Murin Glomerüler Mezanjiyal Hücrelerin İzolasyonunu ve Saflaştırılmasını Optimize Etmek
March 7th, 2025
Bu çalışma, murin mezanjiyal hücrelerinin (MC'ler) ve bunların ex vivo hücre kültürlerinin izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol geliştirmiştir. Bu hücreler, hücre büyümesinden veya protein ekspresyonundan ödün vermeden birden çok kez pasajlanabilir, dondurulabilir, canlandırılabilir ve kültürlenebilir.
Araştırmalarımızdan biri multipl miyelom ile ilişkili böbrek yetmezliği üzerinedir. Araştırmamızı desteklemek için, murin mezanjiyal hücrelerinin birincil kültürü için protokoller geliştirdik ve şimdi optimize ettik. Prosedürler için gerekli ekipmana kolayca erişilebilir ve prosedür adımları basittir.
Hedef hücrelerin edinilmesi sadece iki ila üç hafta gerektirir. Bu teknik, böbrek araştırmalarını kolaylaştırır ve hastalık modellerinde, terapötik geliştirmede veya sinyal iletim araştırmalarında mezanjiyal hücre fonksiyonunu araştıran çalışmaları destekler. Makas ve cımbız kullanarak, murin mezanjiyal hücrelerinin veya MC'lerin uygun şekilde ötenazi yapılmış hayvandan izolasyonuna başlamak için, böbrekleri fareden aseptik olarak çıkarın ve bir Petri kabına yerleştirin.
Böbrekleri Earle'ün dengeli tuz çözeltisiyle durulayın, ardından bağ dokusunu ve böbrek kapsülünü dikkatlice çıkarmak için cımbız kullanın. Bir neşter kullanarak böbreği dikey olarak ikiye bölün. Petri kabına üç ila dört mililitre kollajenaz I çözeltisi ekleyin ve dokuyu plastik bir hücre tokmağı ile iyice öğütün.
Petri kabındaki tüm dokuyu ve çözeltiyi 15 mililitrelik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Tam doku transferini sağlamak için Petri kabını bir ila iki mililitre kollajenaz I solüsyonu ile durulayın. Tüpü 37 santigrat derecede bir çalkalayıcıya yerleştirin ve 30 dakika boyunca dakikada 120 devirde sallayın.
Ardından, karışıma eşit hacimde bir durdurma çözeltisi veya kültür ortamı ekleyin. Çözeltiyi santrifüj tüpünden pipetleyin ve 100 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin. Süzüntüyü 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.
Süzüntüyü 40 mikronluk bir hücre süzgecinden geçirin ve süzgeç üzerinde sadece hücreleri tutun. Hücre koleksiyonunu en üst düzeye çıkarmak için süzgeci bir kültür ortamı ile tekrar tekrar durulayın. Toplanan hücreleri süzgeçten 50 mililitrelik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
Süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri istenen hücre yoğunluğuna göre bir hücre kültürü kabında yeniden süspanse edin. Bulaşıkları %95 hava ve %5 karbondioksit içeren 37 derecelik bir hücre inkübatöre yerleştirin.
Hücreleri durulamak için kültür kabının iç kenarı boyunca bir ila iki mililitre PBS ekleyin. Tabağın altındaki tüm PBS'yi çıkarmak için bir pipet kullanın, ardından tabağın iç kenarı boyunca 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Hücreler% 80 birleşmeye ulaştığında, genellikle yedi ila 10 gün içinde, hücreleri steril PBS ile iki kez yıkayın.
Hücreleri tripsinize etmek için tabağa% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin. Çanağı 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Çoğu hücre yuvarlak bir morfoloji sergilediğinde ve yüzeyden ayrıldığında, eşit hacimde ikinci ortam ekleyerek tripsinizasyonu sonlandırın.
Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 600 g'da santrifüjleyin, ardından ikinci ortamda yeniden süspanse edin. Bu çalışmada izole edilen MC'ler, önemli ölçüde yüksek alfa-SMA, fibronektin ve vimentin ekspresyonu sergiledi. İkinci ortamda 10 günlük kültürden sonra gerçekleştirilen saflaştırılmış ve kültürlenmiş MC'lerin immünofloresan boyama, hücrelerin %95'inden fazlasının hem alfa-SMA hem de vimentin eksprese ettiğini gösterdi.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, böbrek araştırmaları için kritik öneme sahip olan murin mezangial hücrelerin (MCs) izolasyonu ve kültürü için optimize edilmiş bir protokol geliştirmeye odaklanmaktadır. Yöntem, hücre büyümesi ve protein ekspresyonunu koruyarak birden fazla geçiş, dondurma ve canlandırma sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Araştırma Alanı
- Multipl miyelomla ilgili renal yetmezlik
- Böbrek hastalığı modellerinde mezangial hücre fonksiyonu
- Terapik gelişim ve sinyal iletimi araştırması
Arka Plan
- Mezangial hücrelerin böbrek sağlığındaki önemi
- Bu hücrelerin izolasyonu ve kültüründeki zorluklar
- Güvenilir deneysel protokollere duyulan ihtiyaç
Kullanılan Yöntemler
- Kolagenaz sindirimi içeren izolasyon teknikleri
- Murin model sistemi
- Kontrollü koşullar altında hücre kültürü
Ana Sonuçlar
- Kültürlenen MC'lerde alfa-SMA, fibronektin ve vimentin'in yüksek ekspresyonu
- Başarılı izolasyon ve optimal büyüme koşullarının doğrulanması
- Yöntem, ileri böbrek araştırmaları için güçlü bir araç sağlar
Sonuçlar
- Çalışma, murin MC'leri kültürlemenin etkili bir yolunu göstererek, böbrek araştırmalarına değerli yöntemler katmaktadır.
- Renal patolojilerde mezangial hücrelerin rolüne dair anlayışımızı artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Efficient isolation and purification of murine glomerular mesangial cells (MCs) directly supports early-stage nephrology research and disease modeling. This optimized protocol accelerates access to high-purity MCs, enabling robust target validation and mechanistic studies in renal pathobiology. The approach reduces cycle time and enhances reproducibility, strengthening predictive confidence for downstream therapeutic discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid generation of primary MC cultures for hypothesis-driven interrogation of renal pathways.
- Supports functional validation of disease-relevant targets in glomerular biology.
- Facilitates mechanistic de-risking by providing consistent cellular material for pathway analysis.
- Improves predictive confidence in early-stage renal disease models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity MCs for assay development and compound screening.
- Ensures reproducible cell phenotype with high expression of alpha-SMA and vimentin.
- Enables scalability and batch-to-batch consistency for screening workflows.
- Reduces variability in quantitative readouts for reliable compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro MC models with disease-relevant renal pathologies for translational studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in nephrology pipelines.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on robust cellular data.
- Provides a platform for biomarker exploration in glomerular disease contexts.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol positions MC isolation at the interface of early discovery and preclinical research, enabling seamless progression from target validation to lead identification in renal disease programs.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway clarification in glomerular research.
- Screening: Delivers reproducible, assay-ready MCs for quantitative screening platforms.
- Analytics: Supports measurement of protein expression (alpha-SMA, vimentin) for condition comparison.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical renal models for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for MC isolation across nephrology projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in renal target studies.
- Operational Value: Standardizes MC isolation, enabling reproducibility and scalability in R&D workflows.
- Strategic Value: Accelerates go/no-go decisions and improves capital efficiency in nephrology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of renal disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary cell isolation and aseptic technique.
- Needs access to standard cell culture and analytical instrumentation.
- Demands cross-team standardization for reproducible cell phenotype and protein expression.
- Adaptable to various murine models but may require optimization for other species.
- Dependent on consistent execution of enzymatic digestion and purification steps.
