Name: HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Öğrenin, canlı HepG2 hücrelerinde FRET görüntüleme ile Akt aktivasyonunun uzamsal-zamansal dinamiklerini nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem, kanser metabolizmasındaki insülin sinyal yollarını anlamak için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tek HepG2 hücrelerinde Akt fosforilasyonunu izlemek için FRET canlı hücre görüntülemede yer alan deneysel adımlara genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir.
1. Plazmid edinimi, yayılması ve saflaştırılması
NOT: Bu bölüm, tek hücreli FRET analizi için gerekli olan plazmidin elde edilmesi, çoğaltılması ve saflaştırılması için temel adımları özetlemektedir.
<ol>
	<li>pEevee-iAkt-NES-YPet plazmidini kullanın (Şekil 2A). NOT: Plazmid, Japonya'daki Ulusal Temel Biyoloji Enstitüsü'nden (NIBB) Prof. Kazuhiro Aoki tarafından cömertçe sağlanmıştır.Akt izleme için kullanılan FRET biyosensörleri ve ilgili kontrolleri için plazmid haritaları Şekil 2'de gösterilmektedir. pEevee-iAkt-NES-ECFP (bağışçı; Şekil 2B) ve pEevee-iAkt-NES-Ypet (alıcı; Şekil 2C) Plazmitler, FRET deneyleri9 sırasında kalibrasyon kontrolleri olarak kullanılır. NOT: Şekil 3 , molekül içi FRET biyosensörünün bileşimini ve mekanizmasını göstermektedir.</li>
	<li>Plazmidi çoğaltmak için, kimyasal olarak yetkin E. coli hücreleri kullanarak bakteriyel transformasyon gerçekleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). Dönüştürülmüş hücreleri 100 μg / mL ampisilin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerine yerleştirin ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, ampisiline dirençli bir koloni seçin ve plazmid amplifikasyonu için 100 μg/mL ampisilin ile takviye edilmiş LB suyunda kültürleyin.</li>
	<li>Plazmit DNA'yı saflaştırmak için, yüksek saflık ve verim elde etmek için ticari olarak temin edilebilen bir plazmit DNA saflaştırma kiti ( Malzeme Tablosuna bakınız) kullanın. Bir spektrofotometre kullanarak absorbans oranlarını (A260 / A280 ve A260 / A230) ölçerek DNA kalitesini değerlendirin (bkz. 1.8-2.0 ve 2.0-2.2 arasındaki oranlar optimal olarak kabul edilir. Transfeksiyon için uygun olduğundan emin olmak için agaroz jel elektroforezi yoluyla plazmit bütünlüğünü doğrulayın.</li>
</ol>
2. Hücre kültürü prosedürü
NOT: Steril bir ortam sağlamak ve kontaminasyonu önlemek için tüm hücre kültürü prosedürlerini bir laminer akış başlığı içinde gerçekleştirin. HepG2 hücre kültürü iş akışı Şekil 4'te gösterilmiştir. HepG2 hücreleri için komple besiyeri, Minimum Esansiyel Besiyeri (MEM), fetal sığır serumu (FBS), %1 Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA), 1 mM Sodyum Piruvat, 2 mM L-glutamin takviyesi, 100 U/mL Penisilin-Streptomisin ve 2.5 μg/mL antibiyotik-antimikotik solüsyondan oluşur (bkz. Malzeme Tablosu, Tablo 1).
<ol>
	<li>Dondurulmuş HepG2 hücrelerini, şişeyi tamamen çözülene kadar 37 ° C'lik bir termomikser veya su banyosuna yerleştirerek hızla çözün.</li>
	<li>Çözülmüş hücreleri, 10 mL tam büyüme ortamı içeren 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Hücrelere termal şoku en aza indirmek için kullanmadan önce tüm büyüme ortamını 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.</li>
	<li>Hücreleri peletlemek için tüpü 200 x g'da 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Hücre peletini rahatsız etmemek için geniş delikli bir pipet ucu kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin.</li>
	<li>Peletleri 10 mL taze tam büyüme ortamında yeniden süspanse edin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonunu 75 cm²'lik bir doku kültürü şişesine aktarın.</li>
