Name: G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Keşfedin, tek moleküllü floresan mikroskopi kullanarak DNA polimeraz deltanın G-dörtlü yapılarla etkileşimindeki dinamikleri. Yeni bir değişim yolunun keşfi, DNA replikasyon mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Sutton, M. D., Walker, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Managing+DNA+polymerases%3A+Coordinating+DNA+replication%2C+DNA+repair%2C+and+DNA+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Managing DNA polymerases: Coordinating DNA replication, DNA repair, and DNA recombination.</a> Proc Natl Acad Sci. 98 (15), 8342-8349 (2001).</li>
<li>Burgers Garg, P., J, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+that+propagate+the+eukaryotic+DNA+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases that propagate the eukaryotic DNA replication fork.</a> Crit Rev Biochem Mol Biol. 40 (2), 115-128 (2005).</li>
<li>Burgers, P. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+replication+and+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosoma%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic DNA polymerases in DNA replication and DNA repair.</a> Chromosoma. 107 (4), 218-227 (1998).</li>
<li>Tsai, M. -D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+DNA+polymerases+catalyze+DNA+replication%2C+repair%2C+and+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">How DNA polymerases catalyze DNA replication, repair, and mutation.</a> Biochem. 53 (17), 2749-2751 (2014).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25 (2020).</li>
<li>Chilkova, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eukaryotic+leading+and+lagging+strand+DNA+polymerases+are+loaded+onto+primer-ends+via+separate+mechanisms+but+have+comparable+processivity+in+the+presence+of+PCNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The eukaryotic leading and lagging strand DNA polymerases are loaded onto primer-ends via separate mechanisms but have comparable processivity in the presence of PCNA.</a> Nucleic Acids Res. 35 (19), 6588-6597 (2007).</li>
<li>Sugino Kawasaki, Y., A, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+replicative+DNA+polymerases+and+their+role+at+the+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cells%22%5BJournal%5D)">Yeast replicative DNA polymerases and their role at the replication fork.</a> Mol Cells. 12 (3), 277-285 (2001).</li>
<li>Stillman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+at+the+replication+fork+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases at the replication fork in eukaryotes.</a> Mol Cell. 30 (3), 259-260 (2008).</li>
<li>Shivji Wood, R. D., K, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Which+DNA+polymerases+are+used+for+DNA+repair+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Which DNA polymerases are used for DNA repair in eukaryotes.</a> Carcinogenesis. 18 (4), 605-610 (1997).</li>
<li>Campbell Budd, M. E., L, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+the+eukaryotic+DNA+polymerases+in+DNA+repair+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The roles of the eukaryotic DNA polymerases in DNA repair synthesis.</a> Mutat Res DNA Repair. 384 (3), 157-167 (1997).</li>
<li>Gao Yang, W., Y, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translesion+and+repair+DNA+polymerases%3A+Diverse+structure+and+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Translesion and repair DNA polymerases: Diverse structure and mechanism.</a> Annu Rev Biochem. 87, 239-261 (2018).</li>
<li>Bridges, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+repair%3A+Polymerases+for+passing+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA repair: Polymerases for passing lesions.</a> Curr Biol. 9 (13), 475-477 (1999).</li>
<li>Wilkinson, E. M., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observing+protein+dynamics+during+DNA-lesion+bypass+by+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci.+9%22%5BJournal%5D)">Observing protein dynamics during DNA-lesion bypass by the replisome.</a> Front Mol Biosci. 9. 968424, (2022).</li>
<li>Mueller, S. H., Spenkelink, L. M., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+proteins+play+tag%3A+The+dynamic+nature+of+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">When proteins play tag: The dynamic nature of the replisome.</a> Biophys Rev. 11 (4), 641-651 (2019).</li>
