Name: Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Öğrenin fare neokorteksindeki mikrodevre dinamiklerini in vivo 2-foton kalsiyum görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem yoğun nöron popülasyonlarının tek hücre çözünürlüğünde kaydını sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz kalsiyum göstergelerin toplu yükleme optimize yararlı tartışmalar için Olga Garaschuk kabul etmek istiyorum.

<ol><li> Floresan kalsiyum indikatör çözeltisi hazırlayın. Biz kısa boyalar acetoxymethyl ester boyaların kullanımı, veya AM. Bunlar ekstraselüler enjekte edilen hücreler tarafından alınabilir boyalar. Biz genellikle 1 mM konsantrasyonda Oregon-Yeşil BAPTA 01:00 AM Fluo-4 kullanın. AM boyalar 50 mikrogram flakonlarda Invitrogen elde edilebilir. Biz ilk DMSO F-127 Pluronic% 20&#39;lik bir çözelti hazırlamak. Biz temizleyene kadar her gün kullanmak için önce çözüm sıcak. Biz kalsiyum göstergesi 10 mM konsantrasyon 15-20 dakika için% 20 Pluronic F-127/DMSO çözülür. 150 NaCl, 2.5 KCl, 10 Hepes, pH 7.4: Daha sonra mM içeren bir çözüm, çözüm için 1mm sulandırmak. Buna ek olarak, 100 mcM Sulforhodamine 101 genellikle etiket astrositler dahil edilir ve enjeksiyon sırasında pipet görselleştirmek. Biz 0.49 mikron santrifüj filtre (; Garaschuk ve ark, 2006 Stosiek ve ark, 2003) ile enjeksiyon için önce çözüm filtresi. </li><li> Görüntülenecek alana bir kafatası pencere İmplant. Biz <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=680" target="_blank">vallahi de genel yaklaşım tarif</a> , ancak aşağıdaki değişiklikler kalsiyum boya enjeksiyon için önemlidir: Altta yatan dura zarar vermemek için aşırı özen, ilgi kortikal alana çapı 2 mm daha küçük bir kraniotomi olun. Kraniotomi üzerinde bir yerde lamel Güvenli, ama sadece kısmen korteks oblik girmek için bir pipet için oda izin kraniotomi kenarında ve cam lamel arasında küçük bir boşluk bırakarak, kraniotomi kapsayacak. Enjeksiyonu öncesinde, kraniotomi etrafında diş çimento ile sığ bir kuyu. Iyi yönde rostral genişletmek ve enjeksiyon için mikropipet ekleme yetecek kadar sığ olmalıdır. </li><li> Mikroskop aşamasında transfer fare transferi ve bizim gösterildiği gibi, baş hareketsiz <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=678" target="_blank">kan akışını görüntülemede video</a> . </li><li> 2-4 Mega Ohm direnç veren bir pipet çektirmenin kullanarak, bir ucu çapı, cam mikroelektrot pipetler çekin. Yük, bir mikroenjektör kullanarak cam pipet üzerine kalsiyum göstergesi boya karışımı. Bir mikromanipülatör kullanarak, sonra ince bir 40X amaç altında konumlandırılmış 4X objektif kullanarak beynin yüzeyine hafifçe mikropipet düşüktür. Görüntüleme gizlemek için az ya da hiç örten kan damarları olduğu gibi enjeksiyon için uygun bir yer seçin. Iki foton mikroskobu kullanarak, pipet ucu, dura altında 200 mikrometre arasında bir derinliğe kadar görüntülenebilmekte ve korteks yavaş yavaş içine gelişmiş. Sonra, basınç, Picospritzer kullanarak 1 dakika için 10 PSI boya karışımı enjekte edilir. Biz genellikle yaklaşık 200-300 mikron uzayda ayrılmış 03:58 AM kalsiyum boya karışımı enjeksiyon, sağlar. Toplu yükleme biraz üst üste enjeksiyonları Bu yaklaşım, 600 x 600 mikrona kadar büyük bir alan, yeterince kalsiyum görüntüleme için boyanmış olmasını sağlar. Diffüz ve nöronlar tarafından alınacak boya için izin vermek için, 1 saat sonra görüntüleme AM boya karışımı enjeksiyon başlayın. </li><li> In vivo iki foton özel bir görüntüleme Chameleon Ti-Safir Lazer (800-880 nm ayarlı) ve Cambridge Teknoloji galvanometre aynalar kullanılarak yapılan iki foton mikroskop gerçekleştirin. Karel Svoboda laboratuarı (Pologruto ve ark, 2003) geliştirilen ScanImage Yazılımı kullanarak görüntü kazanır. Lazer Gücü genellikle iyi örnek az 70 mW altında. Tüm alanında görüntüler ya saniyede 1,95-15,63 kare (256 x 64 piksel 512 x 256 piksel) 20X (0.95 NA) veya 40X (0.8 NA) Olympus hedefleri kullanarak elde edilir. Hat taramaları 500 Hz elde edilir. Görüntüleme sırasında, hayvanlar, hafif izofluran anestezi altında (0.6-0.9%) tutulur ve ayrıca 37 tutulur ° C Harvard Aparatı Sıcaklık Kontrol Cihazı kullanarak. Bakım hayvanların solunum hızı 100 soluk / dk mümkün olduğunca yakın olarak tutmak için alınır. Bu seviye, anestezi kullanımı, hayvan durduran en düşük seviyede, ama yine de kayıt altına spontan aktivite izin verir. </li></ol>