	<li>Şişeyi 37 °C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin NOT: Eki onaylamak ve iyileşmeyi değerlendirmek için hücreleri sonraki 24-48 saat boyunca gözlemleyin. Ortamı değiştirmeden önce düzgün bağlanmayı sağlamak için hücreleri en az 4 saat rahatsız etmeyin. İlk 4 saat boyunca inkübatörü sık sık açmaktan kaçının, çünkü bu hücre bağlanmasını bozabilir. Tüm hücre kültürü prosedürleri sırasında güvenli bir çalışma ortamı sağlamak için kurumsal biyogüvenlik protokollerini takip edin ve uygun kişisel koruyucu ekipman (KKD) kullanın. HepG2 hücrelerini, optimal büyüme koşullarını korumak ve hücre canlılığını ve büyüme potansiyelini etkileyebilecek aşırı kalabalıklaşmayı önlemek için p-80 birleşmeye ulaştıklarında alt kültür.</li>
	<li>Alt kültürleme için, ortamı aspire edin ve hücreleri bir kez 5 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile durulayın.</li>
	<li>Hücre tek tabakasını kaplamak için 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Optimum aktivite için tripsinin 37 °C'ye önceden ısıtıldığından emin olun. Hücreleri aşırı tripsinize etmeyin, çünkü bu canlılığı azaltabilir. Ayrılmayı doğrulamak için hücreleri mikroskop altında izleyin.</li>
	<li>37 °C'de yaklaşık 5 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Hücreler ayrıldığında, tripsini nötralize etmek için 2 mL tam ortam ekleyin ve hücreleri pipetleme yoluyla toplayın.</li>
	<li>Topakları parçalamak ve tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için hücre süspansiyonunu nazikçe pipetleyin.</li>
	<li>Her yeni şişeye 3 mL tam ortam ekleyin, ardından hücreleri her şişeye 1:2 oranında bölünerek aktarın. NOT: Erken geçişler için, hücreleri 1:2 oranında seyrelterek bölün. 4-5. pasajlardan sonra, uygun şekilde 1:4 veya 1:5 oranında seyreltmeler gerçekleştirilebilir.</li>
	<li>Hücreleri 37 °C'de% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin. NOT: Eki onaylamak ve kurtarmayı değerlendirmek için 24 saat sonra hücreleri kontrol edin.</li>
	<li>Rutin kültür için, pH indikatörü pembeden sarıya değişirse ve asitlenmeyi gösterirse kültür ortamını her 2-3 günde bir veya daha erken değiştirin. NOT: Hücrelere zarar verebileceğinden ortamın çok asidik hale gelmesine izin vermeyin.</li>
	<li>Hücre sağlığını sağlamak için hücre morfolojisini düzenli olarak mikroskop altında kontrol edin. NOT: Kısa süreli depolama için HepG2 hücrelerini -80 °C'de dondurun; Uzun süreli depolama için sıvı nitrojen içinde saklayın. Bu deneyde kullanılan dondurma ortamının bileşimi (Tablo 2)'de özetlenmiştir.</li>
</ol>
3. Görüntüleme kaplarının poli-l-lizin ile kaplanması
<ol>
	<li>Tüm yüzeyi kaplamak için görüntüleme kabı başına 1 mL 0.1 mg / mL Poli-L-Lizin çözeltisi kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). NOT: Poli-L-Lizin konsantrasyonunu belirli hücre tipi gereksinimlerine göre ayarlayın.</li>
	<li>Kültür yüzeyinin düzgün bir şekilde kaplanmasını sağlamak için tabağı hafifçe sallayın. NOT: Kontaminasyonu önlemek için süreç boyunca steril koşullar sağlayın.</li>
	<li>Bulaşıkları gece boyunca oda sıcaklığında (RT) inkübe edin.</li>
	<li>Pipetleyerek bulaşıklardan fazla Poli-L-Lizin çözeltisini aspire edin.</li>
	<li>Yüzeyi PBS ile üç kez durulayın, her seferinde 5 dakika dinlendirin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Hücre büyümesinin inhibisyonunu önlemek için bağlanmamış Poli-L-Lizin'i görüntüleme kabından tamamen çıkarın. Cam tabanın kazınmasını veya zarar görmesini önlemek için plakaları nazikçe durulayın.</li>
	<li>Kaplanmış görüntüleme kaplarını en az 3 saat boyunca 37 °C'de havayla kurutun.</li>
	<li>Kaplanmış görüntüleme kaplarını hemen kullanın veya 4 °C'de 2 haftaya kadar saklayın.</li>
</ol>
4. HepG2 hücrelerinin transfeksiyonu
NOT: HepG2 transfeksiyon yöntemi Şekil 5'te gösterilmiştir.
<ol>
	<li>HepG2 hücrelerini, transfeksiyondan 24-48 saat önce önceden kaplanmış görüntüleme kaplarına tohumlayın ve p-90 birleşmeye ulaştıklarından emin olun.</li>