<li>Zybailov, B. L., Sherpa, M. D., Glazko, G. V., Raney, K. D., Glazko, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G4-quadruplexes%2C+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">G4-quadruplexes, and genome instability.</a> Mol Biol. 47 (2), 197-204 (2013).</li>
<li>Monnat Loeb, L. A., J, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+polymerases+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA polymerases and human disease.</a> Nat Rev Genet. 9 (8), 594-604 (2008).</li>
<li>Bryan Oganesian, L., M, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+relevance+of+telomeric+G-quadruplex+formation%3A+A+potential+drug+target%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Physiological relevance of telomeric G-quadruplex formation: A potential drug target.</a> Bioessays. 29 (2), 155-165 (2007).</li>
<li>Chambers, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+sequencing+of+DNA+G-quadruplex+structures+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High-throughput sequencing of DNA G-quadruplex structures in the human genome.</a> Nat Biotechnol. 33 (8), 877-881 (2015).</li>
<li>Cheng, Y., Zhang, Y., You, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+G-quadruplexes+folding%2Funfolding+dynamics+and+interactions+with+proteins+from+single-molecule+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomol%22%5BJournal%5D)">Characterization of G-quadruplexes folding/unfolding dynamics and interactions with proteins from single-molecule force spectroscopy.</a> Biomol. 11 (11), (2021).</li>
<li>Tippana, R., Xiao, W., Myong, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G-quadruplex+conformation+and+dynamics+are+determined+by+loop+length+and+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">G-quadruplex conformation and dynamics are determined by loop length and sequence.</a> Nucleic Acids Res. 42 (12), 8106-8114 (2014).</li>
<li>Kusi-Appauh, N., Ralph, S. F., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+G-quadruplex+biology+and+stability+using+single-molecule+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Understanding G-quadruplex biology and stability using single-molecule techniques.</a> J Phys Chem B. 127 (25), 5521-5540 (2023).</li>
<li>Obi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+G-quadruplex+DNA+structures+in+Schizosaccharomyces+pombe+causes+single-strand+DNA+lesions+and+impedes+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stabilization of G-quadruplex DNA structures in Schizosaccharomyces pombe causes single-strand DNA lesions and impedes DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 48 (19), 10998-11015 (2020).</li>
<li>Kamath-Loeb, A. S., Loeb, L. A., Johansson, E., Burgers, P. M., Fry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+between+the+Werner+syndrome+helicase+and+DNA+polymerase+delta+specifically+facilitate+copying+of+tetraplex+and+hairpin+structures+of+the+d%28CGG%29n+trinucleotide+repeat+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Interactions between the Werner syndrome helicase and DNA polymerase delta specifically facilitate copying of tetraplex and hairpin structures of the d(CGG)n trinucleotide repeat sequence.</a> J Biol Chem. 276 (19), 16439-16446 (2001).</li>
<li>Clayton Kaguni, L. S., A, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template-directed+pausing+in+in+vitro+DNA+synthesis+by+DNA+polymerase+a+from+Drosophila+melanogaster+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Template-directed pausing in in vitro DNA synthesis by DNA polymerase a from Drosophila melanogaster embryos.</a> Proc Natl Acad Sci. 79 (4), 983-987 (1982).</li>
<li>Sato, K., Martin-Pintado, N., Post, H., Altelaar, M., Knipscheer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multistep+mechanism+of+G-quadruplex+resolution+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multistep mechanism of G-quadruplex resolution during DNA replication.</a> Sci Adv. 7 (39), (2021).</li>
<li>Castillo Bosch,, P,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FANCJ+promotes+DNA+synthesis+through+G-quadruplex+structures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">FANCJ promotes DNA synthesis through G-quadruplex structures.</a> EMBO J. 33 (21), 2521-2533 (2014).</li>
