Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Neokorteksteki mikrodevrelerin ağ dinamiklerini anlamak için, çok sayıda nöronun aktivitesini in vivo olarak eş zamanlı kaydetmek esastır. Kalsiyum görüntüleme, yoğun bir nöronal popülasyonun aktivitesini tek hücre çözünürlüğünde kaydetmeye olanak tanıyan tek yöntemdir.

Yöntem, bir kranial görüntüleme penceresinin implante edilmesini, çok sayıda nöron tarafından alınabilen floresan bir kalsiyum boyasının enjekte edilmesini ve son olarak, zaman ayarlı kalsiyum görüntüleme ile nöronların aktivitesinin kaydedilmesini içermektedir. Merhaba, ben UCLA David Geffen Tıp Fakültesi Nöroloji Bölümü'nde, Carlos Porter Cayo'nun laboratuvarından Payman. Önceki videolarda laboratuvarımız, farelerde kraniyotomi gerçekleştirme ve kan akışının iki fotonlu görüntülemesi için bir prosedür göstermişti.

Bugün size farelerde in vivo iki foton kalsiyum görüntüleme gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Öyleyse başlayalım. Başlamadan önce, boya enjeksiyon solüsyonu hazırlanmalıdır.

İlk olarak, floresan kalsiyum indikatör solüsyonunu hazırlayın. Kısaca etil ester boyalar veya AM boyaları olarak adlandırılan boyaları kullanıyoruz. Bunlar, hücre dışına enjekte edildiklerinde hücreler tarafından alınabilen boyalardır; tipik olarak 1 mM konsantrasyonda organ green BAFTA 1:00 AM veya flu oh 4:00 AM kullanırız.

İlk olarak %20'lik onic F1 27 çözeltisi hazırlarız. DMSO içindeki çözeltiyi, her gün kullanmadan önce berraklaşana kadar ısıtırız. Kalsiyum indikatörünü, %20'lik onic F1 27 DMSO içinde 10 milimolar konsantrasyona ulaşana kadar 15 ila 20 dakika boyunca çözeriz.

Ardından çözeltiyi; 50 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM HEPES ve pH 7,4 içeren çözelti ile bir milimolar olacak şekilde seyrelttik ve 10 ila 20 dakika daha vortekslendik. Astrositleri seçici olarak işaretlemek için 100 mikromolar sulforodamin 101 ekledik ve boya enjeksiyonu sırasında pipeti görüntülemek için, görüntülenecek bölgenin üzerine bir kraniyal pencere implante ettik. Bu cerrahiye yönelik genel yaklaşım, daha önce yayınladığımız bir JoVE video makalesinde tarafımızca açıklanmıştır, ancak kalsiyum boyası enjeksiyonu için aşağıdaki modifikasyonlar önem taşımaktadır.

İlgilenilen kortikal bölge üzerinde, altındaki duraya zarar vermemeye azami özen gösterilerek iki milimetre çapında daha küçük bir kraniyotomi yapılır. Kraniyotominin üzerine bir kapatma camı sabitlenir, ancak kraniyotomi sadece kısmen kapatılarak, enjeksiyondan önce pipetin kortekse eğik bir şekilde girmesi için kraniyotomi kenarı ile cam kapatma camı arasında küçük bir boşluk bırakılır. Kraniyotominin çevresine diş hekimi çimentosu ile sığ bir kuyu oluşturulur.

Kalsiyum görüntüleme deneyleri için kullanılan kuyucuk, rostral yönde mümkün olduğunca ileriye uzanmalı ve enjeksiyon mikro pipetinin yerleştirilmesine izin verecek kadar sığ olmalıdır; solüsyonu enjeksiyondan hemen önce 0,45 mikronluk bir santrifüj filtresiyle filtreliyoruz. Ardından fare, mikroskobun tablasına transfer edilir ve kafa, kan akışı görüntüleme videomuzunda gösterildiği şekilde sabitlenir. Sonrasında, cam mikro elektrot pipetlerini iki ila dört mega ohm direnç sağlayacak bir uç çapına gelecek şekilde çekiyoruz.