<ol><li>Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+bulk-loading+of+fluorescent+indicators+for+two-photon+brain+imaging+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo.</a> Nat Protoc. 1, (2006).</li>
<li>Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-vivo+two-photon+calcium+imaging+of+neuronal+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).</li>
<li>Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScanImage%3A+flexible+software+for+operating+laser+scanning+microscopes.%26nbsp%3B%26nbsp%3B+Biomed+Eng+Online+2%3A13%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Eng+Online%22%5BJournal%5D)">ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes.&nbsp;&nbsp; Biomed Eng Online 2:13.</a> Biomed Eng Online. 2, (2003).</li>
</ol>

Bu yöntemin avantajı, elektrofizyolojik kayıtlar üzerinde daha az invaziv ve yoğun nöron nöron ağları faaliyet kayıtları izin vermesidir. Bu işlemi yaparken kraniotomi yaparken dura zarar vermemek için aşırı dikkat çekmek için hatırlamak önemlidir. Subdural kanama bile küçük bir miktar büyük ölçüde görüntüleme belirsiz.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green BAPTA1-AM</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>O-6807</td><td></td></tr><tr><td>Fluo 4- AM</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>Sulforhodamine 101</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>S-359</td><td></td></tr><tr><td>DMSO içinde Pluronic F-127</td><td>Reaktif</td><td>Invitrogen</td><td>P-3000MP</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj Filtresi (0.45 micron)</td><td>Reaktif</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC3 0HV 0S</td><td></td></tr></tbody></table>

katman in vivo 2-foton kalsiyum görüntüleme fare 2 / 3

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem. Bu yöntem, çok sayıda nöron tarafından alınan ve son olarak in vivo iki foton mikroskop kullanarak zaman atlamalı kalsiyum görüntüleme ile nöron aktivitesini kayıt olabilir floresan kalsiyum göstergesi boya enjekte kraniyal görüntüleme penceresi implante oluşur. Astrosit özel boyalar ko-enjeksiyon astrositler gelen nöronların ayırt etmek sağlar. Bu teknik, farelerde farklı hücre grupları ağ etkileşimi daha iyi anlamak için, nöron spesifik alt popülasyonlar floresan moleküller ifade yapılabilir.

Neokorteks mikrodevreler ağ dinamiklerini anlamak için, aynı anda çok sayıda nöron aktivitesini kaydetmek için esastır. In vivo iki foton kalsiyum görüntüleme, bir tek hücre çözünürlük ile yoğun bir nöronal nüfusun faaliyet kaydetmenize olanak sağlayan tek yöntem.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Neokorteksteki mikrodevrelerin ağ dinamiklerini anlamak için, çok sayıda nöronun aktivitesini eş zamanlı olarak kaydetmek esastır.

Neokorteksteki mikrodevrelerin ağ dinamiklerini anlamak için, çok sayıda nöronun aktivitesini in vivo olarak eş zamanlı kaydetmek esastır. Kalsiyum görüntüleme, yoğun bir nöronal popülasyonun aktivitesini tek hücre çözünürlüğünde kaydetmeye olanak tanıyan tek yöntemdir.Yöntem, bir kranial görüntüleme penceresinin implante edilmesini, çok sayıda nöron tarafından alınabilen floresan bir kalsiyum boyasının enjekte edilmesini ve son olarak, zaman ayarlı kalsiyum görüntüleme ile nöronların aktivitesinin kaydedilmesini içermektedir. Merhaba, ben UCLA David Geffen Tıp Fakültesi Nöroloji Bölümü'nde, Carlos Porter Cayo'nun laboratuvarından Payman. Önceki videolarda laboratuvarımız, farelerde kraniyotomi gerçekleştirme ve kan akışının iki fotonlu görüntülemesi için bir prosedür göstermişti.Bugün size farelerde in vivo iki foton kalsiyum görüntüleme gerçekleştirme prosedürünü göstereceğiz. Öyleyse başlayalım. Başlamadan önce, boya enjeksiyon solüsyonu hazırlanmalıdır.İlk olarak, floresan kalsiyum indikatör solüsyonunu hazırlayın. Kısaca etil ester boyalar veya AM boyaları olarak adlandırılan boyaları kullanıyoruz. Bunlar, hücre dışına enjekte edildiklerinde hücreler tarafından alınabilen boya