<li>Paeschke, K., Capra, J. ohnA., Zakian, V. irginiaA. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+through+G-quadruplex+motifs+is+promoted+by+the+Saccharomyces+cerevisiae+Pif1+DNA+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA replication through G-quadruplex motifs is promoted by the Saccharomyces cerevisiae Pif1 DNA helicase.</a> Cell. 145 (5), 678-691 (2011).</li>
<li>Guo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+efforts+of+replicative+helicase+and+SSB+ensure+inherent+replicative+tolerance+of+G-quadruplex%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci.+%28Weinh%22%5BJournal%5D)">Joint efforts of replicative helicase and SSB ensure inherent replicative tolerance of G-quadruplex.</a> Adv Sci. (Weinh. 11 (9), (2024).</li>
<li>Pham, S. Q. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+quadruplex+DNA-binding+nickel+Schiff+base+complexes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dalton+Trans%22%5BJournal%5D)">A new class of quadruplex DNA-binding nickel Schiff base complexes).</a> Dalton Trans. 49 (15), 4843-4860 (2020).</li>
<li>Georgescu, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+asymmetric+polymerase+assembly+at+the+eukaryotic+replication+fork%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanism of asymmetric polymerase assembly at the eukaryotic replication fork.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (8), 664-670 (2014).</li>
<li>Hansen, J. B., Au, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+protein+concentration+determination+using+the+NanoDrop+2000c+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume protein concentration determination using the NanoDrop 2000c spectrophotometer.</a> J Vis Exp. 33, (2009).</li>
<li>Summer, H., Grämer, R., Dröge, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Denaturing+urea+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28Urea+PAGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis (Urea PAGE).</a> J Vis Exp. 32, (2009).</li>
<li>Geertsema, H. J., Duderstadt, K. E., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGeertsema%2C+HJ+%22in+DNA+Replication%3A+Methods+and+Protocols.%2C+eds+Vengrova%2C+S.%2C+Dalgaard%2C+J%22">in DNA Replication: Methods and Protocols., eds Vengrova, S., Dalgaard, J</a>. , Springer. New York, New York, NY. 219-238 (2015).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+visualization+of+fast+polymerase+turnover+in+the+bacterial+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Single-molecule visualization of fast polymerase turnover in the bacterial replisome.</a> eLife. 6, 23932(2017).</li>
<li>Fish, K. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+%28TIRF%29+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cytom%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy.</a> Curr Protoc Cytom. 12, 12-18 (2009).</li>
<li>Sommers, J. A., Estep, K. N., Maul, R. W., Brosh, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+analysis+of+DNA+synthesis+blockage+by+G-quadruplex+structure+and+bypass+facilitated+by+a+G4-resolving+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Biochemical analysis of DNA synthesis blockage by G-quadruplex structure and bypass facilitated by a G4-resolving helicase.</a> Methods. , 207-214 (2022).</li>
<li>Edwards, D. N., Machwe, A., Wang, Z., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramolecular+telomeric+G-quadruplexes+dramatically+inhibit+DNA+synthesis+by+replicative+and+translesion+polymerases%2C+revealing+their+potential+to+lead+to+genetic+change%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Intramolecular telomeric G-quadruplexes dramatically inhibit DNA synthesis by replicative and translesion polymerases, revealing their potential to lead to genetic change.</a> PLoS One. 9 (1), 80664(2014).</li>
<li>Mueller, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+single-molecule+characterization+of+enzymes+involved+in+nucleic-acid+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Rapid single-molecule characterization of enzymes involved in nucleic-acid metabolism.</a> Nucleic Acids Res. 51 (1), 5(2022).</li>
<li>Lewis, J. S., Van Oijen, A. M., Spenkelink, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embracing+heterogeneity%3A+Challenging+the+paradigm+of+replisomes+as+deterministic+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Embracing heterogeneity: Challenging the paradigm of replisomes as deterministic machines.</a> Chem Rev. 123 (23), 13419-13440 (2023).</li>