	<li>FRET biyosensörünü kodlayan transfeksiyon reaktifini ve plazmidi buz üzerinde çözün. Kullanmadan önce iyice girdap yapın ve kısa bir dönüş yapın (örn. 5,000 saniye boyunca 5 x g) ( Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Kullanmadan önce transfeksiyon reaktifinin ve plazmidin tamamen çözüldüğünden emin olun. DİKKAT: Transfeksiyon reaktifinin verimliliğini azaltabileceğinden, tekrarlanan donma-çözülme döngülerinden kaçının.</li>
	<li>FRET biyosensörünü reaksiyon tamponu ile kodlayan 8 μg plazmidi 100 μL'lik bir nihai hacme ekleyin. Yüksek hızda (yaklaşık 3.000-5.000 x g) 5 saniye vorteksleyerek iyice karıştırın. NOT: Polimer bazlı transfeksiyon reaktifini eklemeden önce daima tampona plazmit ekleyin. Çözeltinin en az 50 μL'si reaksiyon tamponundan oluşmalıdır (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>Seyreltilmiş plazmit DNA'sını içeren tüpe 2.4 μL transfeksiyon polimeri ekleyin. Yüksek hızda (yaklaşık 3.000-5.000 × g) 15 saniye girdap yaparak iyice karıştırın. NOT: Her zaman 1 μg DNA başına 0,3 μL transfeksiyon polimeri kullanın. DİKKAT: Tek tip nanopartikül kompleksleri oluşturmak için transfeksiyon polimerinin plazmit DNA ile iyice karıştırıldığından emin olun.</li>
	<li>Nanopartikül komplekslerinin oluşmasına izin vermek için biyosensör ve polimer karışımını 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin. NOT: Transfeksiyon polimerini 30 dakikadan fazla çözelti içinde tutmaktan kaçının, çünkü bu transfeksiyon verimliliğini azaltabilir. DİKKAT: Transfeksiyon verimliliğinin azalmasına neden olabilecek aşırı inkübasyonu önlemek için inkübasyon süresini dikkatlice izleyin.</li>
	<li>Alttaki içeriği toplamak için tüpü 5.000 x g'da 5 saniye boyunca döndürün, ardından 100 μL nanopartikül kompleks çözeltisinin tamamını hücre kültürü ortamına damla damla ekleyin. Karıştırmak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın. NOT: Nanopartikül kompleks çözeltisinin, hücre kültürü ortamına eşit olarak dağıtmak için damla damla eklendiğinden emin olun. DİKKAT: Hücreleri yerinden oynatabileceğinden veya komplekslerin eşit olmayan dağılımına neden olabileceğinden, kuvvetli sallanmaktan kaçının.</li>
	<li>Plakayı 37 ° C'de 4 saat ila gece boyunca inkübe edin. NOT: Kuluçka süresi deneysel ihtiyaçlara göre ayarlanabilir, ancak verimli transfeksiyon için tipik olarak 4 saat yeterlidir. DİKKAT: Uzun süreli inkübasyondan (&gt;16 saat) kaçının, çünkü bu hücre canlılığını azaltabilir.</li>
	<li>Nanopartikül komplekslerini aspirasyon ile hücrelerden çıkarın, bunları 2 mL taze tam büyüme ortamı ile değiştirin ve plakayı analiz zamanına kadar 37 ° C inkübatöre geri koyun. En yüksek ekspresyon tipik olarak transfeksiyondan 48 saat sonra ulaşır.</li>
	<li>Hücreleri floresan mikroskobu altında analiz edin. NOT: Doğru sonuçlar elde etmek için mikroskobun floresan görüntüleme için uygun şekilde kalibre edildiğinden emin olun. DİKKAT: Fototoksisiteyi önlemek için görüntüleme sırasında hücrelerin yoğun ışığa maruz kalmasını en aza indirin.</li>
</ol>
5. HepG2 hücrelerinin açlıktan ölmesi
NOT: Transfeksiyon adımını tamamladıktan sonra, insülin stimülasyonu ve FRET görüntülemeden önce hücreleri serumdan aç bırakın. Bu, FBS'de bulunan insüline bağlı Akt yolu aktivasyonunu en aza indirir ve tutarlı temel Akt aktivitesi seviyeleri sağlar. Bu deneyde kullanılan açlık ortamının bileşimi (Tablo 3)'te açıklanmıştır. BSA toz halinde gelir. % 0.1 (a / h) bir çözelti hazırlamak için, iyice karıştırarak 3 mL DMEM içinde 0.1 g BSA'yı sulandırın. Solüsyonu 0.45 μm'lik bir filtre kullanarak sterilize edin ve DMEM ekleyerek son hacmi 100 mL'ye ayarlayın.
<ol>