in-vivo-2-photon-calcium-imaging-in-layer-23-of-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Nöronlarda deneyim-bağımlı moleküler değişiklikler davranışsal sorunlara yanıt olarak adapte beyin yeteneği için gereklidir.

Kortikal Nöronlar In Vivo İki foton Of Görüntüleme Deneyimi bağımlı Moleküler Değişiklikler

Burada bir sanal gerçeklik ortamında davranış sırasında fare korteksin iki foton görüntüleme katılan deneysel işlemleri.

Sanal Gerçeklik Çevre gezinme Farelerde iki foton Kalsiyum Görüntüleme

Canlı hayvanda hızlandırılmış görüntüleme, sağlam beyindeki yapısal yeniden yapılanma hakkında değerli bilgiler sağlar. Burada, canlı fare korteksindeki floresan etiketli sinaptik yapıların iki foton mikroskobu ile transkraniyal görüntülenmesine izin veren inceltilmiş bir kafatası preparatını tanıtıyoruz.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

Burada, serbest hareket eden farelerde çoklu korteks tabakaları boyunca hücresel çözünürlük ile büyük ölçekli Ca 2+ görüntülemenin gerçekleştirilmesi için bir prosedür sunuyoruz. Yüzlerce aktif hücre, implante edilmiş bir prizma probu ile birleştirilmiş minyatür, başa monte mikroskop kullanarak eş zamanlı olarak gözlemlenebilir.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

Biz bir in vivo serebral korteks yenidoğan farelerin görüntüleme için protokol Imaging iki fotonlu mevcut. Bu yöntem kortikal nöronlar, nöronal dinamikleri ve hastalık modelleri nöronal dinamiklerini değişiklikleri kontrol moleküler mekanizmaları gelişimsel dinamiklerini analiz etmek için uygundur.

Vivo Yenidoğan farelerde kortikal nöronların iki fotonlu görüntüleme

Bu yöntem, yaşayan farelerin Hippocampus optik erişim sağlayan kronik bir hazırlık açıklar. Bu hazırlık, birkaç hafta boyunca nöronal yapısal plastisite ve aktivite-uyarılmış hücresel plastisite uzunlamasına optik görüntüleme gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Canlı fareler içinde dorsal hipokampal CA1 uzunlamasına Iki foton görüntüleme

Yetişkin farenin beyin ata tarafından beyin atmasını ortaya çıkarmak için bir protokol sunuyoruz. Minyatür mikroskoplu gradyan-kırılma indeksi lens kullanılarak, in vivo zeytin nöral somata aktivitesini incelemek için kalsiyum görüntüleme kullanılabilir.

In vivo Fare Kalitesiz Zeytinde Kalsiyum Görüntüleme

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Mevcut protokol, gıda sargısı, şeffaf silikon ve kapak camı kullanarak büyük (6 x 3 mm2) bir kafatası penceresi yapmayı açıklamaktadır. Bu kafatası penceresi, aynı farede in vivo geniş alan ve iki fotonlu kalsiyum görüntüleme deneylerine izin verir.

İn Vivo Büyük Bir Kraniyal Pencere Kullanarak Bir Fareden Geniş Alan ve İki Foton Kalsiyum Görüntüleme

Bu protokol, vahşi tip farelerde korteksi bozulmadan bırakırken iki foton mikroskobu ile tek nöron aktivitesinin görüntülenmesi ve kısmi korteks mutant farelerde geniş alan mikroskobu ile tüm SC'nin görüntülenmesi dahil olmak üzere, uyanık farelerin superior colliculus'unda (SC) kalsiyum yanıtlarını görüntüleme prosedürünü detaylandırır.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Öğrenin fare neokorteksindeki mikrodevre dinamiklerini in vivo 2-foton kalsiyum görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem yoğun nöron popülasyonlarının tek hücre çözünürlüğünde kaydını sağlar.

Katman In Vivo 2-Foton Kalsiyum Görüntüleme Fare 2 / 3

Daha fazla video keşfet