<li>Stingele, J., Bellelli, R., Boulton, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA-protein+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA-protein crosslink repair.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (9), 563-573 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100 nt kontrol DNA şablonu</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>Primer uzatma testlerinde birincil kontrol şablonu</td></tr><tr><td>100 nt G4 oluşturan DNA şablonu</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>Primer uzatma testlerinde primer G4 oluşturan şablon</td></tr><tr><td>%15 Mini-PROTEAN TBE-Üre Jel, 12 kuyucuk, 20 &mikro; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4566055</td><td>Jel elektroforezi</td></tr><tr><td>20 nt etiketli/biyotinile primer oligonükleotid</td><td>100 nt şablonlarının primer uzantısı için gerekli</td><td>entegre DNA teknolojileri</td><td></td></tr><tr><td>22 nt kontrol DNA şablonu</td><td>Entegre DNA Teknolojileri</td><td></td><td>Dairesel dikroizm spektroskopisi deneylerinde birincil kontrol şablonu</td></tr><tr><td>22 nt G4 oluşturan DNA şablonu</td><td>Entegre DNA Teknolojiler</td><td></td><td>Dairesel dikroizm spektroskopisi deneylerinde birincil G4 oluşturan şablon</td></tr><tr><td>24 x 24 mm lamel</td><td>Marienfeld Superior</td><td>100062</td><td>TIRF mikroskobu için Gerekli</td></tr><tr><td>3-aminopropiltrietoksisilan</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10668.22</td><td>Lamel işlevselleştirme</td></tr><tr><td>647 nm lazer</td><td>Tutarlı</td><td>1196627</td><td>Leke/boyaya karşılık gelen dalga boyunu seçin Seçim</td></tr><tr><td>670 nm emisyon filtresi</td><td>Chroma Technology Corp</td><td>ET655lp</td><td>Dedektöre yalnızca ilgili dalga boylarının geçmesine izin verilmesini sağlar</td></tr><tr><td>Amersham Typhoon 5 biyomoleküler görüntüleyici</td><td>Cytiva</td><td>29187191</td><td>Jel analizi</td></tr><tr><td>Biotin-PEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>BIO-PEG-SVA-5K-100MG</td><td>Lamel işlevselleştirme</td></tr><tr><td>Deoksinükleotidler trifosfat çözelti karışımı</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-1005L</td><td>Replikasyon yapı taşları</td></tr><tr><td>Dijital kuru banyo (115V)</td><td>Bio-Rad</td><td>1660571</td><td>Isıtma çözümleri</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td>Disülfid bağ indirgeme</td></tr><tr><td>EM-CCD kamera</td><td>Andor</td><td>iXon 897</td><td>Tek moleküllü filmlerin çekimi</td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td>DNA denatüre etme sırasında topluluk DNA replikasyon testleri</td></tr><tr><td>Gaz geçirmez şırınga, 1 mL</td><td>SGE</td><td>21964</td><td>Dairesel dikroizm spektroskopisi için doldurma küveti</td></tr><tr><td>CFI Apo TIRF 100x yağa daldırma objektifi ile ters</td> mikroskop <td>Nikon&nbsp;</td><td>Eclipse Ti-E</td><td>Tek moleküllü TIRF mikroskobunu kolaylaştırır</td></tr><tr><td>J-810 Spektrofotometre</td><td>Jasco</td><td>J-810</td><td>Dairesel dikroizm spektroskopisinin ölçülmesi</td></tr><tr><td>mPEG-SVA (MW 5000)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SVA-5K-100MG</td><td>Lamel işlevselleştirme</td></tr><tr><td>NanoDrop One Spektrofotometre</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>ND-ONE</td><td>Protein ve etiket konsantrasyonlarının ölçülmesi</td></tr><tr><td>NeutrAvidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31000</td><td>Tek moleküllü deneyler sırasında DNA şablonlarının işlevselleştirilmiş lamellere bağlanması</td></tr><tr><td>Polietilen boru</td><td>Instech</td><td>BTPE-60</td><td>Akış hücresi yapımı için gerekli</td></tr><tr><td>Kuvars küvet, 10 mm</td><td>Starna Scientific</td><td>1/Q/10/CD</td><td>Dairesel dikroizm spektroskopisi için numune tutar</td></tr><tr><td>Şırınga pompası</td><td>Adelab Scientific</td><td>NE-1002X</td><td>Tamponları ve substratları bir mikroakışkan akış hücresinden geçirmek için kullanılır</td></tr>: <tr><td>Tris-EDTA tamponu</td>, <td>Thermofisher Scientific</td><td>93283</td>, <td>DNA çözeltisi tamponu</td></tr><tr><td>, Maya, polimeraz ve delta;</td><td>Michael O'Donnell Laboratuvarı</td><td></td><td>DNA şablonlarının çoğaltılması</td></tr><tr><td>Zeba spin tuzdan arındırma kolonu, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89882</td><td>Polimeraz saflaştırması</td></tr></tbody></table>