	<li>Kültür ortamını çıkarın ve görüntüleme kaplarını 1x PBS ile her biri 5 dakika boyunca iki kez durulayın. NOT: İki PBS yıkaması, artık serumun ve deneye müdahale edebilecek herhangi bir insülin veya büyüme faktörünün tamamen çıkarılmasına yardımcı olur.</li>
	<li>Görüntüleme kaplarına 2 mL açlık ortamı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücrelerin cam tabandan çıkmasını önlemek için ortamı tabağın kenarına yavaşça ekleyin. 37 °C'de 4 saat inkübe edin. NOT: 4 saatlik inkübasyon, hücresel metabolizmayı senkronize etmek için idealdir; Bununla birlikte, deneysel ihtiyaçlara bağlı olarak süre uzatılabilir.</li>
</ol>
6. HepG2 hücreleri için FRET canlı hücre görüntüleme
NOT: Bu bölüm, tek HepG2 hücrelerinde Akt fosforilasyonunun uzay-zamansal dinamiklerini izlemek için FRET canlı hücre görüntüleme için talimatlar sağlar. Aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, canlı HepG2 hücreleri için mikroskop kurulumunu, işleme prosedürlerini ve görüntüleme koşullarını optimize etmek önemlidir. Mikroskop kurulumu, FRET görüntüleme için görüntüleme koşullarını optimize etmek için çok önemlidir. Kararlı çalışmayı sağlamak için PC/konfokal lazer tarama mikroskobu (CLSM) kurulumunu üreticinin talimatlarına göre adım adım izleyin. FRET görüntüleme için özelleştirilmiş CLSM konfigürasyonu (Şekil 6)'da gösterilmiştir.
<ol>
	<li>Mikroskobu, bilgisayarı, tarayıcıyı, lazer başlatmayı, piezo aşamasını ve epifloresan LED ışık kaynağını çalıştırmak için uzaktan kumanda anahtarını açın. Herhangi bir olası hasarı önlemek için gücü açmadan önce tüm bileşenlerin doğru şekilde bağlandığından emin olun.</li>
	<li>Lazer başlatmada anahtarı AÇIK konuma çevirin ve FRET için gerekli olan her iki lazeri (457 nm ve 514 nm lazer çizgileri) etkinleştirmek için düğmelere basın. NOT: Optimum FRET görüntüleme için uygun filtrelerin ve ayarların yerinde olduğundan emin olun. Lazer çizgisi seçimi, biyosensörün uyarma ve emisyon profillerine dayanmalıdır.</li>
	<li>Mikroskoba bağlı bilgisayara ve monitöre güç sağlamak için anahtarlı uzatma kablosunu açın. NOT: Herhangi bir ekipman hasarını önlemek için gücü açmadan önce tüm bağlantıların sağlam olduğundan emin olun.</li>
	<li>Windows'ta oturum açın ve mikroskopi yazılımını başlatın.</li>
	<li>Görüntüleme kurulumunu başlatmak için Edinme için A1'e tıklayın. FRET deneyinin gereksinimlerine göre uygun optik konfigürasyonları seçin.</li>
	<li>Optimum görüntüleme koşulları için lazer gücünü ve dedektör hassasiyetini gerektiği gibi ayarlayın. Mikroskop tablası üst inkübatörünü dikkatlice takın ve vidalarla sabitleyin. NOT: İnkübatöre veya mikroskop aşamasına zarar vermemek için vidaları aşırı sıkmayın.</li>
	<li>İç su banyosunu steril çift damıtılmış su (ddH2O) ile doldurun. Üst ısıtıcıyı güvenli bir şekilde takın ve sahne ısıtıcısı, banyo ısıtıcısı ve lens ısıtıcısı için güç kaynağını açın (Şekil 7A). NOT: Sisteme dökülmesini önlemek için aşırı doldurmayın. Canlı hücre görüntüleme için tutarlı sıcaklık koşullarını korumak için tüm ısıtıcıların düzgün çalıştığından emin olun.</li>
	<li>Görüntüleme için 40x yağa daldırma lensini kullanın (Malzeme Tablosuna bakın). NOT: Teknik özellikler için üreticinin web sitesine bakın.</li>
	<li> </li><li></li><li> </li><li> </li><li></li><li><li></li><li></li><li><li> </li><li> </li><li><li><li></ol><ol><li></li></ol><ol><li> <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68075/68075eq02.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68075/68075eq03.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68075/68075eq04.jpg" style="margin: auto;"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68075/68075eq05.jpg" style="margin: auto;"> </li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li><li></li><li></ol><ol><li></li></ol><ol><li></ol>

