilloid tip 1 Ultrapotent Agonist kurulması

Burada canlı, uyuşturuldulu bir laboratuvar faresinin genikül ganglionunun nasıl ortaya çıkarılacağını ve bu nöronların topluluklarının uyaranları tatmak için tepkilerini ölçmek için kalsiyum görüntülemenin nasıl kullanılacağını ve farklı uyarıcılarla birden fazla denemeye izin vermeyi sunuyoruz. Bu, hangi nöronların hangi şok tabancalarına yanıt verdiğine derinlemesine karşılaştırmalar sağlar.

Tadı Uyaranlara Fare Genikül Ganglion Nöron Yanıtlarının In vivo Kalsiyum Görüntülemesi

Bu protokol, ex vivo kalsitonin genine bağlı peptid (CGRP) salınım modelini ve farmakolojik ajanların kemirgenlerde trigeminovasküler sistemden salınan CGRP miktarı üzerindeki etkisini ölçme stratejisini açıklamaktadır.

Eski Vivo Kemirgenlerde Trigeminovasküler Sistemden Kalsitonin Geni ile İlgili Peptitin Salınımı

Bu protokol, dorsal kök ganglionunun (DRG) cerrahi maruziyetini ve ardından GCaMP3'ü (genetik olarak kodlanmış Ca2+ göstergesi; Yeşil Floresan Protein-Kalmodulin-M13 Protein 3) İpsilateral arka pençeye çeşitli uyaranlar uygularken Pirt-GCaMP3 fareleri kullanılarak nöronal toplulukların Ca2+ görüntülenmesi.

İn Vivo Bozulmamış Dorsal Kök Ganglialarında Primer Duyusal Nöronların Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülenmesi

Genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri (GECI), duyusal nöron sinyalinin sağlam, popülasyon düzeyinde bir analizini sağlar. Burada, sıçan trigeminal gangliyon nöron aktivitesinin in vivo GECI görselleştirmesine izin veren yeni bir yaklaşım geliştirdik.

Canlı Olarak Taşınabilir Sıçan Trigeminal Ganglionundaki Duyusal Nöronların Kalsiyum Görüntülemesi

Bu çalışma, senkron EKG kayıtları ile birlikte in vivo kalsiyum görüntüleme için anestezi uygulanmış farelerde T-DRG'yi ortaya çıkarmak için cerrahi bir manipülasyon sunmaktadır. Bu yöntem, periferik elektriksel sinir stimülasyonu ve torasik viseral organ girdilerinin yanı sıra bunların birincil duyusal düzeydeki etkileşimlerini incelemek için son teknoloji bir araçtır.

Periferik Sinir Stimülasyonunu İncelemek için İn Vivo Torasik Dorsal Kök Gangliyonları (DRG) Kalsiyum Görüntüleme ve EKG Kaydı

Bu makale, Fura-2/boyası ile tek hücreli Ca2+ görüntüleme kullanılarak hücrelerde kalsiyum iyonu (Ca 2+) konsantrasyonlarının gerçek zamanlı, kantitatif izlenmesi için bir yöntem sunmaktadır. Bu teknik, floresan yoğunluk oranları aracılığıyla verimli boya yüklemesi ve Ca2+ seviyelerinin doğru bir şekilde hesaplanmasını sağlayarak araştırma uygulamaları için basit ve hızlı bir yaklaşım haline getirir.

Kalsiyum iyon kanallarının aktivasyonunu incelemek için tek hücreli kalsiyum görüntüleme

Bu protokol, sağlam trigeminal ganglion (TG) nöronlarının in vivo GCaMP kalsiyum görüntülemesini tanımlar. Bu tanım, TG maruziyet cerrahisini, TG nöronlarının in vivo konfokal mikroskopi görüntülemesini, TG nöronlarının mikroskobik görüntülemesi sırasında somatik uyaranların uygulanmasını ve in vivo GCaMP kalsiyum görüntüleme verilerinin analizini içerir.

In vivo (İn canlı) İntakt Trigeminal Gangliyonlarda Primer Duyusal Nöron Ağlarında Nöronal Toplulukların Kalsiyum Görüntülemesi

Keşfedin, duyu benzeri nöron hücrelerinde kollajen glikasyonunun TRPV1 kanallarını nasıl duyarlı hale getirdiğini ve kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışını artırdığını. Bu yöntem ağrı mekanizmalarını ve yaşlanmaya bağlı dejeneratif hastalıkları anlamak için değerli bir araçtır.

Gelişmiş glikasyon son ürünleri, insan duyu benzeri nöron hücrelerini kapsaisin kaynaklı kalsiyum akışına duyarlı hale getirir

Daha fazla video keşfet