g-dörtlülerinde dna polimeraz dinamiğinin tek moleküllü floresan görselleştirmesi

Single-Molecule Fluorescence Visualization of DNA Polymerase Dynamics at G-Quadruplexes

Bu test için, floresan olarak işaretlenmiş 20-nt primerli iki DNA substratı tasarlandı: biri G4 oluşturan bir dizi içeren (Şekil 1A, solda) ve diğeri bu dizilimden yoksun (Şekil 1A, sağda). G-dörtlüsünün polimeraz aktivitesi için etkili bir engel olduğunu doğrulamak için, Pol δ ile DNA sentezi, denatüre edici bir PAGE jeli üzerinde izlendi. Saflaştırılmış etiketli Pol δ'nin DNA substratları üzerindeki aktivitesi jel elektroforezi ile incelendi. Şekil 1B (solda), floresan etiketli Pol δ'nin G-dörtlüsünü geçemediğini göstermektedir. Sentezin başlamasından önce (t = 0 dk), şablon iplikten denatüre edilmiş etiketli primeri temsil eden 20 nt'ye karşılık gelen bir bant mevcuttur. 3 dakika sonra, bu 20-nt bandı 60-nt bandına dönüştürüldü, bu da tüm DNA'da sentezin meydana geldiğini ve polimerazın G-dörtlü yapı tarafından tamamen bloke edildiğini doğruladı. Bu blokaj, polimerazın yapıyı ne açabileceğini ne de atlayabileceğini ima eder. Buna karşılık, G-dörtlü oluşturan diziyi içermeyen bir kontrol şablonunun sentezi (Şekil 1A, sağ), 3 dakika sonra 100 nt'lik bir bant üretti (Şekil 1B, sağ).
Şablonlar üzerinde sentezi doğruladıktan ve G-dörtlüsü tarafından verimli bir şekilde bloke edildikten sonra, bu ölçümler polimeraz davranışını izlemek için tek moleküllü bir floresan mikroskobu üzerinde tekrarlandı. DNA şablonları, bir mikroakışkan akış hücresinde işlevselleştirilmiş lamellere (Şekil 2A) bağlandı ve her bir substratın konumu, floresan etiketli primerin görselleştirilmesiyle belirlendi. Daha sonra, sentezi başlatmak için dNTP'lerin varlığında etiketli Pol δ yüklendi. Tipik bir FOV içinde, Pol δ'un DNA'ya ne sıklıkla bağlandığını ve DNA'dan ayrıldığını ölçmek için tek tek noktalar izlenir (Şekil 2B, C). Her bir DNA substratındaki yoğunluğu zamanın bir fonksiyonu olarak ölçerek, tek moleküllü yörüngeler oluşturulabilir (Şekil 2C, Ek Şekil 3). Karakteristik "bekleme süresi" veya Pol δ'ın şablona bağlı kaldığı ortalama süre ölçülebilir. G4 substratı için bekleme süresi 6 s ± 2 s olarak belirlenirken, kontrol substratı için 10 s ± 3 s idi (Şekil 2D, Ek Şekil 4). Ek olarak, her yörünge için Pol δ'ın şablona kaç kez bağlandığı ölçülebilir. G4 substratına bağlanma olaylarının sayısı, kontrol şablonuna kıyasla çok daha yüksektir (Şekil 2E). Skolastik bağlanma ve çözmeden dolayı kontrol şablonunda birden fazla bağlama olayının örnekleri olsa da, G4 oluşturan şablon için ortalama olarak bağlama olaylarının sayısında net bir artış vardır. Bu, sentez G-dörtlüsü tarafından durdurulduktan sonra, çözeltiden yeni polimerazlar sürekli bir bağlanma ve bağlanma döngüsüne girmeden önce bağlı polimerazın DNA'dan ayrıldığını göstermektedir. Bu nedenle, bu tek moleküllü tahlil, DNA polimerazların DNA barikatlarına nasıl tepki verdiğine dair benzersiz bir içgörü sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig01.jpg"> 
Şekil 1: Topluluk primer uzatma testi. (A) DNA substratlarının şematik gösterimi. G4 substratı (solda) bir G-dörtlüsü oluşturan dizi içerirken, kontrol substratı (sağda) içermez. (B) Floresan etiketli maya Pol δ'nin G-dörtlüsü tarafından tamamen bloke edildiğini gösteren astarlanmış G4 ve kontrol DNA substratlarının topluluk DNA primaz uzatma testi. PAGE jeli, DNA şablonlarının zaman içindeki replikasyonunu gösterir, bu da etiketli 20 nt primerin G4 substratı için 60 nt ürüne (solda) ve kontrol şablonu için 100 nt ürüne (sağda) kaymasına neden olur. M, etiketli 20 nt, 60 nt ve 100 nt oligoları içeren bir merdiveni temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68080/68080fig02.jpg"> 