<table><tbody><tr><td>%0,25 tripsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Kedi#25200-056</td><td>Hücre yıkama için buz gibi PBS kullanın</td></tr><tr><td>15 mm cam tabanlı hücre kültürü kabı</td><td>YUVA</td><td>Kedi#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; mL Nalgene kriyojenik şişeler</td><td>Termo Bilimsel</td><td>Kedi#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Stripette Serolojik Pipetler</td><td>Corning</td><td>Kedi#4487</td><td></td></tr><tr><td>%95 Etanol</td><td>Kermel</td><td>Kedi#C028005</td><td></td></tr><tr><td>A1 HD25/A1R HD25 konfokal mikroskop</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Büyütme: 40&times;, Sayısal Diyafram (NA): 1.30, Piksel Bekleme Süresi: 2.4 ms, Piksel Boyutu: 1024</td></tr><tr><td>Ampisilin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Sığır serum albümini (BSA)</td><td>VWR Yaşam Bilimleri</td><td>Kedi#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp; cm2 dikdörtgen kültür şişeleri</td><td>Corning</td><td>Kedi#430639</td><td></td></tr><tr><td>Kontes 3 otomatik hücre sayacı</td><td>Termo Bilimsel</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Kontes hücre sayma odası slaytları</td><td>Termo Bilimsel</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Dijital vorteks karıştırıcılar</td><td>Termo Bilimsel</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil sülfoksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tüpler 1.5&nbsp; Ml</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>Kedi#022363204</td><td></td></tr><tr><td>EZ-PCR mikoplazma tespit kiti</td><td>Biyolojik Endüstriler</td><td>Kedi# 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu, nitelikli, Avustralya</td><td>Gibco</td><td>Kedi#10099141</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>Kedi#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prizma 9</td><td>GraphPad Yazılımı</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Ulusal Doğrulanmış Hücre Kültürleri Koleksiyonu</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Daldırma Yağı Tip 37</td><td>Cargille Laboratuvarları</td><td>Kedi #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi#I5500-50MG</td><td>37 &deg'e kadar sıcak; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>LB Et Suyu (1x)</td><td>Davetli</td><td>Kedi#10855001</td><td></td></tr><tr><td>Minimum Temel Ortam (MEM)</td><td>Gibco</td><td>Kedi#11095080</td><td>37 &deg'e kadar sıcak; C kullanmadan önce</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp; Mini Santrifüj</td><td>Termo Bilimsel</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Bir</td><td>Termo Bilimsel</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Plan Fluor 40&times;/1.30 Yağ Lensi</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elementler-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Amino Asitler (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>Kedi#11140050</td><td></td></tr><tr><td>Tek Atışlık LB Agar Plakaları&nbsp;</td><td>Davetli</td><td>Kedi#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 kimyasal olarak yetkin E.&nbsp; Coli</td><td>Davetli</td><td>Kedi#C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>Kedi#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (fosfat tamponlu salin)</td><td>Gibco</td><td>Kedi#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7,033&nbsp; kan basıncı)</td><td>Miura et&nbsp; al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Gibco</td><td>Kedi#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Plazmosin profilaktik</td><td>InvivoGen</td><td>Kedi#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Kedi#P4832</td><td></td></tr><tr><td>Hassas genel amaçlı banyolar</td><td>Termo Bilimsel</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep spin mini hazırlık kiti</td><td>QIAGEN</td><td>Kedi#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>Dotmatics tarafından SnapGene</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Piruvat (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Kedi#11360070</td><td></td></tr><tr><td>Şırınga filtre ünitesi, 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Kırlangıç</td><td>Kedi#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tokai Hit sahne üstü kuluçka makinesi</td><td>TOKAI VURUŞU</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase içermeyen damıtılmış su</td><td>Davetli</td><td>Kedi#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Xfect Transfeksiyon Reaktifi</td><td>Takara Hakkında</td><td>Kedi#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

