G-Dörtlülerinde DNA Polimeraz Dinamiğinin Tek Moleküllü Floresan Görselleştirmesi

Çalışmamız, karmaşık biyolojik sistemlerdeki dinamikleri incelemek için tek moleküllü metodolojinin geliştirilmesi ve kullanılmasına odaklanmaktadır. Özellikle, DNA polimerazların barikatlarla karşılaştığında nasıl davrandığını, bu durumda G-dörtlülerini öğrenmekle ilgileniyoruz. Bir G-dörtlüsü ile karşılaştığımızda tek tek DNA polimerazlarının davranışını görmemizi sağlayan floresan görselleştirmeye dayalı tek bir molekül yöntemi geliştirdik.

Tahlilimizle, polimerazın düşeceği ve yenisinin yeniden bağlanacağı G-dörtlülerine çarptığında DNA polimeraz deltası için daha önce karakterize edilmemiş bir değişim yolu belirledik. Geliştirilen protokolümüzle nihayet şu soruyu cevapladık: Kinetik ve mekaniğin zaman içinde nasıl değiştiğini gerçek zamanlı olarak görebildiğimiz gibi, farklı DNA polimerazlar bir G-dörtlüsü ile karşılaştıklarında nasıl davranırlar? Başlamak için, işlevselleştirilmiş bir kapak fişini bir vakumdan çıkarın ve nemli bir ortam oluşturmak için kısmen suyla doldurulmuş bir mikro tüp rafına yerleştirin.

100 mikrolitre bloke edici bir tamponu bir tüpe pipetleyin, ardından 25 mikrolitre NeutrAvidin solüsyonu ekleyin ve iyice karıştırın. Solüsyonu kapak kaymasının yüzeyine yayın ve nemli kutuda oda sıcaklığında 15 dakika inkübe etmesine izin verin. Ardından, kapak fişini suyla yıkayın, ardından nitrojen gazı kullanarak kurulayın.

Bir akış hücresi tutucusu içindeki kapak kızağına özel yapım bir polidimetilsiloksan bloğu yerleştirin. Polietilen tüpleri akış hücresindeki deliklere yerleştirin. Şimdi, çözeltilerden gazları serbest bırakmak için bir mililitrelik Tween bloke edici tampon, 500 mikrolitre yıkama tamponu ve replikasyon tamponunu 15 dakika boyunca 40 santigrat dereceye ısıtın.

Çözeltileri bir vakum odasında atmosferik basıncın 800 milibar altında 15 dakika daha gazdan arındırın. Hedefe bir damla yağ sürün. Yapılandırılmış bir akış hücresi alın ve mikroskop sahnesine yerleştirin.

Ardından, kapak fişini karşılamak için hedefi yükseltin. Giriş borusunu gazı alınmış Tween engelleme tamponuna yerleştirin ve çıkışı şırınga pompasına bağlayın. Ardından, Tween engelleme tamponunu borudan kanala çekmek için şırıngayı geri çekin.

Tween blokaj tamponunu boşaltmak için 200 mikrolitre gazı alınmış yıkama tamponunu dakikada 100 mikrolitre hızında kanala akıtın. Şimdi, DNA şablon çözeltilerini 500 mikrolitre replikasyon tamponunda 0.5 picomolar'a seyreltin. Çözeltinin 150 mikrolitresinin dakikada 10 mikrolitre hızında kanala akmasına izin verin.

Tek tek DNA şablonlarını görselleştirmek için numune düzleminde santimetre kare başına yaklaşık 900 miliwatt hızla 647 nanometrelik bir lazer kullanarak numuneyi aydınlatın. Yeterli yoğunlukta nokta göründüğünde, fazla DNA'yı yıkamak için taze bir replikasyon tamponu çözeltisi içinde akıtın. Yeni bir görüş alanına geçin ve etiketli polimeraz ile DNA substratı arasındaki kolokalizasyon derecesini belirlemek için DNA'nın bir görüntüsünü yakalayın.

Tamamlandığında, kalan lekeleri foto-ağartmak için lazer gücünü artırın. Daha sonra, replikasyon tamponunda ditiyotreitol, dNTP'ler ve bir floresan probu içeren bir polimeraz çözeltisi hazırlayın. Polimeraz çözeltisinin 100 mikrolitresini dakikada beş mikrolitre oranında kanala akıtın.

Numune odaklandıktan ve toplam iç yansıma floresan açısı ayarlandıktan sonra, 647 nanometre lazerin lazer gücünü numune düzleminde santimetre kare başına yaklaşık 900 miliwatt'a ayarlayın. İstenen süre boyunca görüş alanını görüntülemeye başlayın. G-dörtlü dizi, sayfa jelinde 60 nükleotid bandının varlığı ile gösterildiği gibi polimeraz delta sentezini bloke ederken, G-dörtlüsü olmayan kontrol substratı 100 nükleotid bandı üretti.

Tek moleküllü floresan mikroskobu, polimeraz deltasının, 11 artı veya eksi üç saniyelik bir bekleme süresine sahip olan kontrol substratına kıyasla, G-dörtlü substrat üzerinde altı artı veya eksi iki saniyelik daha kısa bir bekleme süresine sahip olduğunu doğruladı. Polimeraz delta bağlanma olaylarının sayısı, G-dörtlü substrat üzerinde kontrole kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti, bu da sentez blokajına bağlı olarak çoklu bağlanma ve bağlanmama döngülerini düşündürdü.