Şekil 2: Tek moleküllü floresan mikroskobu. (A) AF647 etiketli maya Pol δ kullanılarak tek moleküllü primer uzatma testinin şematik gösterimi. (B) Tek moleküllü bir testten elde edilen tipik FOV. Her nokta, bir DNA şablonuna bağlanan floresan etiketli bir Pol δ temsil eder. Ölçek çubuğu: 10 μm. (C) (Üst) Pol δ değişimleri olarak açık/kapalı bağlanmayı gösteren tek moleküllü tahlilden örnek molekül. (Altta) Aynı molekülün deneyin zaman boyunca yoğunluğunu gösteren tek moleküllü yörüngesi. Siyah çizgi, verilere uygun Gizli Markov Modeli'ni (HMM) temsil eder. (D) Pol δ'nin G4 alt tabakası (mor) ve kontrol alt tabakası (gri) üzerinde bekleme süresi. Çizgiler üstel uyumları temsil eder ve G4 alt tabakasında 6 sn ± 2 sn ve kontrol alt tabakası üzerinde 10 sn ± 3 sn kullanım ömrü sağlar. (E) Tek DNA substratlarına Pol δ bağlanma olaylarının sayısı. G4 substratı (mor) üzerindeki ortalama bağlanma olayı sayısı, kontrol substratı 1 (gri) ile karşılaştırıldığında 3.5'tir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/68080fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 1: CD spektroskopisi. 25 ° C'de 200 mM KCl içeren TE tamponunda G4 oluşturan (mor) ve kontrol dizisinin (gri) CD spektrumları. 260 nm'deki karakteristik tepe noktası, ardından 240 nm'deki negatif tepe noktası, paralel, molekül içi bir GQ'nun karakteristiğidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%201%20(CD).pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 2: Akış hücresi yapısı. (A) Akış hücresinin tek tek parçalarının şeması. Kare PDMS bloğu, mikroskop lamel üzerine oturur. Bu parçalar daha sonra kapağın içine ve akış hücresi tutucusunun altına yerleştirilir. (B) Tam akış hücresi. Tamponların mikroakışkanlar aracılığıyla cihazdan geçirilebileceği kanalları oluşturmak için PDMS bloğunun her iki tarafına tüpler yerleştirilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%202%20(Flow%20Cell).pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 3: Tek moleküllü yörüngeler. (A) Deneyin 10 dakikalık zaman dilimi boyunca tek bir bağlanma olayına uğrayan bir molekülün örnek yörüngesi. (B) Deneyin 10 dakikalık zaman dilimi boyunca sıfır bağlanma olayına uğrayan bir molekülün örnek yörüngesi. (A) ve (B)'deki siyah çizgi, verilere uyan Gizli Markov Modelini (HMM) temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%203%20(Extra%20Traces).pdf" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 4: Bekleme süreleri. (A) Pol δ'in G4 substratı üzerinde bekleme süresi. Çizgi, üstel uyumu temsil eder ve 6 sn ± 2 sn arasında bir kullanım ömrü sağlar. (B) Pol δ'nin kontrol substratı üzerinde bekleme süresi. Üstel uyum, 10 sn ± 3 sn kullanım ömrü sağlar. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%204%20(Split%20Lifetimes).pdf" target="_blank">Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Şekil 5: Foto ağartma kontrolü. Grafik, tek bir AF647 etiketli maya Pol δ enziminin 647 nm lazer tarafından fotoağartılması için ortalama süreyi göstermektedir. Çizgi, üstel uyumu temsil eder ve 39 ± 6 sn kullanım ömrü sağlar. Bu <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68080/Supp%20Figure%205%20(Photobleaching%20Control).pdf" target="_blank">dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