hepg2 hücrelerinde metabolik olarak düzenlenmiş akt aktivasyon dinamiğinin canlı hücre förster rezonans enerji transferi görüntülemesi

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

HepG2 hücrelerinde Akt aktivasyonunu araştırmak için, hücreler önceden kaplanmış görüntüleme kaplarına ekildi ve Akt fosforilasyonunun gerçek zamanlı izlenmesini sağlamak için tasarlanmış FRET tabanlı biyosensör pEevee-iAkt-NES (Şekil 2A) ile transfekte edildi. Transfeksiyonu takiben, hücreler metabolik durumlarını senkronize etmek ve bazal insülin sinyalini en aza indirmek için serumsuz bir ortamda 4 saat boyunca serum açlığına maruz kaldılar.
Hücreler daha sonra...

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

Hücresel heterojenlik, esasen ortalaması alınan hücresel dinamiklerin inceliklerinin doğru bir şekilde tanımlanmasının önünde bir engeldir. Bu yüzden tek hücreleri görüntülemek için buradayız. Genetik olarak kodlanmış FRET biyosensörlerindeki son gelişmeler, heterogenetiğin anlaşılmasında ve kişiselleştirilmiş ilaç tedavilerinin geliştirilmesinde etkili olan özgüllüğü iyileştirmiş ve hücreler içindeki Akt'nin gerçek zamanlı takibinde devrim yaratmıştır.Kanser ve diyabet karmaşık metabolik yollardan geçer. Kanserde insülin sinyal yolunun biyokarmaşıklığını çözmek için, tek hücre çözünürlüğünde son teknoloji canlı hücre FRET görüntülemeyi kullanıyoruz. Konfokal mikroskop, donanım ve yazılım konfigürasyonunun optimize edilmesinin yanı sıra lazer gücünün ince ayarının yapılmasının ve dedektör kazancının ayarlanmasının, FRET sinyallerindeki herhangi bir gürültüyü ve spektral karışmayı en aza indirmek için kritik öneme sahip olduğunu bulduk.Western blotlama gibi geleneksel toplu yöntemler mekansal zamansal ayrıntıdan yoksundur ve hücresel heterojenliği maskeler. Protokolümüz, hücresel yanıtı yüksek hassasiyet ve doğrulukla yakalamak için canlı hücre FRET görüntülemeyi kullanarak bu boşluğu dolduruyor. Başlamak için, bir görüntüleme kabına mililitre başına 0,1 miligram Poli-L-Lizin çözeltisi ekleyin ve kabı tüm yüzeyi kaplayacak şekilde sallayın.Gece boyunca inkübasyondan sonra, fazla Poli-L-lizin çözeltisini tabaktan aspire edin. Yüzeyi PBS ile 3 kez nazikçe durulayın ve bağlanmamış Poli-L-Lizin'i tamamen çıkarmak için her biri beş dakika dinlendirin. PBS'yi aspire edin ve kaplanmış görüntüleme kabını en az üç saat boyunca 37 santigrat derecede havayla kurutun.Daha sonra, HepG2 hücrelerini, %70 ila 90 birleşmeye ulaştıklarından emin olmak için transfeksiyondan 24 ila 48 saat önce önceden kaplanmış görüntüleme kabına tohumlayın. Transfeksiyon reaktifini, Forster Rezonans Enerji Transferi biyosensörünü kodlayan plazmit ile birlikte çözün ve vorteksleyin. Tüpün dibindeki tüm karışımı toplamak için kısa bir sıkma yapın.Sekiz mikrogram plazmiti reaksiyon tamponu ile yüksek hızda beş saniye boyunca bir girdap kullanarak 100 mikrolitrelik bir nihai hacme kadar karıştırın. Karışımı tüpün dibinde toplamak için kısa bir sıkma yapın. Seyreltilmiş plazma DNA'sını içeren tüpe 2.4 mikrolitre transfeksiyon polimeri ekleyin ve iyice karıştırın.Nanopartikül komplekslerinin oluşmasına izin vermek için biyosensör ve polimer karışımını 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Alttaki içeriği toplamak için tüpü 5.000 G'de beş saniye döndürün. 100 mikrolitre nanopartikül kompleksi çözeltisinin tamamını hücre kültürü ortamına damla damla ekleyin ve karıştırmak için plakayı hafifçe ileri geri sallayın.Plakayı 37 santigrat derecede dört saatten gece boyunca inkübe edin. Nanopartikül komplekslerini hücrelerden çıkardıktan sonra, çözeltiyi iki mililitre taze tam büyüme ortamı ile değiştirin. Plakayı analiz zamanına kadar 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.Floresan mikroskobu altında hücreleri analiz edin. Kültür ortamını görüntüleme kabından çıkarın ve kabı 1X PBS ile iki kez durulayın ve her durulamanın beş dakika sürmesine izin verin. Tabağın kenarındaki her tabağa iki mililitre açlık ortamı ekleyin.Hücreleri 37 santigrat derecede dört saat inkübe edin. Ardından, bilgisayarı açın, ardından konfokal mikroskop ana ünitesini ve aksesuarlarını sırayla açın. Bundan sonra, anahtarı açık konuma çevirerek ve lazer başlatma geçiş anahtarlarını çevirerek lazer sistemini etkinleştirin.Ardından, lazer kilit anahtarlarını her iki lazer çizgisi için saat yönünde açık konuma çevirin. Son olarak, sistem denetleyicisinin gücünü açın. NIS-Elements AR yazılımını masaüstünden başlatın.Görüntüleme kurulumunu başlatmak ve deneysel gereksinimlere göre uygun optik konfigürasyonları seçmek için satın almak için A1'e tıklayın. Mikroskop tablası üst inkübatörünü takın ve vidalarla sabitleyin. Dahili su banyosunu steril, çift damıtılmış suyla doldurun.Ardından üst ısıtıcıyı takın ve sahne ısıtıcısı, banyo ısıtıcısı ve lens ısıtıcısının güç kaynağını açın. 40X yağa daldırma merceğini %95etanol ile nemlendirilmiş mercek kağıdıyla silin ve objektif merceğin üzerine küçük bir damla daldırma yağı damlatın. Ardından, HepG2 hücrelerini içeren görüntüleme kabını mikroskop tablasına yerleştirin ve tutucu ile sabitleyin.Odayı kapatın ve dengelemeye izin vermek için hücreleri bir ila iki saat inkübe edin. NIS-Elements AR'nin Dosya menüsünden ND edinme penceresini başlatın. Zaman aralıklı görüntüleme için aralığı, süreyi ve döngüleri ayarlamak için Zaman sekmesini seçin. XY sekmesine tıklayın ve odak altında görüntüleme için HepG2 hücrelerini dahil etmek için Ekle düğmesine basın.Ardından, Z konumunu ayarlamak için Z kutusunu işaretleyin. Bir hedef klasör seçmek için Gözat'ı tıklatın. Dosya Adı kutusuna deneme adını girin.Alımı başlatmak ve hızlandırılmış görüntüleme sürecini başlatmak için Şimdi çalıştır'a tıklayın. İnsülin takviyeli ortam olmadan 30 dakikaya kadar temel ölçümleri kaydedin. Görüntülemeyi düzenli aralıklarla duraklatın.Ortamı cam tabanlı kaptan yavaşça çıkarın ve uygun insülin konsantrasyonu ile desteklenmiş bir mililitre ortam ekleyin. Görüntü alımını sürdürün ve kapatmak için denemenin sonunda Son'u tıklayın. Son olarak, analiz için elde edilen görüntüleri yedekleyin ve güvenli bir şekilde saklayın.İnsülin stimülasyonu üzerine Akt fosforilasyonunda doza bağlı bir artış gözlendi ve 300 pikomolar insülinde keskin bir artış meydana geldi. Bu konsantrasyonun ötesinde, fosforilasyon seviyeleri plato yaptı ve insülin azaltıldıktan sonra bile düşmedi. Normalleştirilmiş FRET oranı, insülin stimülasyonu üzerine artan bir sinyal ve insülin yoksunluğu üzerine taban çizgisine dönememesi ile benzer bir eğilim gösterdi.Sıralı insülin stimülasyonu üzerine, normalleştirilmiş FRET oranında ilerleyici bir artış gözlendi ve doza bağlı Akt aktivasyon yanıtını destekledi.