Bir pipet çekici kullanılarak, kalsiyum indikatör boya karışımı cam pipete yüklenir. Bir mikro manipülatör eşliğinde mikro şırınga kullanılarak, mikro pipet 4x objektif yardımıyla beyin yüzeyine nazikçe indirilir ve ardından daha hassas bir şekilde konumlandırılır. 40x objektif altında, üzerinde az sayıda kan damarı bulunan veya hiç kan damarı olmayan uygun bir enjeksiyon bölgesi seçilir.

İki foton mikroskopisi kullanılarak görüntüleme yapılırken, mikro pipetin ucu görselleştirilir ve duranın 200 mikrometre altına kadar kortekse doğru yavaşça ilerletilir. Bu işlemi mümkün olduğunca doğru gerçekleştirmek için, objektifin Z odak değeri sıfıra ayarlanır. Dura görselleştirildiğinde mikro pipet görünür hale getirilir ve mikro pipet beynin içine, duranın 200 mikrometre altına kadar indirilirken Z odak değeri alınır.

Ardından D karışımı, 10 PSI basınçla bir dakika boyunca enjekte edilir. Bir pico spritzer kullanarak, genellikle yaklaşık 200 ile 300 mikron aralıklarla iki ila dört adet AM kalsiyum boya karışımı enjeksiyonu yaparız. Hafifçe örtüşen enjeksiyonlardan oluşan bu toplu yükleme yaklaşımı, 600 x 600 mikron büyüklüğündeki bir alanın kalsiyum görüntüleme için yeterince boyanmasını sağlar.

Boyanın difüze olması ve nöronlar tarafından alınması için görüntüleme, am boya karışımının enjeksiyonundan bir saat sonra başlar. In vivo iki foton görüntüleme, 800 ila 880 nanometreye ayarlanmış bir chameleon ty safir lazer ve Cambridge teknolojisi kullanan özel yapım bir iki foton mikroskobu ile gerçekleştirilir. Görüntüler, Carl's Vida's tarafından geliştirilen scan image yazılımı kullanılarak galvanometre aynaları ile elde edilir.

Laboratuvar lazer gücü, numune noktasında tipik olarak 70 milliwatt değerinin oldukça altındadır. Tüm alan görüntüleri, 20 x 0.95 NA Olympus objektifi kullanılarak saniyede 1,95 ila 15,63 kare hızında, beş adet 12 x 256 piksel ile 256 x 64 piksel boyutlarında elde edilir. Görüntüleme sırasında çizgi taramaları 500 hertz hızında gerçekleştirilir.

Hayvanlar, %0,6 ile %0,9 arasında hafif izofluran anestezisi altında tutulur ve ayrıca bir Harvard cihazı kullanılarak 37 °C'de sabitlenir. Sıcaklık kontrol cihazı ile hayvanların solunum hızının dakikada 100 nefese mümkün olduğunca yakın tutulmasına özen gösterilir. Kullanılan bu anestezi seviyesi, hayvanı hareketsiz hale getiren ancak yine de spontan aktivitenin kaydedilmesine izin veren en düşük seviyedir.

Şimdi tipik bir kalsiyum görüntüleme deneyine göz atalım. Postnatal 2-10 günlük bir farenin somatosensör barrel korteksinden alınan iki üç nöron, organ green BTA am ile boyanmış ve 20x 0,95 NA objektif ile görüntülenmiştir.

Görüntüler her 0,512 saniyede bir alınmıştır. Bu üç dakikalık film, bu boyalı nöronların büyük bir kısmının dakikada bir ila iki kez gerçekleşen ko-aktivasyonunu göstermektedir. Serebral korteksin ikinci ve üçüncü tabakasındaki ağ aktivitesinin in vivo kalsiyum görüntülemesinin nasıl yapılacağını göstermiş olduk.

Bu yöntemin elektrofizyolojik kayıtlara göre avantajı, daha az invaziv olması ve yoğun nöronal ağlardaki aktivitenin kaydedilmesine olanak sağlamasıdır. Bu prosedür uygulanırken, kraniyotomi sırasında duraya zarar vermemek için son derece dikkatli olunması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Küçük miktarda bir subdural kanama bile görüntülemeyi büyük ölçüde bozacaktır. İşte bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.