The ability of proteins&#160;involved in eukaryotic DNA replication to&#160;overcome obstacles &#8212; such as protein and DNA ...

single-molecule-fluorescence-visualization-dna-polymerase-dynamics-at

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz gelecekteki nükleik asit temelli tedaviler için daha iyi kontrol ve sentez üniforma ve özelleştirilebilir polyplexes sağlaması bekleniyor polielektrolit polyplexes oluşumunu araştırmak için yeni ve güçlü bir entegrasyon sahipliği yapacaktır (QD-FRET) ve Mikroakiskan sunuyoruz.

Birleştiren QD FRET Mikroakiskan Real-Time DNA Nanocomplex Self-Meclis Monitör

Bu protokol, gerçek zamanlı olarak bireysel replisomes DNA replikasyonu görselleştirmek için basit bir tek-molekül floresan mikroskopi tekniği gösterir.

Floresan Mikroskop ile görselleştirme Tek molekül DNA replikasyonu

Biz bireysel DNA molekülleri bakteriyofaj çoğaltma sistemi proteinleri aracılığı ile gerçek zamanlı çoğaltma gözlemlemek için bir yöntem açıklanmaktadır.

Enzimlerin Klonlanması DNA Doğrudan Gözlem Tek bir molekülü DNA Testi Esneme

Bu çalışma, tek bir molekül flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) kullanılarak çift sarmallı DNA ilmek dinamiklerini ölçmek için bir ayrıntılı deneysel prosedür sunmaktadır. Protokol ayrıca J faktörü denilen döngü olasılık yoğunluğunu ayıklamak için nasıl açıklar.

Tek Molekül FRET DNA döngü oluşturma incelenmesi

G-quadruplexes işlemek için bir tek molekül manyetik cımbız platform, G4 istikrar ve yönetmelik çalışması için izin veren çeşitli proteinler tarafından bildirilmektedir.

G-quadruplexes manyetik cımbız tarafından manipülasyon tek molekül

Burada, DNA-protein etkileşimleri site-specifically değiştirilmiş λ DNA substrat ve protein etiketli bir kuantum nokta kullanarak toplam iç yansıma floresans mikroskobu tarafından (TIRFM) eğitim için bir iletişim kuralı mevcut.

Qdot etiketli Protein ve Site-specifically tarihinde λ DNA molekülünü düzeyinde arasındaki etkileşimi görüntülenmesi

Kuantum nokta etiketli DNA ve toplam iç yansıma floresan mikroskobu kullanarak, etiketlenmemiş protein kullanırken kısıtlama endonükleazlarının reaksiyon mekanizmasını araştırabiliriz. Bu tek moleküllü teknik, bireysel protein-DNA etkileşimlerinin büyük ölçüde çoğullanmış gözlemine izin verir ve veriler, iyi doldurulmuş bekleme süresi dağılımları oluşturmak için bir araya getirilebilir.

Restriksiyon endonükleaz aracılı DNA bölünmesinin tek moleküllü bekleme süresi analizi

Mikroakışkan odalar aracılığıyla incelenen görsel, tek moleküllü biyokimya, cam varil, gaz geçirmez şırıngalar, boruların akış hücrelerine kararlı bağlantıları ve şırıngalar ve borular arasına anahtarlama valfleri yerleştirilerek kabarcıkların ortadan kaldırılması kullanılarak büyük ölçüde kolaylaştırılmıştır. Protokol, DNA işlemlerinin ve moleküller arası etkileşimlerin görselleştirilmesini sağlayan çift optik tuzakları tanımlar.

Tek Moleküllü Çalışmalarda Çift Optik Cımbız ve Mikroakışkan Kullanımı

Bis-3-kloropipiperidinler (B-CeP'ler), in vitro DNA şablonlarındaki G-dörtlü yapıları tanımlamak ve karakterize etmek için yararlı kimyasal problardır. Bu protokol, B-CeP'ler ile sondalama reaksiyonları gerçekleştirme ve reaksiyon ürünlerini yüksek çözünürlüklü poliakrilamid jel elektroforezi ile çözme prosedürünü detaylandırır.

In Vitro G-Quadruplex DNA Yapılarının Bis-3-Kloropiperidinler ile Kimyasal Haritalanması

Optik bir tuzakta yerinde tutulan doğrusal DNA molekülleri üzerindeki floresan etiketli, tamamen yeniden yapılandırılmış Cdc45 / Mcm2-7 / GINS (CMG) helikazının hareketini doğrudan görüntülemek ve ölçmek için hibrit bir topluluk ve tek moleküllü bir test sunuyoruz.

Tamamen Yeniden Yapılandırılmış CMG'nin Hareketini Görüntülemek için Hibrit Topluluk ve Tek Moleküllü Test

Bu protokol, CMG sarmal ile çözülen DNA'nın canlı görselleştirilmesi için tek moleküllü bir testin gerçekleştirilmesini gösterir. (1) bir DNA substratının hazırlanmasını, (2) floresan etiketli Drosophila melanogaster CMG helikazının saflaştırılmasını, (3) toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskobu için bir mikroakışkan akış hücresinin hazırlanmasını ve (4) tek moleküllü DNA çözme tahlilini açıklar.

CMG Helikaz ile DNA Çözmenin Tek Moleküllü Gerçek Zamanlı Görselleştirilmesi

Keşfedin, tek moleküllü floresan mikroskopi kullanarak DNA polimeraz deltanın G-dörtlü yapılarla etkileşimindeki dinamikleri. Yeni bir değişim yolunun keşfi, DNA replikasyon mekanizmalarının anlaşılmasına katkı sağlar.

G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Daha fazla video keşfet