live-cell-frster-resonance-energy-transfer-imaging-metabolically

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

FRET tabanlı gazetecilere giderek canlı hücre kinaz ve fosfataz aktiviteleri izlemek için kullanılır. Burada hedef fosforilasyon hücre döngüsü bağımlı değişiklikleri değerlendirmek için FRET tabanlı gazetecilere nasıl kullanılacağı hakkında bir metodu tanımlar.

Hücre Döngüsü FRET oranlı metrik sayesinde Kinaz ve Fosfataz Aktiviteleri İzleme

Lösin açısından zengin tekrar kinazlar 1 ve 2 (LRRK1 ve LRRK2) GTPaz ve kinaz alanları hem kodlama yapan ve hücrelerde fosforile edilmiş olan alanlı proteinlerdir. Burada, bu şekilde genel hücresel fosforilasyonunu seviyelerini ölçmek için bir araç sağlayan 32P ortofosfat ile hücrelerde LRRK1 ve LRRK2 etiketlemek için bir protokol mevcut.

Lösin zengin metabolik etiketleme Fosfat ile radyoaktif Kinazlar 1 ve 2, tekrar

MRP4 hücre göçü bir süre önce aydınlatılmamıştır rolü dahil olmak üzere çeşitli siklik nükleotid-bağımlı sinyal olaylarını düzenler. Biz fibroblast göçü ince ayar düzenlenmesinde önemli roller oynamaktadır benzersiz MRP4 interaktom belirlenmesi ile sonuçlanan MRP4 aşağısında moleküler hedeflerin çözülmeye doğrudan, ama çok yönlü bir yaklaşım açıklar.

Yöntemler Fibroblast Göç Yönetmeliği Mrp4 içeren makromoleküler kompleksler Eğitim için

Burada anjiotensin II tedavi tarafından başlatılan endositoz sırasında yeşil flüoresan protein etiketli anjiotensin tip 1a reseptörlerini eksprese görüntü hücrelere bir protokol mevcut. Bu teknik, zaman içinde, üç boyutlu olarak reseptör ve lizozom ko-lokalizasyonunu analiz yazılımı kullanılarak daha sonra etiket, ikinci bir fluoresan işaretleyici ile lizozomlar ve benzerini kapsamaktadır.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Transfekte İnsan Embriyonik Böbrek Hücreleri Canlı Hücre Görüntüleme ve 3D Analiz Angiotensin Reseptör Tip 1a Ticareti

Sıkı odaklı femtosaniye lazer, gerçek zamanlı gözlem ve fotostimülasyon sağlayan bir Konfokal mikroskopiye birleştirilerek hücrelere hassas stimülasyon sağlayabilir. Fotostimulasyon, ERK sinyalizasyon yolu ve reaktif oksijen türlerinin mitokondriyal yanıp sönme dahil olmak üzere hücre moleküler olaylarını etkinleştirebilir.

Femtosecond lazer tarafından fotostimulasyon hedef hücrelerde Ekstrelüler-sinyal düzenlenmiş kinaz (ERK) sinyalizasyon veya mitokondriyal olayları etkinleştirir

Hematopoetik kök ata hücreleri (HSPCs) kan oluşumu sırasında metabolik plastisite nedeniyle bir farklılaşma durumuna quiescent devlet geçiş. Burada, HSPC'lerin mitokondriyal solunumunu ve glikolizini ölçmek için optimize edilmiş bir yöntem salıyoruz.

Hematopoetik Kök Atasının Hücre Metabolizmasının Analizi

Zaman çözümlü Förster rezonans enerji transfer hücresi tabanlı tahlil protokolleri, endojen fosforile sinyal dönüştürücüsünün ve transkripsiyon aktivatörü (STAT) 1/3/4/5/6 proteinlerinin 384 kuyucuklu bir formatta basit, spesifik, hassas ve sağlam bir şekilde ölçülmesi için tanımlanmıştır.

İnsan Hücrelerinde Endojen Fosforile STAT Proteinlerinin Ölçümü için Zaman Çözülmüş Förster Rezonans Enerji Transfer Testleri

Gerçek zamanlı hücre metabolik akısı testi, pH ve oksijen sensörlerini kullanarak mitokondriyal ve glikolitik adenozin trifosfat üretimine karşılık gelen oksijen tüketim oranını ve hücre dışı asitleşme oranını ölçer. Bu yazıda osteoblastların enerji durumunu ve hücresel biyoenerjetik durumun karakterizasyonu ve yorumlanmasını anlamak için bir yöntem açıklanmaktadır.

Osteoblast Biyoenerjetik Teknolojilerini İzlemek için Gerçek Zamanlı Hücre Metabolik Akı Analizörünü Kullanma

Bu protokol, endojen metabolik koenzimlerin, indirgenmiş nikotinamid adenin (fosfat) dinükleotid (NAD (P) H) ve oksitlenmiş flavin adenin dinükleotidin (FAD) floresan görüntülemesini ve analizini tanımlar. NAD(P)H ve FAD'ın otofloresan görüntülemesi, hücresel metabolizmayı değerlendirmek için etiketsiz, tahribatsız bir yöntem sağlar.

Hücresel Metabolizmayı Değerlendirmek için Otofloresan Görüntüleme

İki foton uyarma floresan mikroskobu (2PEF) ile entegre olan döteryum-oksit (ağır suD2O) problu uyarılmış Raman saçılımı (DO-SRS) mikroskobu kullanılarak amino asitler tarafından düzenlenen hücrelerdeki metabolik aktiviteleri doğrudan görselleştirmek için bir protokol sunuyoruz.

Aromatik Amino Asitler Tarafından Düzenlenen Hücre Metabolizmasının Biyoortogonal Kimyasal Görüntülenmesi

Bu protokol, canlı hücrelerde gerçek zamanlı piruvat metabolizmasını ölçmek için özel olarak oluşturulmuş bir biyoreaktör sistemini hiperpolarize ¹³C NMR spektroskopisi ile entegre ederek metabolik çalışmalar ve ilaç tarama uygulamaları için tekrarlanabilirliği ve kinetik doğruluğu artırır.

Hiperpolarize 13C NMR kullanarak canlı hücrelerde gerçek zamanlı metabolik tespit

Öğrenin, canlı HepG2 hücrelerinde FRET görüntüleme ile Akt aktivasyonunun uzamsal-zamansal dinamiklerini nasıl nicelendireceğinizi. Bu yöntem, kanser metabolizmasındaki insülin sinyal yollarını anlamak için değerlidir.

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi (Video) | JoVE Journal

HepG2 Hücrelerinde Metabolik Olarak Düzenlenmiş Akt Aktivasyon Dinamiğinin Canlı Hücre Förster Rezonans Enerji Transferi Görüntülemesi

Daha fazla video keşfet